Questo protocollo fornisce una lesione precisa e controllata chirurgicamente per indurre una traspirazione completa del midollo spinale nei topi con un'elevata riproducibilità e tassi di sopravvivenza molto elevati. L'uso di un trapano fine per la lesione ossea riduce al minimo il danno al tessuto circostante, consentendo di modellare le risposte alle lesioni e al trattamento con maggiore precisione. Per eseguire una laminectomia, dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pedale in un topo femmina C57 nero 6 di otto-10 settimane anestetizzato, radere la pelliccia posteriore per esporre l'area chirurgica sulla colonna vertebrale dorsale e sterilizzare l'area rasata con tamponi di cotone sterili imbevuti di liquido antisettico di povidone iodio e spirito chirurgico.
Utilizzando un bisturi, effettuare un'incisione verticale della linea mediana a livello vertebrale T10 e utilizzare forcep dritte per sollevare la pelle dalla fascia sottostante per facilitare il posizionamento del riavvolgitore. Per esporre le spine delle vertebre T9-T11, utilizzare il bordo smussato del bisturi per fare una piccola incisione della linea mediana nel tessuto sottocutaneo e nella fascia sottostante e utilizzare forcelle sottili non affilate per smussare la dissezione e riflettere la fascia. Per esporre le lamina, utilizzare la punta smussata del bisturi per dividere il tronco dorsale e i muscoli paraspinosi lungo le spine delle vertebre T9-T11 e utilizzare le forcep smussate della punta fine per smussare i muscoli a strati per esporre le laminae delle vertebre.
Usa le stesse pinze per creare piccole tasche intorno ai processi trasversali della vertebra T10 e agganciare le sporgenze delle pinze curve sotto i processi trasversali all'interno delle tasche create per stabilizzare il corpo vertebrale T10. Risciacquare accuratamente le lamina T10 con salina calda e utilizzare tamponi di cotone per pulire delicatamente la superficie ossea, facendo attenzione che non rimangano attacchi muscolari o legamenti lungo la superficie bilaterale. Per rompere le lamina bilateralmente, utilizzare un diametro di 0,55 millimetri, punta della punta del trapano di sette millimetri per tracciare un percorso verticale dallo spazio intervertebrale T9/T10 allo spazio intervertebrale T10/T11 lungo entrambe le lamina T10 con il trapano spento.
Una volta tracciato il percorso, accendere il trapano e fare lentamente e con attenzione una trincea verticale sulla lamina destra della vertebra T10, utilizzando le forcette curve per mantenere stabile la vertebra. Dopo aver ripetuto il processo sul lato sinistro della lamina, irrigare il tessuto con soluzione salina calda per lavare via eventuali frammenti ossei rimanenti. Mantenere una buona presa sulla colonna vertebrale con una mano è essenziale per questo passaggio.
È anche importante diventare comodi e sicuri con l'utilizzo del trapano. Successivamente, utilizzare le pinze angolate a punta fine per afferrare il processo spinoso e rimuovere l'intero segmento dorsale delle lamina separate dalla perforazione bilaterale. Quindi, irrigare e tamponare se necessario per consentire una chiara visualizzazione del midollo spinale all'interno della finestra della laminectomia.
Per indurre la lesione del midollo spinale all'interno del cordone esposto, utilizzare una lama stretta e rotonda tagliente per tagliare il cordone al centro della finestra della laminectomia, facendo attenzione a spazzare i recessi laterale della colonna vertebrale per indurre una lesione completa della transezione. Per confermare la completezza della lesione di trasezione, utilizzare le forcep a punta fine smussata per rimuovere eventuali connessioni rimanenti nel sito di trasezione. Una volta raggiunta l'emostasi nel sito di trasezione, rilasciare la presa del forcep curvo sulla vertebra T10 e riunire i bordi dei muscoli sezionati lungo la linea mediana per ottenere una buona apposizione.
Utilizzando suture assorbibili 5/0 poliglactina 910, suturare i muscoli a strati, assicurandosi che la curvatura naturale della colonna vertebrale non causi alcuna tensione alla linea di sutura o apra le suture. Quindi, utilizzare 5/0 suture di seta non assorbibili per chiudere il tessuto sottocutaneo e la pelle, facendo attenzione che non rimangano sanguinamenti, coaguli o detriti sotto la pelle prima della chiusura. Per valutare se questo metodo per indurre lesioni del midollo spinale di tipo trasezionale nei topi sia riproducibile e coerente, il midollo spinale ferito può essere analizzato mediante immunoistochimica e possono essere eseguiti test comportamentali sui topi.
L'immuno-etichettatura contro il marcatore di astrociti, proteina acida fibrillare gliale, facilita la demarcazione del confine del midollo spinale intatto. In questa sezione longitudinale, il sito di lesione situato può essere visualizzato tra i ceppi del cavo come previsto. Un difetto di dimensione costante può essere indotto nel sito di trasezione con una distanza minima media di 550,4, più o meno 17,3 micrometri.
I dati comportamentali che distribuiscono la scala del topo basso di un test a campo aperto mostrano che i topi feriti non mostrano alcun movimento degli arti posteriori dopo la lesione. Pertanto, il protocollo produce una lesione completa e affidabile del tipo di trasezione che si traduce in una completa perdita di funzione al di sotto del livello di lesione che non porta all'inversione spontanea della paralisi. Fai attenzione a praticare in linea retta con una mano stabile, perché può essere molto difficile riparare la finestra della laminectomia una volta che è stata forata in modo errato.
Dopo l'induzione della lesione del midollo spinale, possono essere applicate varie opzioni di trattamento, tra cui la somministrazione di farmaci e il trapianto di cellule per identificare potenziali terapie che migliorano il recupero delle lesioni del midollo spinale.
