Name: real-time quaking-induced conversion assay for detection of cwd prions in fecal material
Uploaded: 2017-09-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material at JoVE.com

Nós estamos gratos ao Dr. Byron Caughey (NIH Rocky Mountain Laboratories) para fornecer a formação e o plasmídeo de expressão bacteriana do PrP de cervídeos provenientes. SG é suportado pelo programa da cadeira de pesquisa do Canadá. Reconhecemos que o financiamento para esta pesquisa para SG do Genome Canadá, príon Alberta Research Institute e Alberta agricultura e silvicultura através do genoma Alberta e a Universidade de Calgary para apoiar este trabalho. Reconhecemos uma bolsa de pesquisa da Margaret Gunn Foundation para a pesquisa Animal.

1. RT-QuIC usando Material Fecal <ol><li>preparação de cervídeos provenientes de fezes de extratos <ol><li>Make homogenate fecal pela adição de 1 g de material fecal para 10 mL de fezes Extraia buffer (fosfato de sódio de 20 mM, pH 7.1, 130 mM de NaCl, 0,05% Tween 20, 1 mM PMSF e 1x completam os inibidores de protease, EDTA-free) para dar uma concentração final de 10% (p/v). O buffer de homogeneização pode ser preparado antes da utilização e armazenado a -20 ° C.</li>
		<li>Homogenize pelotas fecais (1g) e buffer (10 mL) em tubos (por exemplo, tubos de gentleMACS M) usando um dissociador com um programa pré-estabelecido do fabricante para proteínas para 1 min à temperatura ambiente. Repita este passo de duas a três vezes, até as amostras fecais são completamente homogeneizadas no buffer.</li>
		<li>Selar os tubos com parafilm e coloque-os em um agitador de plataforma ou giratório balanço para uma incubação de 1h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugar os tubos a 18.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Coletar os sobrenadantes que contêm a proteína extrai e alíquota-los em 1,5 mL tubos. Alíquotas podem ser armazenadas a-80 ° C para mais aplicativos.</li>
	</ol></li> <li>Concentração de PrP Sc nas fezes extrai Nota: a fim de concentrar os príons CWD nas amostras de fezes de extrato, melhorando assim a sensibilidade de detecção por RT-QuIC, é adicionado a um passo de precipitação de proteínas para o protocolo.
	<ol><li>Método de precipitação NaPTA</li> <li>Adicionar 250 µ l de 10% (p/v) de N-Lauril sarcosinate (sarkosyl) a 1 mL de proteína fecal Extraia-o para dar uma concentração final de sarkosyl de 2% (v/v).</li>
		<li>Selar os tubos que contêm as amostras com parafilm e incubam a 37 ° C por 30 min sob agitação constante a 1.400 rpm em um thermomixer.</li>
		<li>Ajustar a mistura de extrato de proteína fecal e sarkosyl com uma solução contendo 10% (p/v) de ácido fosfotúngstico de sódio e 170 mM de cloreto de magnésio, pH 7,4 para obter uma concentração final de 0,3% (p/v) o ácido fosfotúngstico de sódio nas amostras.</li>
		<li>Incubar as amostras a 37 ° C por 2 h com agitação constante a 400 rpm.</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 14 ° C por 30 min em 15.800 x g. remover os sobrenadantes cuidadosamente.</li>
		<li>Lavar as pelotas por resuspending-los em tampão de lavagem (10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 100 mM de NaCl, 0,5% Triton-X100, EDTA 10 mM, 0,5% de sódio Deoxycholate do (w/v) e 0.1% sarkosyl (w/v)).</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 14 ° C por 15 min em 15.800 x g. remover os sobrenadantes cuidadosamente.</li>
		<li>Resuspenda as pelotas em 100 µ l (1/10 do volume original da proteína fecal extrair) de tampão de diluição QuIC-RT. 
		Nota: RT-QuIC tampão de diluição (fosfato de sódio de 20 mM, pH 6,9, 130 mM NaCl, SDS 0,1% (p/v) e 1 X N2 suplemento) é preparado antes da utilização. Um volume total de 10 mL é filtrado através de um filtro de seringa 0,2 µm acrodisc usando uma seringa e em seguida, armazenado a-20 ° C até o uso.</li>
		<li>Armazenar as amostras de NaPTA Tratado a-20 º C até utilizá-las no ensaio de RT-QuIC.</li>
	</ol></li> <li>RT-QuIC ensaio <ol><li>Prepare uma solução stock de 10mm fresco Th-T (0,032 g de Th-T em 10 mL de água destilada dobro H 2 O).</li>
		<li>Fazer uma diluição de 01:10 da solução estoque em dobro destilada H 2 O para fazer uma concentração final de Th-T de 1 mM o filtro através de uma seringa de acrodisc 0,2 µm filtro usando uma seringa Th-T.</li>
		<li>Descongelar o rato recombinante PrP (rPrP, aa 23-231) substrato (10 µ g/mL por reação de RT-QuIC) armazenado a -80 ° C no Ice.</li>
		<li>Carga 500 µ l de substrato rPrP cada vez em 100 kDa tamanho microtubos de filtro de exclusão e centrifugação a 14.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente (um tubo/filtro pode ser usado até duas vezes).</li>
		<li>Transferir o substrato eluted em um tubo estéril de 1,5 mL e mantê-lo em 4 ° C até o uso.</li>
		<li>Tampão de diluição descongelar RT-QuIC armazenado a -20 ° C.</li>
		Tampão de diluição de <li>fazer diluições das sementes (extracto de proteína fecal) QuIC-RT: 
		Amostra não diluída: use o extrato de proteína fecal sem diluir diluído a 2 x 10 -1 diluído a 2 x 10 -2 diluído a 2 x 10 -3</li> <li>preparar soluções estoque para RT-QuIC mistura reacional: tampão fosfato salino ( PBS): 5 X NaCl: solução de NaCl preparada em água destilada dobro H 2 O. o estoque 2 M 
		100 mM de EDTA: solução de EDTA preparado em dobro destilada H 2 O.</li>
		<li>Antes da utilização de todas as soluções (etapa 1.3.8), filtrar cada solução separadamente através de um filtro de seringa 0,2 µm acrodisc usando uma seringa e mantê-los estéril à temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparar um volume total da mistura de reação RT-QuIC de acordo com o número de amostras (98 volume µ l de reação por amostra e quatro repetições por amostra) a ser usado, acrescido de 10% desse volume, para ter certeza de ter bastante mistura para todas as reações.
		<ol><li>Uso um tubo de 15 mL para preparar a mistura de reação QuIC-RT (fosfato de sódio de 20 mM, pH 6,9, 300 mM de NaCl, 1 mM EDTA, 10 µM Th-T, substrato de rPrP 10 µ g/mL e água bidestilada para ajustar a concentração final rPrP na reação) usando o sol estoque utions.</li>
			<li>Misture todas as soluções bem pipetando subindo e descendo com uma pipeta com uma ponta do filtro. Evitar, tanto quanto possível, o uso de vórtice.</li>
			<li>Despeje a mistura em um reservatório de pipetagem descartáveis de 50 mL.</li>
			<li>Usar uma pipeta multicanal para carregar 98 µ l da mistura de reação RT-QuIC em cada poço de uma placa de 96 poços óptica inferior.</li>
		</ol></li> <li>Adicionar para cada RT-QuIC µ l de reação 2 de não diluído ou extrato de proteína fecal serialmente diluída 10 vezes. Teste cada amostra em quatro repetições. 
		Nota: Em cada experimento, diluições em série de amostras fecais (variando de não diluído a 2 x 10 -3) de CWD-negativo e verificadas CWD-positivo de animais são usadas como controles positivos e negativos, respectivamente.</li>
		<li>a placa com uma fita de vedação do selo antes da incubação em um leitor de placas a 42 ° C para 25 h com ciclos repetidos de 1min dupla orbital tremendo (700 rpm) e 1 min descansando durante a incubação.</li>
		Definir configurações de medição de fluorescência de <li>: 
		Excitação: 450 nm emissão: 480 nm ler, de fundo número de flashes: 20 ganho Manual: 1000 (dependendo da máquina) tempo de integração: 20 µs</li> <li>retirar a placa do leitor de placa no final da 25 h.</li>
		<li>Spin para baixo a placa a 3.000 x g por 3 min evitar a potencial contaminação entre os poços.</li>
		<li>Remover o selo da placa de.</li>
		<li>Prepare uma nova placa de 96 poços, acrescentando 90 µ l da mistura de reação RT-QuIC contendo substrato fresco e fresca fluorescência tingir Th-T conforme descrito na seção 1.3.1 a 1.3.6.</li>
		<li>Placa de transferência 10 µ l de cada poço da placa de primeira para o 96 recém preparado bem.</li>
		<li>a nova placa do selo e continuar o ensaio QuIC-RT para adicional h 50 seguindo os passos descritos na etapa 1.3.13. Esta etapa adicional de 50 h vai fazer o tempo de reação total de 75 h. 
		Nota: Todos os procedimentos de ensaio de RT-QuIC são feitos sob o armário de biossegurança.</li>
		<li>Coleta de dados.
		<ol><li>Leitura e documento do sinal de fluorescência do Th-T de cada poço a cada 15 min.</li>
			<li>Coletar dados dos ciclos totais usando software de análise de dados e a transferência para uma planilha com a média de reações quadruplicate.</li>
			<li>Plotar as médias dos dados. O eixo x corresponde ao tempo de reação de RT-QuIC (h) e o eixo y corresponde as unidades de fluorescência relativo (RFU). Cada curva corresponde a uma diluição de uma amostra conhecida.</li>
			<li>Em cada experimento, demarcar um limite, calculando-se os valores médios mais elevados do controlo negativo, mais 5 desvios-padrão, conforme descrito na atual publicado literatura 41. 
			NOTA: Todas as réplicas que cruzaram o limiar definido são consideradas positivas. Se pelo menos duas das quatro repetições cruzar o limiar, a amostra é então considerada positiva.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 2. Purificação da proteína príon de recombinante (rPrP) <ol><li>crescimento de estoque bacteriana e expressão de rPrP Nota: A Escherichia coli (e. coli) COE Rosetta (DE3) transformada com o vetor de pET-24 codificação a mouse PrP (resíduos 23-231) foi usado para preparar o rPrP.
	<ol><li>Descongelar o estoque de glicerol de Rosetta (DE3) transformada com animal de estimação-24 mPrP(23-231) na Ice.</li>
		<li>Raia LB (Luria Bertani) placas com uma concentração final de canamicina de 50 µ g/mL e incuba durante uma noite em uma incubadora de 37 ° C. Certifique-se que as placas são de cabeça para baixo para evitar a condensação de umidade na mídia sólida contendo as bactérias. Prepare duas placas para certificar-se de ter crescimento em pelo menos uma das duas placas.</li>
		<li>Preparar 1 L de LB e autoclave para torná-lo estéril.</li>
		<li>Suplemento 1 L de estéril LB mídia com 1 mL de canamicina (50 mg/mL) e 1 mL de cloranfenicol (34 mg/mL).</li>
		<li>Escolher uma colônia de cada placa, usando um loop de inoculação descartável para inocular 3 mL de meio LB contendo canamicina e cloranfenicol.</li>
		<li>Lugar da miniculturas em uma incubadora a 37 ° C, com agitação constante a 225 rpm para 5-6 h.</li>
		<li>Adicionar as miniculturas para o resto do original 1 l de LB mídia juntamente com Express 1 de sistema Autoinduction para indução da expressão da proteína.</li>
		<li>Lugar da cultura no frasco de 2 L, ou maior, em uma incubadora a 37 ° C, com agitação constante a 200 rpm por 20-24 h.</li>
		<li>Dividir a cultura de 1L em tubos de centrífuga de 4 x 250 mL.</li>
		<li>Spin para baixo os tubos contendo a cultura a 3.750 x g por 20 min em temperatura ambiente.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e coletar as pelotas bacterianas em tubos de centrífuga de 50 mL e, em seguida, congelá-los a-80 ° C até o processamento adicional. As pelotas resultantes pesar 3 a 4 g para um rendimento de proteína boa.</li>
	</ol></li> <li>Preparação do corpo de inclusão <ol><li>descongelar a pelota congelada (3 a 4 g) a 37 ° C por alguns minutos.</li>
		<li>Congelar a pelota, mais uma vez para 10 min a-80 ° C e descongelar novamente. Repita essa etapa de congelamento e degelo mais duas vezes.</li>
		<li>Resuspenda o pellet bacteriano em 1 X reagente de lise (por exemplo, BugBuster Master Mix) pipetando completamente. Use 5 mL do reagente para 1G de pelota bacteriana. Certifique-se de homogeneizar completamente o mix.</li>
		<li>Incubar o homogeneizado em um balancim por 20 min em temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugar o homogenate a 16.000 x g por 20 min em temperatura ambiente.</li>
		<li>Descartar os sobrenadantes derramando cuidadosamente la fora</li>
		<li>Homogeneizar as pelotas do mesmo volume de reagente de Lise como usado na etapa anterior de 1x.</li>
		<li>Incubar o homogeneizado por 15 min em uma cadeira de balanço em temperatura ambiente.</li>
		<li>Adicionar um volume suficiente de 01:10 (0.1 x) reagente de Lise para obter um volume total homogeneizado de 40 mL. Misture por inversão para certifique-se de homogeneizar bem.</li>
		<li>Centrifugar o homogenate a 7.900 x g, durante 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Descartar o sobrenadante derramando cuidadosamente la</li>
		<li>Resuspenda o pellet em 40 mL de 0.1 x reagente de Lise.</li>
		<li>Centrifugar o homogenate a 16.000 x g, durante 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante cuidadosamente por coloca-lo e armazenar a pelota contendo os corpos de inclusão a-20 º C até posterior processamento.</li>
	</ol></li> <li>Purificação da proteína <ol><li>descongelar os corpos de inclusão à temperatura ambiente.</li>
		<li>Dissolver os corpos de inclusão descongelados em 14 mL de 8m guanidina-HCl (cloridrato de guanidina g 38 em 0.1 M NaPO 4 pH 8.0 e o preenchimento da suspensão com H 2 O a 50 mL; não ajustar o pH a solução final) para solubilizar proteínas.</li>
		<li>Certifique-se de homogeneizar bem pipetando para cima e para baixo.</li>
		<li>Incubar o lisado sobre um roqueiro à temperatura de 50 min.</li>
		<li>Preparar 18 g de resina Ni-NTA grânulos (18 g para pellet bacteriana de 3 a 4 g); enxaguá-los com 100 mL de água usando a vácuo e um filtro garrafa-top 100 mL 0,22 µm.
		<ol><li>Coloque a 18 g de grânulos de resina Ni-NTA em tubo de 50 mL e adicionar um volume suficiente de desnaturação buffer (100 mM de fosfato de sódio, 10 mM Tris, pH 8.0, 6m cloridrato de guanidina, pH 8) para fazer o volume final de 50 mL.</li>
			<li>Equilibrar as contas no buffer de desnaturação por 50 min em uma cadeira de balanço em temperatura ambiente.</li>
		</ol></li> <li>Centrifugar o corpo de inclusão lisado a 16.000 x g por 5 min remover os resíduos insolúveis.</li>
		<li>Adicionar o sobrenadante para os grânulos equilibrados e descartar as pelotas.</li>
		<li>Colocar a mistura sobre um roqueiro para 40 min à temperatura ambiente para permitir a ligação às proteínas a resina Ni-NTA. 
		Nota: Grânulos de Quelato de níquel são usados para purificar o PrP por sua afinidade de níquel. A região N-terminal de histidina-rica de PrP processa a afinidade para nickel(II), que permite que a proteína ligar ao níquel íons sem qualquer marca de sua-.</li>
		<li>FPLC de lavagem com água para limpar para fora as duas linhas (A e B).</li>
		<li>Executar o buffer de desnaturação (100 mM de fosfato de sódio, 10 mM Tris, pH 8.0, 6m cloridrato de guanidina, pH 8) através de ambas as linhas (A e B) para aprontar o sistema (a coluna ainda não está ligada.)</li>
		<li>Carregar a resina na coluna. Certifique-se de minimizar as bolhas de ar.</li>
		<li>Unir a coluna para o FPLC e executar um gradiente linear de 100% desnaturação de tampão A e 0% de redobramento buffer B (fosfato de sódio de 100 mM, 10 mM Tris, pH 8.0) em primeiro lugar para 0%, tampão de desnaturação e 100% dobrar tampão até o final. Esta mudança gradual é executada em uma taxa de fluxo de 0,75 mL/min para 240 min e é necessária para a adequada de dobramento de PrP. 
		Nota: Durante o processo de purificação cromatográfica, o PrP desnaturado é primeiro lentamente novamente sobre a resina através da aplicação de um gradiente linear de redobramento reserva para substituir o buffer de desnaturação. Esta etapa também remove o guanidina-HCl caotrópicas.</li>
		<li>Certifique-se de buffer de redobramento 100% continua a fluir através da coluna para um adicional 30 min em 0,75 mL/min.</li>
		<li>Lavagem linha A com água, seguida de tampão de eluição (100 mM de fosfato de sódio, 10 mM Tris, imidazol 500 mM, pH 5,8) ignorando a coluna. Isto irá limpar o buffer de desnaturação, que foi substituído agora pelo tampão de eluição no sistema AKTA.</li>
		<li>Proteína Elute em 2 mL/min, executando um gradiente linear de 40 min de 100% reenovelamento buffer B e tampão de eluição de 0% A primeiro para 0% dobrar buffer e tampão de eluição de 100%. 
		Nota: A alta concentração de imidazol em tampão de eluição competirão PrP &#39; ligação de s para o nickel(II). O pico principal proteína deve começar a eluir cerca de 1/3 do caminho através do gradiente.
		<ol><li>Assistir o cromatograma para OD 280 nm aumentar a.</li>
		</ol></li> <li>Coletar apenas os tubos que contêm a proteína no centro do grande pico. 
		Nota: As frações eluted de 2 mL cada são coletadas em tubos de 15 mL.</li>
		<li>Diluir a proteína contida nos tubos imediatamente com volume de aproximadamente 1/3 (1ml) do buffer de diálise (fosfato de sódio de 10 mM, pH 5,8).</li>
		<li>Imediatamente, coloque os tubos no Ice.</li>
		<li>Piscina a proteína eluted contida nos tubos.</li>
		<li>Pobre a proteína em diálise Cassettes (peso molecular de corte 10 kDa).</li>
		<li>Colocar as fitas no buffer de diálise pre-refrigerados (3,6 L) por 2 h a 4 ° C e, em seguida, transferir as fitas em um buffer de diálise fresco (3,6 L) para a noite. Fazer Se o buffer de diálise está sob constante agitação.</li>
		<li>Filtrar proteína após diálise através de um filtro de seringa 0,2 µm acrodisc utilizando uma seringa.</li>
		<li>Medir a concentração de proteína usando um kit de ensaio de proteína BCA.</li>
		<li>Concentrado ou diluir se necessário para ajustar a concentração de proteína para 0,3 mg/mL. 
		Nota: Confirmar a pureza por SDS-PAGE e coloração de azul de Coomassie.</li>
		<li>Fazer alíquotas de 1 mL de proteína em tubos microcentrifuga e imediatamente armazenar a-80 ° C até nova utilização, conforme descrito no protocolo de RT-QuIC.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

RT-QuIC anteriormente foi empregado para detectar os príons CWD em urina e fezes extractos de infectados oralmente cariacu e veado-mula 38. O sistema mostrado neste manuscrito é um método adaptado do ensaio QuIC-RT. Etapas adicionais foram incorporadas o ensaio de RT-QuIC "clássico" para melhorar a detecção e a sensibilidade do ensaio para príons CWD em material fecal de animais infectados.
A baixa sensibilidade da deteção em extractos de fezes nos levou para o aprimoramento do protocolo de RT-QuIC. Para alcançar sensível em vitro deteção dos priões nas fezes, passos críticos foram adicionados para a preparação da amostra para remover componentes que interferem com a conversão de príon e/ou propagação e aumentar a sensibilidade da deteção. Incorporando a substituição de substrato no protocolo de RT-QuIC e tratamento de NaPTA/sarkosyl foi fundamental para detecção de atividade de propagação em alces de infectados CWD pré-clínicos e clínicos e para reforçar os limites de deteção de conversão do prião em extractos de fezes .
Precipitação de NaPTA é uma técnica comum, geralmente acompanhada de extração de sarkosyl para isolar e concentrar o PrPSc a um nível detectável. NaPTA é conhecido para precipitar de preferência PrPSc / PrPC 43 , enquanto sarkosyl é um detergente conhecido para facilitar a conversão de prião em baixas concentrações em um sistema livre de células 44. Em alinhamento com isso, usando uma combinação de NaPTA e sarkosyl pode gerar um maior rendimento de agregados fibrillar em vitro como mostrado antes 45,46,47. Esta metodologia foi incorporada anteriormente RT-QuIC ensaio para detectar periféricos príons CWD com êxito na amostra, tais como saliva purificada 39 e sangue total 40. Nosso estudo fornece a primeira evidência que incorporar NaPTA/sarkosyl purificação no protocolo da preparação da amostra fecal permite a detecção de príons CWD por RT-QuIC. Além disso, com esta metodologia fomos capazes de reduzir a conversão espontânea de substrato rPrP em negativo CWD homogenates fecal no ensaio de RT-QuIC.
Um mecanismo potencial tem sido proposto para explicar o efeito da substituição de substrato 30. Nas primeiras rodadas de reação (antes da adição do substrato fresco), apenas uma pequena quantidade de sementes é adicionada à RT-QuIC reações. Enquanto apenas uma parte do rPrP é incorporada as reações semeadas, o resto do substrato também pode ser usado acima interagindo com as paredes de poços de placa de reação para agregados de forma não-amiloide, ou ser alterado de uma forma que é menos propensa a ser convertido pela Sé RT-QuIC DED produtos em vez das sementes originais. Como resultado, a taxa de incorporação de rPrP às sementes é lenta, e a formação de fibrila não é detectável na fase lag. Como os produtos de RT-QuIC semeados cultivados na fase lag finalmente são alongados para chegar a uma fase de"montagem rápida", príons podem ser rapidamente amplificada por segmentação através de agitação ou lateral adição de agregados menores. Nesta fase, o substrato fresco adicionado para a reação é prontamente incorporado a produtos semeados, ao invés de formando agregados inespecíficos. A incorporação da etapa de substituição de substrato em nosso protocolo foi uma modificação que o aumento da sensibilidade; foi útil detectar as sementes do prião em amostras com uma quantidade muito baixa de PrPSc de animais pré-clínicos e/ou contendo compostos inibitórios.
Usando RT-QuIC ensaio ao invés de PMCA, que é a primeira em vitro proteína enrolamento ensaio de amplificação descritos 21, tem várias vantagens. Em PMCA os tubos são incubados e lisados num banho de água contido o sonicador; os tubos posicionados na periferia do sonicador mostram menos eficácia de amplificação em comparação com os tubos posicionados no centro 48. O sistema RT-QuIC tremer parece ser mais fácil de controlar. O uso de um formato bem 96 é uma vantagem real de RT-QuIC, no entanto, o PMCA mb-desenvolvido por Moudjo et al . 49 , 50, mostrou benefícios similares, mas ainda é menos usado em PMCA.
Como substrato, RT-QuIC usa rPrP recombinante para conversão; em contraste, o PMCA na maioria dos casos usa homogenate cerebral normal. Além disso, em RT-QuIC nenhuma homologia de sequência é necessária entre Sementes e substrato 51–53.
A presença de cofactores é necessária para a replicação de prião em PMCA e o produto resultante é contagiante. No entanto, no ensaio de RT-QuIC, o PrP amplificado não é infecciosa. Em ensaios de amplificação em vitro a ocorrência de reações falso-positivas mais provavelmente por causa de conversão espontânea de PrPC é um problema recorrente. Portanto, o ensaio e condições utilizadas neste estudo foram adaptadas para minimizar essas perturbações para maximizar a diferença entre semeado rPrP-conversão e conversão espontânea.
Em conclusão, tratamento de NaPTA/sarkosyl permite a remoção de inibidores de ensaio nas fezes e reduz a conversão espontânea. Curiosamente, o tratamento não dificultar a semeadura atividade de precipitatedPrPSc. Além disso, a sensibilidade da deteção foi significativamente melhorada quando a substituição do substrato concomitantemente foi adoptada.

Doenças do prião ou encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET) são doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Creutzfeldt - Jakob (CJD) em humanos, a encefalopatia espongiforme bovina (EEB) em bovinos, tremor epizoótico dos ovinos e caprinos e desperdiçando crônica doença (CWD) em cervídeos 1,2. EET caracterizam-se pela aparência distintiva espongiforme e perda de neurônios do cérebro. De acordo com a hipótese de "proteína apenas", príons são principalmente compostos de PrPSc ('Sc' para o tremor epizoótico) 3, uma isoforma misfolded da proteína príon celular codificado anfitrião, PrPC. PrPSc resulta da conversão de PrPC em uma conformação enriquecida em ᵦ-folhas 4,5,6 , que pode atuar como uma semente para vincular e converter outras moléculas de PrPC . As moléculas de PrPSc recém-gerado são incorporadas em um crescente polímero 7,,8 que invade oligômeros menores, resultando em maior número de núcleos infecciosos. PrPSc é propenso a agregação e é parcialmente resistente às proteases 9,10.
CWD afeta alces selvagens e de criação (Cervus canadensis), veado (Odocoileus hemionus), cariacu (WTD; Odocoileus virginianus), alce (Alces alces) e Rena (Rangifer tarandus tarandus) 11,12,13. É considerada a mais contagiosa doença de Creutzfeld-Jacob com transmissão horizontal favorecido por cervídeos provenientes interações e persistência ambiental de infecciosidade 14,15. Ao contrário de outras doenças de príon onde PrPSc acumulação e infecciosidade estão confinados ao cérebro, em CWD estas também são encontradas em tecidos periféricos e fluidos corporais, por exemplo, saliva, urina e fezes 16,17, 18.
Imuno-histoquímica é considerada o padrão-ouro para o diagnóstico CWD detectar a distribuição de PrPSc e espongiforme lesões 19,20. ELISA e em casos mais raros, borrão ocidental também são usados para diagnóstico CWD. Assim, o atual diagnóstico de doença de príon é baseado principalmente na detecção de príons em tecidos post-mortem. Diagnóstico ante mortem por CWD está disponível por tirar as amígdalas ou biópsias de tecido linfoide associado a mucosa reto-anal (RAMALT); no entanto, este procedimento é invasivo e requer a captura dos animais. Assim, o uso de amostras facilmente acessíveis, tais como urina e fezes, seria uma maneira prática para a deteção de príons CWD. No entanto, esses harbor excreções relativamente baixa concentrações dos priões abaixo do limite de detecção dos métodos de diagnóstico atuais. Por conseguinte, uma ferramenta diagnóstica mais sensível e alta taxa de transferência é necessária. Em vitro sistemas de conversão, tais como proteína enrolamento amplificação cíclica do ensaio (PMCA) 21, amiloide semeadura do ensaio e conversão de tremor induzido em tempo real (RT-QuIC) ensaio 22,23, 24 são ferramentas muito poderosas para explorar a capacidade auto-propagação de PrPSc de imitar em vitro o processo de conversão de príon e, assim, ampliar a presença de quantidades minuciosas de PrPSc para níveis detectáveis 25 ,26. O método de RT-QuIC, no entanto, tira proveito do fato de que o produto de conversão enriquecido em estrutura secundária de β-folha especificamente pode ligar thioflavin T (Th-T). Portanto, o PrP recombinante (rPrP) mediante conversão semeado cresce em amiloides que ligam Th-T e, portanto, podem ser detectados em tempo real através da medição de fluorescência do Th-T expressada em unidades de fluorescência relativo (RFU) ao longo do tempo. Uma vez controlada, a RFU pode ser usada para avaliar atividades de semeadura relativas e parâmetros quantitativos como a fase de retardo. A fase de retardo representa o tempo necessário para atingir o limiar, durante a qual rPrP conversão a fase inicial da reação é abaixo do limite de detecção de fluorescência Th-T (h). O fim da fase de aparente defasagem, concomitante à formação de um núcleo de amiloide suficiente (nucleação/alongamento), ocorre quando a fluorescência de Th-T excede o nível de limiar e torna-se positivo. O crescimento das fibrilas podem ser detectadas em tempo real e a inicial do PrPSc ou semeadura atividade contida na amostra de amiloide é amplificado por segmentação que gera mais sementes. Estas sementes, por sua vez induzem uma rápida fase exponencial de crescimento de fibra amiloide.
Porque este ensaio é capaz de detectar tão baixo quanto 1 fg de PrPSc 24, a alta sensibilidade qualifica esta técnica para conseguir ante mortem ou diagnóstico não-invasivo, detectando PrPSc em vários tecidos periféricos, excreções ou outros tipos de amostra, abrigando os baixos níveis de infecciosidade. RT-QuIC definitivamente fornece vantagens sobre outros ensaios para sua reprodutibilidade, praticidade, rapidez (menos de 50 h) e baixos custos em comparação com os bioensaios. Evita as complexidades técnicas tais como sonication usado em PMCA; Além disso, ela é realizada em uma microplaca de fita-selado que minimiza o risco de contaminação de aerossol de cada poço. O formato multi bem permite a análise de até 96 amostras no mesmo experimento. Para combater o problema recorrente de falsos positivos e conversão espontânea de rPrP nos ensaios de conversão em vitro , a implementação de um limiar (cut-off) em RT-QuIC é muito útil. De fato, baseado nos resultados do controlo negativo (RFU média de amostras negativas + 5 SD 27), uma linha de base é configurada do qual seja possível discriminação entre amostras positivas e negativas. O uso de quatro repetições para cada amostra, portanto, pode ajudar a definir uma amostra como positivo quando pelo menos 50% de repetições a mostrar um sinal positivo, ou seja, cruzar o disco de corte 28. A homologia entre Sementes e substrato não é necessária no RT-QuIC, como por exemplo, em um estudo anterior, hamster rPrP foi encontrado ser um substrato mais sensível em relação ao substrato homólogas em humanos PrPvCJD semeado e tremor epizoótico ovelhas semeado reações 29. hamster-ovelha quimérico rPrP sugeriu-se também para ser um substrato mais adequado do que rPrP humano para detectar CJD variante humana priões 30. Assim, o uso de substratos rPrP de diferentes espécies é muito comum neste ensaio. Este ensaio tem sido aplicado com êxito a várias doenças de príon, como esporádicos DCJ 31,32,33, gendoenças de príon ETIC 34, BSE 35,36,37, 23,de tremor epizoótico36e CWD 38,39,40,41, 42. Estudos utilizando processados líquor, sangue, saliva e urina como sementes em RT-QuIC foram todos bem sucedidas para detectar PrPSc 38,39,40,41, 42. para fomentar a capacidade de deteção em amostras de plasma de sangue que podem conter inibidores da formação de amiloide, Orrú et al. (2011) desenvolveu uma estratégia para remover potenciais inibidores da formação de amiloide penteando PrPSc passo de imunoprecipitação (IP) e RT-QuIC, chamado "reforçada QuIC" ensaio (eQuIC). Além disso, uma etapa de substituição do substrato foi empregada após ~ 24 h de tempo de reação a fim de melhorar a sensibilidade. Em última análise, como baixa como 1 ag de PrPSc era detectável por eQuIC 30.
Fim de extratos de fezes de purificar e remover inibidores possível ensaio nas fezes, amostras fecais coletadas em estágios pré-clínicos e clínicos de elk após infecção oral experimental foram homogeneizadas em tampão contendo detergentes e inibidores de protease. Os extratos de fezes mais foram submetidos a diferentes metodologias para concentrar o PrPSc nas amostras utilizando a precipitação de proteínas através da precipitação do sódio fosfotúngstico ácida (NaPTA). O método de precipitação de NaPTA, primeiramente descrito por Safar e col 43, é usado para concentrar o PrPSc em amostras do teste. A incubação de NaPTA com a amostra resulta em precipitação preferencial do PrPSc ao invés de PrPC. No entanto, o mecanismo molecular é ainda incerto. Esta etapa também ajudou a contendo e impedindo a conversão espontânea de rPrP, que é observado em alguns casos. Finalmente, os extratos de fezes foram testados por otimizado RT-QuIC usando rPrP rato (aa 23-231) como substrato e incluindo substituição de substrato no protocolo para melhorar a sensibilidade da deteção.
Aqui os resultados demonstram que este método melhorado pode detectar concentrações muito baixas de príons CWD e aumenta a sensibilidade de detecção e especificidade em amostras fecais em comparação com um protocolo sem substituição de precipitação e substrato de NaPTA. Potencialmente, este método pode ser aplicado a outros tecidos e fluidos corporais e pode ser de grande utilidade para vigilância CWD em cervídeos, selvagens e em cativeiro.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc seringe filters</td><td>PALL</td><td>4652</td><td></td></tr><tr><td>amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit</td><td>Millipore</td><td>UCF901024</td><td></td></tr><tr><td>BD 10 ml seringe</td><td>VWR</td><td>CA75846-842</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Corning bottle-top vacuum filters</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431118</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS M Tube</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Guanidine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) broth</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12780029</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15502048</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ML9150</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K</td><td>PALL</td><td>OD100C34</td><td></td></tr><tr><td>Nunc sealing tapes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>232702</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor tablet</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Calbiochem</td><td>7910-OP</td><td></td></tr><tr><td>sodium phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>496626</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin T</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Triton-100</td><td>Calbiochem</td><td>9410-OP</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Commercial buffers and solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BugBuster Master Mix</td><td>Nogagen</td><td>71456-4</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow</td><td>Qiagen</td><td>1018401</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X)</td><td>Life Technoligies</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Distilled Water</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Standards and commercial kits&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Express Autoinduction System 1</td><td>Novagen</td><td>71300-4</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment setup&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA protein purification systems FPLC</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman Avanti J-25 Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman rotor JA-25.50</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman rotor JA-10</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega microplate reader</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sofware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MARS Data Analysis</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism6</td><td>GraphPad software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

real-time quaking-induced conversion assay for detection of cwd prions in fecal material

A técnica de RT-QuIC é um sensível em vitro príon celular livre amplificação ensaio baseado principalmente no semeado enrolamento e agregação de substrato de proteína (PrP) recombinante do prião usando sementes de príon como um modelo para a conversão. RT-QuIC é uma nova técnica de alta produtividade, que é análoga à reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR). Deteção de crescimento de amiloide fibrila baseia-se o corante Thioflavin T, que fluoresce a mediante interação específica com proteínas ricas ᵦ-folha. Assim, a formação de amiloide pode ser detectada em tempo real. Procurou-se desenvolver um teste de rastreio não-invasiva confiável para detectar os príons de doença (CWD) desperdiçando crônica no extrato fecal. Aqui, nós adaptamos especificamente a técnica de RT-QuIC revelará o PrPSc semeadura atividade nas fezes de CWD infectado cervídeos. Inicialmente, a atividade de propagação dos extratos fecais que estamos preparados foi relativamente baixa em RT-QuIC, possivelmente devido a potenciais inibidores de ensaio no material fecal. Para melhorar a atividade de preparação de extratos de fezes e remover potenciais inibidores de ensaio, nós homogeneizado as amostras fecais em um buffer que contém detergentes e inibidores de protease. Também apresentámos as amostras de diferentes metodologias para concentrar o PrPSc com base na precipitação de proteínas usando ácido fosfotúngstico de sódio e força centrífuga. Finalmente, os extratos de fezes foram testados por otimizado RT-QuIC que incluiu a substituição de substrato no protocolo para melhorar a sensibilidade da deteção. Assim, estabelecemos um protocolo para a deteção sensível de príons CWD semeadura atividade nas fezes de cervídeos pré-clínicos e clínicos por RT-QuIC, que pode ser uma ferramenta prática para o diagnóstico não-invasivo de CWD.

Os extratos fecais CWD preparados em 10% (p/v) foram capazes de reação de RT-QuIC de sementes, ainda a sensibilidade da deteção era baixa 27. Usar uma reserva específica para homogeneização fecal foi um passo fundamental para evitar a fluorescência de fundo elevado em RT-QuIC reações concomitantes ao uso de substrato de rato rPrP ao invés de veado rPrP que permitiu para obter mais específico resulta 27. A adição de NaPTA precipitação reduzida a conversão espontânea de rPrP em RT-QuIC (Figura 1) sem inibir a amplificação da atividade semeadura das reações (Figura 2). Embora tenha sido observada amplificação melhor tratamento de NaPTA, sinais de fluorescência resultante de amostras fecais positivas CWD foram ainda baixo (Figura 1). Além disso, a amplificação do prião de algumas amostras alcançado um platô constante a níveis baixos de fluorescência. Isto indica a saturação das reacções, que pode ser devido a degradação/desnaturação de rPrP ou a formação de agregados de fora-caminho que consomem o rPrP piscina 30. Para além disso, melhorar a amplificação dos priões e aumentar a sensibilidade da deteção, uma etapa de substituição do substrato foi incorporada o protocolo. A introdução de substituição de substrato para o protocolo de RT-QuIC (Figura 2) aumentou a sensibilidade (77%; 14 de 18 amostras em RT-QuIC foram positivas) e especificidade (100%; nenhum dos controles negativos em positivo virou QuIC-RT) da deteção (ver 1 tabela de Cheng et al . 27). finalmente, todos estes passos (Figura 3) levaram para a otimização de um protocolo confiável e sensível para a deteção RT-QuIC de príons CWD, usando a amostra contendo baixos níveis de infecciosidade.
Substituição de substrato foi introduzida após o primeiro 25 h de reação de RT-QuIC, pela reação de reabastecimento tampão contendo substrato fresco e fresca fluorescência tingir Th-T. Introduzindo-se a etapa de substituição do substrato no protocolo, o tempo de reação de RT-QuIC foi ampliado de 50 h para 75 h. Como mostrado na Figura 2 , com a incorporação de substituição do substrato, observou-se uma melhoria significativa da amplificação do prião.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56373/56373fig1.jpg"> 
Figura 1: reduzida conversão espontânea de substrato de rPrP rato em RT-QuIC semeado com purificada CWD-negativo fecal homogenate. Homogenates fecais de alces não infectados (C181-006) ou veado-mula foram homogeneizadas em tampão de extrato de fezes para obter uma concentração final de 10% (p/v). Para a purificação, estes homogenates fecais foram processados e 10 vezes concentradas pela precipitação de NaPTA. Os impuro fecais homogenates (um), formas de NaPTA-purificado e concentradas (b) diluídas conforme indicado foram usados para propagar quadruplicate RT-QuIC reações com rPrP de rato como substrato. Os y-Axes mostram unidades relativas de fluorescência Th-T, que os x-axes retratam o tempo de reação. Uma redução de conversões espontâneas foi vista em amostras fecais NaPTA-purificado (b). Dados utilizados de Cheng et al . 27. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56373/56373fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56373/56373fig2.jpg"> 
Figura 2. Melhor detecção de príons CWD nas fezes usando substituição de substrato. Homogenates fecais de alces individuais (C051-05, C052-05) infectados por via oral com príons CWD foram purificados e concentrou-se por precipitação de NaPTA. Tratados com NaPTA amostras foram diluídas entre 2 x 10-1 a 2 x 10-3 usado para reações de RT-QuIC quadruplicate semente com substrato rPrP de rato. O ensaio de RT-QuIC foi realizado sem substituição de substrato (um) em um período regular de 50 h ou com a incorporação de substituição de substrato para um período de incubação prolongado de 75 h (b). Para este último, substituição de substrato foi introduzida após o primeiro 25 h de reação QuIC-RT. Noventa por cento do volume reação foi removido e substituído por uma mistura de reação RT-QuIC preparada contendo substrato rPrP e Th-T. Introduzindo-se a etapa de substituição do substrato no protocolo, o tempo de reação de RT-QuIC foi prorrogado de 50 h-75 h. dados utilizados de Cheng et al . 27. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56373/56373fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56373/56373fig3.jpg"> 
Figura 3: diagrama de fluxo descrevendo PrPSc fecal extração de cervídeos CWD-infectados e propagação de atividade e do prião amplificação usando RT-QuIC ensaio. Amostras fecais de animais infectados CWD são homogeneizadas em um buffer de extração fecal, submetidas ao método de precipitação de NaPTA e testadas pelo ensaio de RT-QuIC. O último foi realizado através da introdução de uma etapa de substituição do substrato. A incorporação de NaPTA e substrato passos de substituição resultou em uma redução de conversão espontânea e forte melhoria na semeadura amplificação de atividade e príon. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56373/56373fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Aqui, apresentamos um protocolo para descrever uma técnica de amplificação de prião simples, rápido e eficiente, o método de conversão de tremor induzido em tempo real (RT-QuIC).

Em tempo real a tremer induzida por conversão ensaio para detecção de príons CWD em Material Fecal

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

real-time-quaking-induced-conversion-assay-for-detection-cwd-prions

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.6K visualizações.  University of Calgary. Aqui, apresentamos um protocolo para descrever uma técnica de amplificação de prião simples, rápido e eficiente, o método de conversão de tremor induzido em tempo real (RT-QuIC).

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Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such as Chronic Wasting Disease (CWD) of cervids and scrapie in sheep. The Prion hypothesis asserts that this abnormal conformer constitutes most or all of the infectious prion. The role of the immune system in early events in peripheral prion pathogenesis has been convincingly demonstrated for CWD and scrapie 1-3. Transgenic and pharmacologic studies in mice revealed an important role of the Complement system in retaining and replicating prions early after infection 4-6. In vitro and in vivo studies have also observed prion retention by dendritic cells 7-10, although their role in trafficking remains unclear 11-16. Macrophages have similarly been implicated in early prion pathogenesis, but these studies have focused on events occurring weeks after infection 3,11,17. These prior studies also suffer from the problem of differentiating between endogenous PrPC and infectious prions. Here we describe a semiquantitative, unbiased approach for assessing prion uptake and trafficking from the inoculation site by immune cells recruited there. Aggregated prion rods were purified from infected brain homogenate by detergent solubilization of non-aggregated proteins and ultracentrifugation through a sucrose cushion. Polyacrylamide gel electrophoresis, coomassie blue staining and western blotting confirmed recovery of highly enriched prion rods in the pelleted fraction. Prion rods were fluorochrome-labeled then injected intraperitoneally into mice. Two hours later immune cells from peritoneal lavage fluid, spleen and mediastinal and mesenteric lymph nodes were assayed for prion rod retention and cell subsets identified by multicolor flow cytometry using markers for monocytes, neutrophils, dendritic cells, macrophages and B and T cells. This assay allows for the first time direct monitoring of immune cells acquiring and trafficking prions in vivo within hours after infection. This assay also clearly differentiates infectious, aggregated prions from PrPC normally expressed on host cells, which can be difficult and lead to data interpretation problems in other assay systems. This protocol can be adapted to other inoculation routes (oral, intravenous, intranervous and subcutaneous, e.g.) and antigens (conjugated beads, bacterial, viral and parasitic pathogens and proteins, egg) as well.

Here we describe a novel assay for monitoring prion uptake and trafficking by immune cells immediately following intraperitoneal inoculation by purifying and fluorescently labeling aggregated prion rods from infected brain material then monitoring their uptake and movement from the injection site and characterizing the cells mediating these events.

Monitoramento células imunes Tráfico Rods Horas Prion fluorescente após a infecção intraperitoneal

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such ...

Imunologia e Infecção

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Prions are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein has two distinct isoforms, the non-infectious host-encoded protein (PrPC) and the infectious protein (PrPSc), an abnormally-folded isoform of PrPC 8.
One of the challenges of working with prion agents is the long incubation period prior to the development of clinical signs following host inoculation13. This traditionally mandated long and expensive animal bioassay studies. Furthermore, the biochemical and biophysical properties of PrPSc are poorly characterized due to their unusual conformation and aggregation states.
PrPSc can seed the conversion of PrPC to PrPSc in vitro14. PMCA is an in vitro technique that takes advantage of this ability using sonication and incubation cycles to produce large amounts of PrPSc, at an accelerated rate, from a system containing excess amounts of PrPC and minute amounts of the PrPSc seed19. This technique has proven to effectively recapitulate the species and strain specificity of PrPSc conversion from PrPC, to emulate prion strain interference, and to amplify very low levels of PrPSc from infected tissues, fluids, and environmental samples6,7,16,23 .
This paper details the PMCA protocol, including recommendations for minimizing contamination, generating consistent results, and quantifying those results. We also discuss several PMCA applications, including generation and characterization of infectious prion strains, prion strain interference, and the detection of prions in the environment.

Protein misfolding cyclic amplification (PMCA) is an in vitro assay for the study of prion conversion and strain and species barriers. It can also be used as a prion detection assay.

Proteína amplificação cíclica misfolding de príons

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

Procedimentos para identificar Infecciosas príons após a passagem através do sistema digestivo de uma espécie de aves

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

Avaliando Encefalopatia Espongiforme Transmissível Espécies Barreiras com uma<em&gt; In Vitro</em&gt; Prion Conversão Protein Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

Medicina

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in research laboratories, as well as for molecular diagnosis, because of its sensitivity, specificity, and convenience. However, in most cases, the quantitative PCR (qPCR) assay generally used to detect virus infection has relied on the purification of viral nucleic acid prior to the PCR step. In this study, the fluorescence-based reverse transcription qPCR (RT-qPCR) assay is developed through the combination of a processing buffer and a one-step RT-PCR reagent so that the whole process, from the harvest of the culture supernatant of virus-infected cells until real-time detection, can be performed without viral RNA purification. The established protocol enables the quantification of a wide range of RNA concentrations of dengue virus (DENV) within 90 min. In addition, the adaptability of the direct RT-qPCR assay to the evaluation of an antiviral agent is demonstrated by an in vitro experiment using a previously reported DENV inhibitor, mycophenolic acid (MPA). Moreover, other RNA viruses, including yellow fever virus (YFV), Chikungunya virus (CHIKV), and measles virus (MeV), can be quantified by direct RT-qPCR with the same protocol. Therefore, the direct RT-qPCR assay described in this report is useful for monitoring RNA virus replication in a simple and rapid manner, which will be further developed into a promising platform for a high-throughput screening study and clinical diagnosis.

Real-time quantitative polymerase chain reaction analysis combined with reverse transcription (RT-qPCR) has been widely used to measure the level of RNA virus infections. Here we present a direct RT-qPCR assay, which does not require an RNA purification step, developed for the quantification of several RNA viruses, including dengue virus.

Dengue vírus RNA no sobrenadante de cultura de células infectadas por reação em cadeia da polimerase em tempo real de quantitativos de medição

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

Quantitation of Rabies Virus in Various Bovine Brain Structures

Bovine paralytic rabies (BPR) is a form of viral encephalitis that is of substantial economic importance throughout Latin America, where it poses a major zoonotic risk. Here, our objective was to utilize a laboratory protocol to determine the relative copy number of the rabies virus (RABV) genome in different bovine brain anatomical structures using quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). qRT-PCR quantifies the specific number of gene copies present in a sample based on fluorescence emitted after amplification that is directly proportional to the amount of target nucleic acid present in the sample. This method is advantageous owing to its short duration, reduced risk of contamination, and potential to detect viral nucleic acids in different samples more easily compared to other techniques. The brains of six rabid animals were divided into six anatomical structures, namely the Ammon&#8217;s horn, cerebellum, cortex, medulla, pons, and thalamus. All brains were identified as positive for RABV antigens based on a direct immunofluorescence test. The same anatomical structures from the brains of four RABV-negative bovines were also assessed. RNA was extracted from each structure and used for qRT-PCR. An assay was performed to determine the copy numbers of RABV genes using an in vitro transcribed nucleoprotein gene. The standard curve used to quantify viral RNA exhibited an efficiency of 100% and linearity of 0.99. Analysis revealed that the cortex, medulla, and thalamus were the ideal CNS portions for use in RABV detection, based on the observation that these structures possessed the highest levels of RABV. The test specificity was 100%. All samples were positive, no false positives were detected. This method can be used to detect RABV in samples that contain low levels of RABV during diagnosis of BPR.

This protocol presents a qRT-PCR-based approach for determining the rabies virus nucleoprotein (N) gene copy number within various bovine brain anatomical structures using in vitro transcription.

Quantitação do vírus da raiva em várias estruturas cerebrais bovinas

Bovine paralytic rabies (BPR) is a form of viral encephalitis that is of substantial economic importance throughout Latin America, where it poses a major ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR é um método sensível e rápido para detecção de DNA por citomegalovírus em formalina-fixo, tecido da biópsia de parafina-embedded

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Biologia

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

Desenvolvimento de um Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Ensaio com um controlo positivo interno

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

Prion Safety Laboratory Swipe Test

Transmission of iatrogenic prion disease has occurred from contaminated neurosurgical tools, transplant materials, and occupational exposure to prion-contaminated laboratory tools. Prions cause disease by the templated misfolding of the normal cellular form of the prion protein, PrPC, into the misfolded and pathogenic form PrPSc and are invariably fatal. Reducing iatrogenic and occupational prion transmission is challenging. First, prions can bind to and persist on surfaces for long periods of time. Second, prions are highly resistant to inactivation. Given this, surfaces can retain infectivity for long periods of time following ineffective decontamination. Not only can this pose a potential occupational risk for prion laboratory workers, but it could potentially cross-contaminate laboratory experiments utilizing sensitive prion amplification techniques. The protocol described here for a prion safety laboratory swipe test includes steps for the identification and documentation of high-traffic laboratory areas, recommended swabbing controls to ensure the validity of results, steps to identify proper responses to positive surface swabbing sites, representative results from prion swipe testing, as well as potential artifactual results. Overall, the prion safety laboratory swipe test can be implemented as part of a broader prion safety program to assess decontamination of surfaces, monitor common spaces for prion contamination, and implement the documentation of prion decontamination status.

A method to assess commonly used areas in laboratory settings for prion contamination and effective decontamination is lacking. The protocol described here provides key fundamentals for implementing a laboratory prion safety swipe test that can easily be modified to meet the individual needs of specific laboratories.

Teste de furto do laboratório de segurança de príons

Transmission of iatrogenic prion disease has occurred from contaminated neurosurgical tools, transplant materials, and occupational exposure to ...

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). These neurodegenerative diseases affect humans and several animal species and include scrapie, zoonotic bovine spongiform encephalopathy (BSE), chronic wasting disease of cervids (CWD), and the newly identified camel prion disease (CPD). Diagnosis of TSEs relies on immunodetection of PrPSc by application of both immunohistochemistry (IHC) and western immunoblot methods (WB) on encephalon tissues, namely, the brainstem (obex level). IHC is a widely used method that uses&#160;primary antibodies (monoclonal or polyclonal) against antigens of interest in cells of a tissue section. The antibody-antigen binding can be visualized by a color reaction that remains localized in the area of the tissue or cell where the antibody was targeted. As such, in prion diseases, as in other fields of research, the immunohistochemistry techniques are not solely used for diagnostic purposes but also in pathogenesis studies. Such studies involve detecting the PrPSc patterns and types from those previously described to identify the new prion strains. As BSE can infect humans, it is recommended that biosafety laboratory level-3 (BSL-3) facilities and/or practices are used to handle cattle, small ruminants, and cervid samples included in the TSE surveillance. Additionally, containment and prion-dedicated equipment are recommended, whenever possible, to limit contamination. The PrPSc IHC procedure consists of a formic acid epitope-demasking step also acting as a prion inactivation measure, as formalin-fixed and paraffin-embedded tissues used in this technique remain infectious. When interpreting the results, care must be taken to distinguish non-specific immunolabeling from target labeling. For this purpose, it is important to recognize artifacts of immunolabeling obtained in known TSE-negative control animals to differentiate those from specific PrPSc immunolabeling types, which can vary between TSE strains, host species, and prnp genotype, further described herein.

Immunolabeling abnormal prion protein using immunohistochemistry protocols requires specific sample and anti-PrP antibody preparation methodologies. The present protocol describes the key steps in epitope demasking to ensure proper PrP immunolabeling and to minimize non-specific background staining. Also, this approach considers biosafety measures when conducting immunohistochemistry studies with the prion-infected tissues.

Em tempo real a tremer induzida por conversão ensaio para detecção de príons CWD em Material Fecal

Resumo

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