Siamo grati al Dr. Byron Caughey (NIH Rocky Mountain Laboratories) per fornire formazione ed il plasmide di espressione batterica PrP cervide. SG è supportato dal programma Canada Research Chair. Riconosciamo che il finanziamento per la ricerca a SG di Genome Canada, Prion Alberta Research Institute, Alberta agricoltura e silvicoltura attraverso Genome Alberta e l'Università di Calgary a sostegno di questo lavoro. Riconosciamo un assegno di ricerca dalla Margaret Gunn Foundation for Animal Research.

1. RT-QuIC utilizzando il materiale fecale <ol><li>preparazione di cervide feci estratti <ol><li>Make omogeneato fecale con l'aggiunta di 1 g di materiale fecale a 10 mL di feci estrarre buffer (20 mM sodio fosfato, pH 7.1, 130 mM NaCl, 0.05% Tween 20, 1 mM PMSF e 1 x completare inibitori della proteasi, privo di EDTA) per ottenere una concentrazione finale di 10% (p/v). Il buffer di omogeneizzazione possa essere preparato prima dell'utilizzazione e conservato a -20 ° C.</li>
		<li>Omogenizzazione pellet fecali (1 g) e buffer (10 mL) in tubi (ad es., gentleMACS M tubi) utilizzando un dissociatore con un programma preimpostato dal produttore per le proteine per 1 min a temperatura ambiente. Ripetere questo passaggio due o tre volte fino a quando i campioni di feci sono completamente omogeneizzati nel buffer.</li>
		<li>Guarnizione le provette con parafilm e metterli su un agitatore a dondolo piattaforma o rotativo per un 1 ore di incubazione a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugare le provette a 18.000 x g per 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Raccogliere i surnatanti che contengono la proteina estrae e aliquota in 1,5 mL provette. Le aliquote possono essere conservate a-80 ° C per ulteriori applicazioni.</li>
	</ol></li> <li>Concentrazione di PrP Sc nelle feci estrae Nota: al fine di concentrare i prioni CWD dei campioni di feci Estratto, migliorando così la sensibilità di rilevazione di RT-QuIC, viene aggiunto un passaggio di precipitazione della proteina per il protocollo.
	<ol><li>Metodo di precipitazione NaPTA</li> <li>Estratto di aggiungere 250 µ l di 10% (p/v) di N-lauryl sarcosinate (sarkosyl) a 1 mL di proteina fecale per ottenere una concentrazione finale di sarkosyl del 2% (v/v).</li>
		<li>Guarnizione dei tubi che contengono i campioni con parafilm e incubare a 37 ° C per 30 min sotto agitazione costante a 1.400 giri/min in un thermomixer.</li>
		<li>Regolare il mix di estratto proteico fecale e sarkosyl con una soluzione contenente 10% (p/v) di acido fosfotungstico sodio e 170 mM di cloruro di magnesio, pH 7.4 per ottenere una concentrazione finale di 0.3% (p/v) sodio acido fosfotungstico nei campioni.</li>
		<li>Incubare i campioni a 37 ° C per 2 h con agitazione costante a 400 giri/min.</li>
		<li>Centrifugare i campioni a 14 ° C per 30 min a 15.800 x g. rimuovere con attenzione i sovranatante.</li>
		<li>Lavare il pellet da loro ematico nel tampone di lavaggio (10 mM Tris-Cl, pH 7.5, NaCl 100 mM, 0,5% Triton-X100, 10mm EDTA, 0,5% sodio desossicolato (w/v) e 0,1% sarkosyl (w/v)).</li>
		<li>Centrifugare i campioni a 14 ° C per 15 min a 15.800 x g. rimuovere con attenzione i sovranatante.</li>
		<li>Risospendere il pellet in 100 µ l (1/10 del volume originale della proteina fecale estrarre) di tampone di diluizione RT-QuIC. 
		Nota: RT-QuIC tampone di diluizione (fosfato di sodio di 20 mM, pH 6.9, 130 mM NaCl, 0.1% SDS (w/v) e 1 X N2 supplemento) è preparato prima dell'utilizzazione. Un volume totale di 10 mL è filtrato attraverso un filtro da 0,2 µm acrodisc siringa usando una siringa e poi conservato a-20 ° C fino all'utilizzo.</li>
		<li>Conservare i campioni di NaPTA trattato a-20 ° C fino al loro utilizzo nell'analisi di RT-QuIC.</li>
	</ol></li> <li>Analisi di RT-QuIC <ol><li>preparare una soluzione stock (0,032 g di Th-T in 10 mL di doppia distillata H 2 O) di fresco 10 mM Th-T.</li>
		<li>Fare una diluizione di 01:10 della soluzione di riserva in doppia distillata H 2 O per effettuare una concentrazione finale di Th-T di 1 mM il filtro attraverso una siringa di acrodisc 0,2 µm filtrare utilizzando una siringa Th-T.</li>
		<li>Disgelo del mouse ricombinante PrP (rPrP, aa 23-231) substrato (10 µ g/mL per reazione di RT-QuIC) conservato a -80 ° C il ghiaccio.</li>
		<li>Carico 500 µ l di substrato di rPrP in un momento in 100 kDa dimensione esclusione filtro microprovette e centrifugare a 14.000 x g per 5 min a temperatura ambiente (un tubo/filtro può essere utilizzato fino a due volte).</li>
		<li>Trasferire il substrato eluito in una provetta sterile 1,5 mL e tenerlo a 4 ° C fino all'utilizzo.</li>
		<li>Tampone di diluizione scongelare RT-QuIC conservati a -20 ° C.</li>
		Tampone di diluizione <li>make diluizioni del seme (estratto proteico fecale) in RT-QuIC: 
		Campione non diluito: utilizzare l'Estratto di proteine fecale non diluito diluito 2 x 10 -1 diluito 2 x 10 -2 diluito 2 x 10 -3</li> <li>preparare soluzioni di riserva per RT-QuIC miscela di reazione: tampone fosfato salino ( PBS): 5 X NaCl: 2 M stock soluzione di NaCl preparato in doppio distillata H 2 O. 
		100 mM EDTA: soluzione di EDTA preparato in doppia distillata H 2 O.</li>
		<li>Prima dell'utilizzo di tutte le soluzioni (punto 1.3.8), filtrare separatamente per ogni soluzione 0,2 µm acrodisc siringa filtro utilizzando una siringa e tenerli sterile a temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparare un volume totale di RT-QuIC miscela di reazione in base al numero di campioni (98 µ l di volume di reazione per campione e quattro replica per campione) da utilizzarsi più 10% di questo volume per assicurarsi di avere abbastanza miscela per tutte le reazioni.
		<ol><li>Uso un tubo da 15 mL per preparare la miscela di reazione RT-QuIC (fosfato di sodio di 20 mM, pH 6,9, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 µM Th-T, 10 µ g/mL rPrP substrato e doppia acqua distillata per regolare la concentrazione finale di rPrP nella reazione) utilizzando il sol d'archivio utions.</li>
			<li>Mescolare tutte le soluzioni ben pipettando su e giù per mezzo di una pipetta con una punta di filtro. Evitare quanto più possibile l'uso di vortice.</li>
			<li>Versare il composto in un flacone di pipettaggio monouso 50ml.</li>
			<li>Utilizzare una pipetta multicanale per caricare 98 µ l di miscela di reazione di RT-QuIC in ciascun pozzetto di una piastra 96 pozzetti ottico inferiore.</li>
		</ol></li> <li>Aggiungere a ogni RT-QuIC reazione 2 µ l di non diluito o estratto proteico fecale in serie diluito 10 volte. Ogni campione di prova in quattro repliche. 
		Nota: In ogni esperimento, diluizioni seriali di campioni di feci (che vanno da non diluito a 2 x 10 -3) da CWD-negativo e verificato CWD-positivi gli animali vengono utilizzati come controlli positivi e negativi, rispettivamente.</li>
		<li>Sigillare la piastra con un nastro sigillante prima incubazione in un lettore di piastra a 42 ° C per 25 h con ripetuti cicli di 1 min doppia orbitale agitazione (700 giri/min) e 1 min di riposo durante l'incubazione.</li>
		<li>Impostazioni di misura di fluorescenza Definisci: 
		Eccitazione: 450 nm emissione: 480 nm leggere, basso numero di lampeggi: 20 manuale del guadagno: 1000 (dipende dalla macchina) tempo d'integrazione: 20 µs</li> <li>togliere la piastra dal lettore della piastra all'estremità del h. 25</li>
		<li>Rotazione verso il basso la piastra a 3.000 x g per 3 min evitare possibili contaminazioni tra i pozzetti.</li>
		<li>Rimuovere il sigillo dalla piastra.</li>
		<li>Preparare una nuova piastra a 96 pozzetti aggiungendo 90 µ l di RT-QuIC miscela di reazione contenente substrato fresco e fresco fluorescenza tingere Th-T, come descritto nella sezione 1.3.1 a 1.3.6.</li>
		<li>Trasferire 10 µ l da ciascun pozzetto della piastra prima per il 96 appena preparato ben piatto.</li>
		<li>La nuova piastra di tenuta e continuare l'analisi di RT-QuIC per ulteriori 50 h seguendo la procedura descritta nel passaggio 1.3.13. Questo ulteriore passo di h 50 farà il tempo di reazione totale di h. 75 
		Nota: Tutte le procedure di analisi di RT-QuIC vengono eseguite nell'ambito di biosicurezza.</li>
		<li>Raccogliere i dati.
		<ol><li>Lettura e documento il segnale di fluorescenza Th-T di ciascun pozzetto ogni 15 min.</li>
			<li>Raccogliere i dati dei cicli totale utilizzando software di analisi dei dati e trasferimento in un foglio di calcolo con la media delle reazioni quadruplicate.</li>
			<li>Plot le medie dei dati. L'asse x corrisponde al tempo di reazione di RT-QuIC (h) e l'asse y corrisponde alle unità relativa fluorescenza (RFU). Ogni curva corrisponde ad una diluizione di un campione noto.</li>
			<li>In ogni esperimento, delimitano una soglia di calcolare i valori medi più alti del controllo negativo plus 5 deviazioni standard come descritto nella corrente pubblicato letteratura 41. 
			NOTA: Tutte le repliche che ha attraversato la soglia vengono considerate positive. Se almeno due su quattro repliche varcare la soglia, il campione viene quindi considerato positivo.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 2. Purificazione della proteina prionica ricombinante (rPrP) <ol><li>crescita dello stock batterici ed espressione di rPrP Nota: Escherichia coli (Escherichia coli) ceppo Rosetta (DE3) trasformata con vettore animale-24 codifica il mouse PrP (residui 23-231) è stato utilizzato per preparare il rPrP.
	<ol><li>Scongelare Stock in glicerolo di Rosetta (DE3) trasformato con animali-24 mPrP(23-231) su ghiaccio.</li>
		<li>Striscia LB (Luria Bertani) piastre con una concentrazione finale di kanamicina 50 µ g/ml e incubare per una notte in un incubatore a 37 ° C. Assicurarsi che le piastre sono capovolte per evitare la condensazione di umidità in terreni solidi contenenti i batteri. Preparare due piastre per assicurarsi di avere crescita in almeno una delle due piastre.</li>
		<li>Preparare 1 L di LB e autoclave per renderlo sterile.</li>
		<li>Supplemento 1 L di terreno sterile LB con 1 mL di kanamicina (50 mg/mL) e 1 mL di cloramfenicolo (34 mg/mL).</li>
		<li>Prendere una colonia di ciascuna piastra tramite un ciclo di inoculazione monouso per inoculare 3 mL di terreno LB contenente kanamicina e cloramfenicolo.</li>
		<li>Posto il mini-culture in un incubatore a 37 ° C con agitazione costante a 225 giri/min per 5-6 h.</li>
		<li>Aggiungere il mini-culture al resto dell'originale l 1 del LB media insieme con Express autoinduzione sistema 1 per l'induzione dell'espressione della proteina.</li>
		<li>Luogo la cultura in pallone da 2 L, o superiore, in un incubatore a 37 ° C con agitazione costante a 200 rpm per 20-24 h.</li>
		<li>Dividere la cultura 1L in provette da centrifuga 4 x 250 mL.</li>
		<li>Rotazione verso il basso le provette contenenti la cultura a 3.750 x g per 20 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Scartare il surnatante e raccogliere il pellet batterico in provette da centrifuga 50ml, poi congelarli a-80 ° C fino a ulteriore elaborazione. Il pellet risultante hanno pesato 3 a 4 g per una resa buona proteina.</li>
	</ol></li> <li>Preparazione del corpo di inclusione <ol><li>scongelare il pellet congelato (3-4 g) a 37 ° C per pochi minuti.</li>
		<li>Congelare il pellet ancora una volta per 10 min a-80 ° C e scongelare nuovamente. Ripetere questo passaggio di congelamento e scongelamento altre due volte.</li>
		<li>Risospendere il pellet batterico in 1 X reagente di lisi (ad es. BugBuster Master Mix) pipettando accuratamente. Uso 5 mL del reattivo per 1 g di pellet batterica. Assicurarsi di omogeneizzare completamente il mix.</li>
		<li>Incubare l'omogenato su un agitatore meccanico per 20 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugare l'omogeneizzato a 16.000 x g per 20 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Scartare i surnatanti versando attentamente off.</li>
		<li>Omogeneizzare le palline nello stesso volume di reagente di lisi come utilizzato nel passaggio precedente: 1x.</li>
		<li>Incubare l'omogeneizzato per 15 minuti su un agitatore meccanico a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aggiungere un volume sufficiente di 01:10 (0,1 x) reagente di lisi per ottenere un volume totale di omogenato di 40 mL. Mix di inversione per assicurarsi omogeneizzare bene.</li>
		<li>Centrifugare l'omogeneizzato a 7.900 x g per 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Scartare il surnatante versando attentamente esso.</li>
		<li>Risospendere il pellet in 40 mL di 0,1 x reagente di lisi.</li>
		<li>Centrifugare l'omogeneizzato a 16.000 x g per 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Scartare il surnatante attentamente versandolo e memorizzare il pellet contenente i corpi di inclusione a-20 ° C fino a ulteriore elaborazione.</li>
	</ol></li> <li>Purificazione della proteina <ol><li>scongelare i corpi di inclusione a temperatura ambiente.</li>
		<li>Sciogliere i corpi di inclusione scongelati in 14 mL di 8m guanidina-HCl (cloridrato della guanidina 38g in 0.1 M NaPO 4 pH 8.0 e riempimento la sospensione con H 2 O a 50 mL; non regolate il pH alla soluzione finale) per solubilizzare le proteine.</li>
		<li>Assicurarsi omogeneizzare bene pipettando su e giù.</li>
		<li>Incubare il lisato su un agitatore meccanico a temperatura ambiente per 50 min.</li>
		<li>Preparare 18 g di resina Ni-NTA Perline (18 g per 3-4 g di pellet batterica); risciacquarli con 100 mL di acqua utilizzando vuoto e un filtro superiore 100 mL 0,22 µm bottiglia.
		<ol><li>Mettere il 18 g di perle di resina Ni-NTA nel tubo da 50 mL e aggiungere un volume sufficiente di denaturare buffer (100 mM fosfato di sodio, 10 mM Tris, pH 8.0, 6m guanidina, pH 8) per rendere il volume finale fino a 50 mL.</li>
			<li>Equilibrare le perline nel buffer denaturante per 50 minuti su un agitatore meccanico a temperatura ambiente.</li>
		</ol></li> <li>Centrifugare il corpo di inclusione lisato a 16.000 x g per 5 min rimuovere i residui insolubili.</li>
		<li>Aggiungere il supernatante ai branelli equilibrati e scartare i pellet.</li>
		<li>Mettere il mix su un rocker per 40 min a temperatura ambiente per consentire il legame con le proteine alla resina Ni-NTA. 
		Nota: Perline chelati di nichel sono utilizzati per purificare PrP da sua affinità di nichel. La regione N-terminale di istidina-ricca di PrP rende l'affinità al nickel, che la proteina permette di associare a nichel ioni senza qualsiasi his-tag.</li>
		<li>FPLC lavare con acqua per pulire entrambe le linee (A e B).</li>
		<li>Eseguire buffer denaturante (100mm fosfato di sodio, 10 millimetri Tris, pH 8.0, 6m guanidina, pH 8) tramite entrambe le linee (A e B) per innescare il sistema (la colonna è non ancora associata).</li>
		<li>Caricare la resina sulla colonna. Fare in modo di ridurre al minimo le bolle d'aria.</li>
		<li>Fissare la colonna per il FPLC ed eseguire una sfumatura lineare da 100% denaturare tampone A e 0% di refolding tampone B (fosfato di sodio di 100 mM, 10 mM Tris, pH 8.0) in un primo momento a 0% denaturing buffer e ripiegamento buffer alla fine al 100%. Questo graduale spostamento viene eseguito ad una portata di 0,75 mL/min per 240 min ed è necessaria per il corretto ripiegamento della PrP. 
		Nota: Durante il processo di purificazione cromatografica, il PrP denaturato è prima lentamente riavvolgerlo sulla resina applicando una sfumatura lineare di refolding tampone per sostituire il buffer denaturante. Questo passaggio rimuove anche il caotropici guanidina-HCl.</li>
		<li>Assicurarsi che il buffer di refolding 100% continua a fluire attraverso la colonna per altri 30 min a 0,75 mL/min.</li>
		Linea <li>risciacquo con acqua seguita da tampone di eluizione (100 mM sodio fosfato 10 mM Tris, imidazolo 500 mM, pH 5,8) bypassando la colonna. Questo modo si pulirà il buffer denaturante che è stato sostituito ora dal buffer di eluizione nel sistema AKTA.</li>
		<li>Elute proteina a 2 mL/min eseguendo una sfumatura lineare per 40 min da 100% ripiegamento buffer B e 0% tampone di eluizione A in un primo momento a 0% ripiegamento buffer e buffer di eluizione del 100%. 
		Nota: L'alta concentrazione di imidazolo in tampone di eluizione gareggeranno PrP &#39; associazione di s per il nickel. Il picco di proteina primaria dovrebbe iniziare per eluire circa 1/3 del modo attraverso il gradiente.
		<ol><li>Guarda il cromatogramma per OD 280 nm ad aumentare.</li>
		</ol></li> <li>Raccogliere solo le provette contenenti la proteina al centro del grande picco. 
		Nota: Le frazioni eluite di 2 mL ciascuno vengono raccolti in provette da 15 mL.</li>
		<li>Diluire la proteina contenuta nei tubi immediatamente con circa 1/3 del volume (1 mL) di tampone di dialisi (fosfato di sodio di 10 mM, pH 5,8).</li>
		<li>Posizionare immediatamente i tubi sul ghiaccio.</li>
		<li>La proteina eluita contenuta nei tubi della piscina.</li>
		<li>Povero la proteina nelle cassette di dialisi (peso molecolare cut-off 10 kDa).</li>
		<li>Mettere le cassette nel buffer di pre-refrigerati dialisi (3,6 L) per 2 ore a 4 ° C, quindi trasferire le cassette in un buffer di dialisi fresca (3,6 L) per una notte. Fare sicuri che il buffer di dialisi è sotto costante agitazione.</li>
		<li>Filtro proteina dopo dialisi attraverso un filtro da 0,2 µm acrodisc siringa usando una siringa.</li>
		<li>Misurare la concentrazione di proteine utilizzando un kit di analisi della proteina BCA.</li>
		<li>Concentrato o diluire se necessario regolare la concentrazione di proteina a 0,3 mg/mL. 
		Nota: Confermare purezza da SDS-PAGE e macchiatura blu di Coomassie.</li>
		<li>Rendere le aliquote di 1 mL di proteina in provette per microcentrifuga e immediatamente conservare a-80 ° C fino al successivo utilizzo, come descritto nel protocollo RT-QuIC.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

RT-QuIC precedentemente è stata impiegata per rilevare i prioni CWD in urina ed estratti fecali di oralmente infetti cervi bianco - muniti e cervo mulo 38. Il sistema illustrato in questo manoscritto è un metodo adattato del dosaggio RT-QuIC. Passaggi aggiuntivi furono incorporati nell'analisi di RT-QuIC "classica" per migliorare la rilevazione e la sensibilità del dosaggio per i prioni CWD nel materiale fecale degli animali infetti.
La bassa sensibilità di rilevazione in feci estratti ci ha portato al miglioramento del protocollo RT-QuIC. Per ottenere sensibili in vitro rilevamento dei prioni nelle feci, passaggi critici sono stati aggiunti per la preparazione del campione al fine di rimuovere i componenti che interferiscono con conversione prione e/o propagazione e migliorano la sensibilità di rilevazione. Incorporando la sostituzione del substrato nel protocollo di RT-QuIC e trattamento NaPTA/sarkosyl era critica per la rilevazione di attività di semina a elk CWD-infettati pre-clinici e clinici e per migliorare i limiti di rilevazione di conversione prione in estratti di feci .
NaPTA precipitazione è una tecnica comune di solito accompagnata da sarkosyl estrazione per isolare e concentrare PrPSc a un livello rilevabile. NaPTA è noto per precipitare preferibilmente PrPSc sopra PrPC 43 mentre sarkosyl è un detergente noto per facilitare la conversione di prione a basse concentrazioni in una cella libera sistema 44. In linea con questo, utilizzando una combinazione di NaPTA e sarkosyl potrebbe generare un rendimento più elevato di aggregati fibrillari in vitro come mostrato prima 45,46,47. Questa metodologia è stata incorporata in precedenza in RT-QuIC test per rilevare i prioni CWD periferici con successo nell'esemplare come saliva purificata 39 e sangue intero 40. Il nostro studio fornisce la prima prova che incorporando NaPTA/sarkosyl purificazione nel protocollo di preparazione del campione fecale consente il rilevamento di prioni CWD di RT-QuIC. Inoltre, con questa metodologia, siamo riusciti a ridurre la conversione spontanea del substrato rPrP in omogeneati fecali CWD-negativo nell'analisi di RT-QuIC.
Un potenziale meccanismo è stato proposto per spiegare l'effetto di substrato sostituzione 30. Nel primo round della reazione (prima dell'aggiunta del substrato fresco), solo una piccola quantità di semi viene aggiunto alle reazioni di RT-QuIC. Mentre solo una parte del rPrP è inglobata le reazioni teste di serie, il resto del substrato può essere utilizzato sia interagendo con le pareti dei pozzetti della piastra reazione a formare aggregati non amiloidi, o alterato per una forma che è meno incline a essere convertito dalla sede DED RT-QuIC prodotti piuttosto che i semi originali. Di conseguenza, il tasso di incorporazione di rPrP ai semi è lento, e la formazione di fibrille non è rilevabile nella fase di ritardo. Come le teste di serie RT-QuIC prodotti coltivati nella fase di ritardo sono finalmente allungati per raggiungere una "fase di montaggio rapido", i prioni possono essere rapidamente amplificato dalla segmentazione attraverso agitazione o laterale aggiunta di piccoli aggregati. In questa fase, il substrato fresco aggiunto alla reazione è prontamente integrato le teste di serie prodotti piuttosto che formando aggregati aspecifici. L'incorporazione del passo di sostituzione del substrato nel nostro protocollo era una modifica che una maggiore sensibilità; e ' stato utile per rilevare i semi da prioni nei campioni con una quantità molto bassa di PrPSc da animali pre-clinici e/o contenenti composti inibitori.
Utilizzando analisi di RT-QuIC anziché PMCA, che è la prima proteina in vitro misfolding analisi di amplificazione descritto 21, ha diversi vantaggi. In PMCA i tubi sono incubati e sonicati in bagno d'acqua contenuto all'interno del sonicatore; i tubi posizionati alla periferia del sonicatore mostrano un'efficacia minore di amplificazione rispetto ai tubi posizionati nel centro 48. Il sistema di RT-QuIC tremare sembra essere più facile da controllare. L'uso di un formato ben 96 è un reale vantaggio di RT-QuIC, tuttavia, il mb-PMCA sviluppato da Moudjo et al. 49 , 50, ha mostrato benefici simili, ma ancora è meno usato in PMCA.
Come substrato, RT-QuIC utilizza rPrP ricombinante per la conversione; al contrario, PMCA nella maggior parte dei casi utilizza omogeneato del cervello normale. Inoltre, in RT-QuIC alcuna omologia di sequenza non è necessaria tra seme e substrato 51–53.
La presenza di cofattori è necessaria per la replicazione prionica in PMCA e il prodotto risultante è contagioso. Tuttavia, nell'analisi di RT-QuIC, il PrP amplificato non è contagiosa. Nelle analisi di amplificazione in vitro l'avvenimento di reazioni falsamente positive molto probabilmente a causa della conversione spontanea di PrPC è un problema ricorrente. Pertanto, il dosaggio e condizioni utilizzate in questo studio sono state ideate per minimizzare tali dispersioni per massimizzare la differenza tra teste di serie rPrP-conversione e la conversione spontanea.
In conclusione, il trattamento NaPTA/sarkosyl permette alla rimozione degli inibitori di dosaggio nelle feci e riduce la conversione spontanea. Interessante, il trattamento non ha fatto ostacolo alla semina attività di precipitatedPrPSc. Inoltre, la sensibilità di rilevazione è stata migliorata significativamente quando la sostituzione del substrato è stato adottato in concomitanza.

Malattie da prioni o encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE) sono disordini neurodegenerative compreso la malattia di Creutzfeldt – Jakob (CJD) negli esseri umani, l'encefalopatia spongiforme bovina (BSE) nei bovini, scrapie nelle pecore e capre e di sprecare cronica malattia (CWD) nei cervidi 1,2. Le TSE sono caratterizzate da aspetto spongiforme distintivo e perdita di neuroni nel cervello. Secondo l'ipotesi della "proteina solo", i prioni sono costituiti principalmente di PrPSc ('Sc' scrapie) 3, un'isoforma misfolded della proteina prionica cellulare host-codificati, PrPC. PrPSc risultante dalla conversione di PrPC in una conformazione arricchita in schede tecniche ᵦ 4,5,6 , che può agire come un seme di legare e convertire altre molecole di PrPC . Le molecole di PrPSc appena generate sono incorporate in un crescente polimero 7,8 , che si rompe in oligomeri più piccoli, con conseguente più alti numeri di nuclei infettivi. PrPSc è incline all'aggregazione ed è parzialmente resistente alle proteasi 9,10.
CWD colpisce selvatici e di allevamento degli alci (Cervus canadensis), cervo mulo (Odocoileus hemionus), cervi dalla coda bianca (WTD; Odocoileus virginianus), alce (Alces alces) e la renna (Rangifer tarandus tarandus) 11,12,13. È considerato la più contagiosa malattia prionica con trasmissione orizzontale favorito da interazioni di cervidi e persistenza ambientale di infettività 14,15. A differenza di altre malattie da prioni dove PrPSc accumulo e infettività sono confinati al cervello, in CWD questi si trovano anche in tessuti periferici e fluidi corporei es. saliva, urina e feci 16,17, 18.
Immunohistochemistry è considerato il gold standard per la diagnosi CWD rilevare la distribuzione di PrPSc e lesioni spongiformi 19,20. ELISA e in casi più rari, macchia occidentale sono utilizzati anche per la diagnostica CWD. Così, la diagnosi delle malattie da prioni attuale si basa principalmente sulla rilevazione di prioni in tessuti post-mortem. La diagnosi ante mortem per CWD è disponibile prendendo le tonsille o le biopsie di tessuto linfoide mucosa-collegato recto-anale (RAMALT); Tuttavia, questa procedura è invasiva e richiede la cattura degli animali. Pertanto, l'uso di esemplari facilmente accessibili, come urina e feci, sarebbe un modo pratico per il rilevamento del prion CWD. Tuttavia, quei harbor escrementi relativamente basse concentrazioni di prioni sotto il limite di rilevamento degli attuali metodi di diagnostici. Di conseguenza, è necessario uno strumento diagnostico più sensibile e più alta di velocità effettiva. Analisi in vitro sistemi di conversione, quali proteina misfolding ciclica amplificazione (PMCA) 21, amiloide semina analisi e conversione indotta da tremare in tempo reale (RT-QuIC) dosaggio 22,23, 24 sono strumenti molto potenti per sfruttare la capacità auto-moltiplicazione di PrPSc di mimare in vitro il processo di conversione da prioni e quindi amplificare la presenza di piccole quantità di PrPSc a livelli rilevabili 25 ,26. Tuttavia, il metodo RT-QuIC, sfrutta il fatto che il prodotto di conversione arricchito nella struttura secondaria β-foglio può legano specificamente Tioflavina T (Th-T). Di conseguenza, PrP ricombinante (rPrP) al momento della conversione seminato cresce in fibrille amiloidi che legano Th-T e pertanto possono essere rilevate in tempo reale misurando la fluorescenza della Th-T espresso in unità di fluorescenza relativa (RFU) nel corso del tempo. Una volta controllati, la RFU può essere utilizzata per valutare la relativa attività di semina e parametri quantitativi quali la fase di ritardo. La fase di ritardo rappresenta il tempo (h) necessario per raggiungere la soglia, durante il quale rPrP conversione nella fase iniziale della reazione è inferiore al limite di rilevazione di fluorescenza Th-T. Alla fine della fase di apparente ritardo, concomitante alla formazione di un nucleo dell'amiloide sufficiente (nucleazione/allungamento), si verifica quando la fluorescenza di Th-T supera il livello di soglia e diventa positiva. La crescita di amiloide fibrille possono essere rilevati in tempo reale e l'iniziale PrPSc o semina attività contenuta nel campione è amplificata dalla segmentazione che genera più semi. Questi semi inducono a sua volta una rapida fase esponenziale di crescita della fibra dell'amiloide.
Perché questo test è in grado di rilevare basso quanto 1 fg di PrPSc 24, l'alta sensibilità si qualifica questa tecnica per realizzare ante mortem o diagnosi non invasiva rilevando PrPSc in vari tessuti periferici, escrementi o altre tipi di campione che harboring i bassi livelli di infettività. RT-QuIC offre sicuramente vantaggi rispetto altri dosaggi per la sua riproducibilità, praticità, rapidità (meno di 50 h) e bassi costi rispetto alle analisi biologiche. Evita la complessità tecniche quali sonicazione utilizzato in PMCA; Inoltre, viene eseguita in una micropiastra nastro sigillato che minimizza il rischio di contaminazione dell'aerosol di ciascun pozzetto. Il formato multi-pozzetto permette l'analisi di fino a 96 campioni nello stesso esperimento. Per contrastare il problema ricorrente di falsi positivi e conversione spontanea di rPrP nelle analisi in vitro conversione l'implementazione di una soglia (cut-off) in RT-QuIC è molto utile. Infatti, sulla base dei risultati del controllo negativo (media RFU di campioni negativi + 5 SD 27), una linea di base è impostato da cui si può fare discriminazione tra positivi e negativi. L'uso di quattro repliche per ogni campione così può contribuire a definire un campione come positivo quando almeno il 50% dei replicati mostrano un segnale positivo, cioè attraversare il cut-off 28. L'omologia tra seme e substrato non è necessaria in RT-QuIC, come ad esempio in uno studio precedente, criceto rPrP è stato trovato per essere un substrato più sensibile rispetto al substrato omologo in umano PrPvCJD seminato e scrapie delle pecore seminato reazioni 29. criceto-pecore chimerico rPrP inoltre è stato suggerito un substrato più adatto rispetto umano rPrP per rilevare umano variante CJD prioni 30. Pertanto, l'utilizzo di substrati rPrP da diverse specie è molto comune in questo test. Questo test è stato applicato con successo a parecchie malattie da prioni, quali sporadiche CJD 31,32,33, gendi malattie da prioni etic 34, BSE 35,36,37, scrapie 23,36e CWD 38,39,40,41, 42. Gli studi che utilizzano elaborati del liquido cerebrospinale, sangue intero, saliva e urina come semi in RT-QuIC erano tutti di successo per rilevare PrPSc 38,39,40,41, 42. per favorire la capacità di rilevazione campioni come nel plasma sanguigno che possono contenere inibitori della formazione dell'amiloide, Orrú et al. (2011) ha sviluppato una strategia per rimuovere potenziali inibitori della formazione dell'amiloide da pettinatura PrPSc immunoprecipitazione (IP) passo e RT-QuIC, denominato "enhanced QuIC" dosaggio (eQuIC). Inoltre, un passo di sostituzione del substrato è stato impiegato dopo ~ 24 h tempo di reazione al fine di migliorare la sensibilità. In definitiva, come basso come 1 ag di PrPSc era rilevabile da eQuIC 30.
Al fine di purificare le feci estratti e rimuovere gli inibitori possibile dosaggio nelle feci, campioni di feci raccolti nelle fasi precliniche e cliniche da elk al momento dell'infezione orale sperimentale sono stati omogeneizzati in tampone contenente detergenti e inibitori della proteasi. Gli estratti di feci ulteriormente sono stati sottoposti a diverse metodologie per concentrarsi PrPSc nei campioni utilizzando la precipitazione della proteina tramite precipitazione di sodio fosfotungstico acido (NaPTA). Il metodo di precipitazione di NaPTA, in primo luogo descritto da Safar et al. 43, è usato per concentrare PrPSc in campioni di prova. L'incubazione di NaPTA con i risultati del campione in precipitazione preferenziale di PrPSc piuttosto che PrPC. Tuttavia, il meccanismo molecolare è ancora poco chiaro. Questo passaggio ha aiutato anche contenenti e impedendo la conversione spontanea del rPrP, che si osserva in alcuni casi. Infine, gli estratti di feci sono stati testati da ottimizzato RT-QuIC usando mouse rPrP (aa 23-231) come substrato e compresa la sostituzione del substrato nel protocollo per migliorare la sensibilità di rilevazione.
Qui i risultati dimostrano che questo metodo migliorato in grado di rilevare concentrazioni molto basse di prioni CWD e aumenta la sensibilità di rilevazione e specificità in campioni di feci rispetto a un protocollo senza sostituzione di precipitazione e substrato di NaPTA. Potenzialmente, questo metodo può essere applicato ad altri tessuti e fluidi corporei e può essere di grande utilità per la sorveglianza di CWD nei cervidi selvatici.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc seringe filters</td><td>PALL</td><td>4652</td><td></td></tr><tr><td>amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit</td><td>Millipore</td><td>UCF901024</td><td></td></tr><tr><td>BD 10 ml seringe</td><td>VWR</td><td>CA75846-842</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Corning bottle-top vacuum filters</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431118</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS M Tube</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Guanidine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) broth</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12780029</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15502048</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ML9150</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K</td><td>PALL</td><td>OD100C34</td><td></td></tr><tr><td>Nunc sealing tapes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>232702</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor tablet</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Calbiochem</td><td>7910-OP</td><td></td></tr><tr><td>sodium phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>496626</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin T</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Triton-100</td><td>Calbiochem</td><td>9410-OP</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Commercial buffers and solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BugBuster Master Mix</td><td>Nogagen</td><td>71456-4</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow</td><td>Qiagen</td><td>1018401</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X)</td><td>Life Technoligies</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Distilled Water</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Standards and commercial kits&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Express Autoinduction System 1</td><td>Novagen</td><td>71300-4</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment setup&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA protein purification systems FPLC</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman Avanti J-25 Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman rotor JA-25.50</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman rotor JA-10</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega microplate reader</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sofware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MARS Data Analysis</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism6</td><td>GraphPad software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

real-time quaking-induced conversion assay for detection of cwd prions in fecal material

La tecnica RT-QuIC è un sensibili in vitro senza cellula del prion amplificazione saggio basato principalmente sul seminato misfolding e aggregazione del substrato di proteina (PrP) prionica ricombinante usando i semi del prion come modello per la conversione. RT-QuIC è una tecnica novella di alto-rendimento che è analoga alla reazione a catena della polimerasi in tempo reale (PCR). Rilevamento della crescita della fibrilla dell'amiloide è basato sul colorante Tioflavina T, che reagisce in su specifica interazione con proteine ricche ᵦ-foglio. Pertanto, la formazione dell'amiloide possa essere rilevati in tempo reale. Abbiamo tentato di sviluppare un test di screening non invasivo affidabile per rilevare i sprecare prioni (CWD) la malattia cronica in estratto fecale. Qui, in particolare abbiamo adattato la tecnica RT-QuIC per rivelare PrPSc semina attività nelle feci di CWD infettati cervidi. Inizialmente, l'attività di semina degli estratti fecali che abbiamo preparato era relativamente basso in RT-QuIC, probabilmente a causa di potenziali inibitori di dosaggio del materiale fecale. Per migliorare l'attività semina degli estratti di feci e rimuovere potenziali inibitori di dosaggio, abbiamo omogeneizzato i campioni fecali in un tampone contenente detergenti e inibitori della proteasi. Abbiamo anche presentato i campioni di diverse metodologie per concentrarsi PrPSc sulla base di precipitazione della proteina usando acido fosfotungstico sodio e forza centrifuga. Infine, gli estratti di feci sono stati testati da ottimizzato RT-QuIC che comprendeva la sostituzione del substrato nel protocollo per migliorare la sensibilità di rilevazione. Così, abbiamo stabilito un protocollo per rilevazione sensibile del prione CWD semina attività nelle feci di cervidi pre-clinici e clinici di RT-QuIC, che può essere uno strumento pratico per la diagnosi non invasiva di CWD.

Gli estratti fecali CWD preparati al 10% (p/v) erano in grado di reazione RT-QuIC del seme, tuttavia la sensibilità di rilevazione era basso 27. Utilizzando un buffer specifico per omogeneizzazione fecale era un passaggio fondamentale per evitare la fluorescenza di fondo alto in reazioni RT-QuIC concomitante all'uso del substrato rPrP mouse piuttosto che rPrP di cervi che ha permesso di ottenere più specifici risultati 27. L'aggiunta di NaPTA precipitazioni ha ridotto la conversione spontanea di rPrP in RT-QuIC (Figura 1) senza inibire l'amplificazione dell'attività semina delle reazioni (Figura 2). Anche se la migliore amplificazione è stata osservata dopo trattamento NaPTA, segnali di fluorescenza risultante di campioni fecali CWD-positivi erano ancora bassa (Figura 1). Inoltre, l'amplificazione del prion di alcuni campioni ha raggiunto un plateau costante a livelli di bassa fluorescenza. Questo indica la saturazione delle reazioni, che può essere dovuto la degradazione/denaturazione di rPrP o la formazione di aggregati di fuori via che consumano la piscina di rPrP 30. Per migliorare l'amplificazione dei prioni ulteriormente e migliorare la sensibilità di rilevazione, un passo di sostituzione del substrato fu incorporato il protocollo. L'introduzione della sostituzione del substrato del protocollo RT-QuIC (Figura 2) ha aumentato la sensibilità (77%; 14 su 18 campioni in RT-QuIC erano positivi) e specificità (100%; nessuno dei controlli negativi in RT-QuIC tornito positivo) di rilevazione (Vedi Tabella 1 da Cheng et al. 27). Infine, tutti questi passaggi (Figura 3) ha condotto all'ottimizzazione di un protocollo affidabile e sensibile per la rilevazione di RT-QuIC dei prioni CWD, utilizzando il campione contenente bassi livelli di infettività.
Sostituzione del substrato è stato introdotto dopo il primo 25 h di reazione RT-QuIC, riempiendo la reazione tampone substrato fresco e fresco fluorescenza tinta Th-T. Introducendo il passo di sostituzione del substrato nel protocollo, il tempo di reazione di RT-QuIC è stata estesa da 50 h a 75 h. Come illustrato nella Figura 2 con l'incorporazione della sostituzione del substrato, è stato osservato un miglioramento significativo dell'amplificazione del prion.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56373/56373fig1.jpg"> 
Figura 1: ridotta conversione spontanea del substrato rPrP mouse in RT-QuIC seminato con purificato CWD-negativi fecale omogeneato. Fecali omogeneati dell'alce non infetti (C181-006) o cervo mulo sono stati omogeneizzati in feci Estratto di buffer per ottenere una concentrazione finale di 10% (p/v). Per la purificazione, questi omogeneati fecali sono stati elaborati e 10 - volte concentrati dalla precipitazione di NaPTA. L'impura fecali omogeneati (un), forme NaPTA-purificata e concentrate (b) diluiti come indicato sono stati utilizzati per RT-QuIC quadruplicate reazioni con rPrP del mouse come un substrato di semi. La y Visualizza unità relative fluorescenza Th-T, che il x-axes raffigurano il tempo di reazione. Una riduzione delle conversioni spontanee è stata veduta in campioni fecali NaPTA-purificato (b). Dati utilizzati da Cheng et al. 27. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56373/56373fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56373/56373fig2.jpg"> 
Figura 2. Migliorato il rilevamento dei prioni CWD nelle feci mediante sostituzione del substrato. Omogeneati fecali di alce individuali (C051-05, C052 di-05) oralmente infettati con i prioni CWD erano purificati e concentrati da precipitazione di NaPTA. NaPTA-trattati campioni sono stati diluiti tra 2 x 10-1 a 2 x 10-3 utilizzato per reazioni di RT-QuIC quadruplicate seme con substrato rPrP del mouse. L'analisi di RT-QuIC è stato effettuato senza sostituzione di substrato (un) in un periodo normale di 50 h o con l'incorporazione della sostituzione di substrato per un periodo di incubazione estesa di 75 h (b). Per quest'ultimo, sostituzione di substrato è stato introdotto dopo il primo 25 h di reazione RT-QuIC. Novanta per cento del volume di reazione è stato rimosso e sostituito da preparata RT-QuIC miscela di reazione contenente substrato rPrP e Th-T. Introducendo il passo di sostituzione del substrato nel protocollo, il tempo di reazione di RT-QuIC è stata estesa da 50 h-h. 75 dati utilizzati da Cheng et al. 27. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56373/56373fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56373/56373fig3.jpg"> 
Figura 3: diagramma di flusso che descrive PrPSc estrazione fecale da CWD-infettati cervidi e semina amplificazione del prione e attività usando RT-QuIC test. Campioni di feci da animali affetti da CWD sono omogeneizzati in un tampone di estrazione fecale, sottoposti al metodo di precipitazione di NaPTA e testati dall'analisi di RT-QuIC. Quest'ultima è stata eseguita mediante l'introduzione di un passo di sostituzione del substrato. L'incorporazione della procedura di sostituzione NaPTA e substrato è provocato da una riduzione di conversione spontanea e forte miglioramento nella semina amplificazione del prione e attività. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56373/56373fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Qui, presentiamo un protocollo per descrivere una tecnica di amplificazione del prion semplice, veloce ed efficiente, il metodo di conversione indotta da tremare in tempo reale (RT-QuIC).

In tempo reale tremare-indotta conversione analisi per rilevazione di CWD prioni nel materiale fecale

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.5K Views.  University of Calgary. Qui, presentiamo un protocollo per descrivere una tecnica di amplificazione del prion semplice, veloce ed efficiente, il metodo di conversione indotta da tremare in tempo reale (RT-QuIC).

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Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such as Chronic Wasting Disease (CWD) of cervids and scrapie in sheep. The Prion hypothesis asserts that this abnormal conformer constitutes most or all of the infectious prion. The role of the immune system in early events in peripheral prion pathogenesis has been convincingly demonstrated for CWD and scrapie 1-3. Transgenic and pharmacologic studies in mice revealed an important role of the Complement system in retaining and replicating prions early after infection 4-6. In vitro and in vivo studies have also observed prion retention by dendritic cells 7-10, although their role in trafficking remains unclear 11-16. Macrophages have similarly been implicated in early prion pathogenesis, but these studies have focused on events occurring weeks after infection 3,11,17. These prior studies also suffer from the problem of differentiating between endogenous PrPC and infectious prions. Here we describe a semiquantitative, unbiased approach for assessing prion uptake and trafficking from the inoculation site by immune cells recruited there. Aggregated prion rods were purified from infected brain homogenate by detergent solubilization of non-aggregated proteins and ultracentrifugation through a sucrose cushion. Polyacrylamide gel electrophoresis, coomassie blue staining and western blotting confirmed recovery of highly enriched prion rods in the pelleted fraction. Prion rods were fluorochrome-labeled then injected intraperitoneally into mice. Two hours later immune cells from peritoneal lavage fluid, spleen and mediastinal and mesenteric lymph nodes were assayed for prion rod retention and cell subsets identified by multicolor flow cytometry using markers for monocytes, neutrophils, dendritic cells, macrophages and B and T cells. This assay allows for the first time direct monitoring of immune cells acquiring and trafficking prions in vivo within hours after infection. This assay also clearly differentiates infectious, aggregated prions from PrPC normally expressed on host cells, which can be difficult and lead to data interpretation problems in other assay systems. This protocol can be adapted to other inoculation routes (oral, intravenous, intranervous and subcutaneous, e.g.) and antigens (conjugated beads, bacterial, viral and parasitic pathogens and proteins, egg) as well.

Here we describe a novel assay for monitoring prion uptake and trafficking by immune cells immediately following intraperitoneal inoculation by purifying and fluorescently labeling aggregated prion rods from infected brain material then monitoring their uptake and movement from the injection site and characterizing the cells mediating these events.

Monitoraggio Traffico di cellule immunitarie fluorescente Rods prioni ore dopo l&#39;infezione intraperitoneale

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Prions are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein has two distinct isoforms, the non-infectious host-encoded protein (PrPC) and the infectious protein (PrPSc), an abnormally-folded isoform of PrPC 8.
One of the challenges of working with prion agents is the long incubation period prior to the development of clinical signs following host inoculation13. This traditionally mandated long and expensive animal bioassay studies. Furthermore, the biochemical and biophysical properties of PrPSc are poorly characterized due to their unusual conformation and aggregation states.
PrPSc can seed the conversion of PrPC to PrPSc in vitro14. PMCA is an in vitro technique that takes advantage of this ability using sonication and incubation cycles to produce large amounts of PrPSc, at an accelerated rate, from a system containing excess amounts of PrPC and minute amounts of the PrPSc seed19. This technique has proven to effectively recapitulate the species and strain specificity of PrPSc conversion from PrPC, to emulate prion strain interference, and to amplify very low levels of PrPSc from infected tissues, fluids, and environmental samples6,7,16,23 .
This paper details the PMCA protocol, including recommendations for minimizing contamination, generating consistent results, and quantifying those results. We also discuss several PMCA applications, including generation and characterization of infectious prion strains, prion strain interference, and the detection of prions in the environment.

Protein misfolding cyclic amplification (PMCA) is an in vitro assay for the study of prion conversion and strain and species barriers. It can also be used as a prion detection assay.

Proteine ​​ciclica Amplificazione misfolding di prioni

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

Procedure per l&#39;identificazione Infettive prioni dopo il passaggio attraverso l&#39;apparato digerente di una specie aviaria

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

Valutare l&#39;encefalopatia spongiforme trasmissibile Specie Barriere con un<em&gt; In Vitro</em&gt; Prion Protein Assay Conversion

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

Medicina

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in research laboratories, as well as for molecular diagnosis, because of its sensitivity, specificity, and convenience. However, in most cases, the quantitative PCR (qPCR) assay generally used to detect virus infection has relied on the purification of viral nucleic acid prior to the PCR step. In this study, the fluorescence-based reverse transcription qPCR (RT-qPCR) assay is developed through the combination of a processing buffer and a one-step RT-PCR reagent so that the whole process, from the harvest of the culture supernatant of virus-infected cells until real-time detection, can be performed without viral RNA purification. The established protocol enables the quantification of a wide range of RNA concentrations of dengue virus (DENV) within 90 min. In addition, the adaptability of the direct RT-qPCR assay to the evaluation of an antiviral agent is demonstrated by an in vitro experiment using a previously reported DENV inhibitor, mycophenolic acid (MPA). Moreover, other RNA viruses, including yellow fever virus (YFV), Chikungunya virus (CHIKV), and measles virus (MeV), can be quantified by direct RT-qPCR with the same protocol. Therefore, the direct RT-qPCR assay described in this report is useful for monitoring RNA virus replication in a simple and rapid manner, which will be further developed into a promising platform for a high-throughput screening study and clinical diagnosis.

Real-time quantitative polymerase chain reaction analysis combined with reverse transcription (RT-qPCR) has been widely used to measure the level of RNA virus infections. Here we present a direct RT-qPCR assay, which does not require an RNA purification step, developed for the quantification of several RNA viruses, including dengue virus.

RNA del Virus di febbre rompiossa nel supernatante di coltura delle cellule infettate da reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale di misurazione

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

Quantitation of Rabies Virus in Various Bovine Brain Structures

Bovine paralytic rabies (BPR) is a form of viral encephalitis that is of substantial economic importance throughout Latin America, where it poses a major zoonotic risk. Here, our objective was to utilize a laboratory protocol to determine the relative copy number of the rabies virus (RABV) genome in different bovine brain anatomical structures using quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). qRT-PCR quantifies the specific number of gene copies present in a sample based on fluorescence emitted after amplification that is directly proportional to the amount of target nucleic acid present in the sample. This method is advantageous owing to its short duration, reduced risk of contamination, and potential to detect viral nucleic acids in different samples more easily compared to other techniques. The brains of six rabid animals were divided into six anatomical structures, namely the Ammon&#8217;s horn, cerebellum, cortex, medulla, pons, and thalamus. All brains were identified as positive for RABV antigens based on a direct immunofluorescence test. The same anatomical structures from the brains of four RABV-negative bovines were also assessed. RNA was extracted from each structure and used for qRT-PCR. An assay was performed to determine the copy numbers of RABV genes using an in vitro transcribed nucleoprotein gene. The standard curve used to quantify viral RNA exhibited an efficiency of 100% and linearity of 0.99. Analysis revealed that the cortex, medulla, and thalamus were the ideal CNS portions for use in RABV detection, based on the observation that these structures possessed the highest levels of RABV. The test specificity was 100%. All samples were positive, no false positives were detected. This method can be used to detect RABV in samples that contain low levels of RABV during diagnosis of BPR.

This protocol presents a qRT-PCR-based approach for determining the rabies virus nucleoprotein (N) gene copy number within various bovine brain anatomical structures using in vitro transcription.

Quantificazione del virus della rabbia in varie strutture cerebrali bovine

Bovine paralytic rabies (BPR) is a form of viral encephalitis that is of substantial economic importance throughout Latin America, where it poses a major ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR è un metodo sensibile e rapido per il rilevamento del DNA Cytomegaloviral in fissato in formalina, incluse in paraffina biopsia

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Biologia

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

Sviluppo di un Quantitative ricombinasi Polymerase Amplificazione Assay con un controllo positivo interno

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

Prion Safety Laboratory Swipe Test

Transmission of iatrogenic prion disease has occurred from contaminated neurosurgical tools, transplant materials, and occupational exposure to prion-contaminated laboratory tools. Prions cause disease by the templated misfolding of the normal cellular form of the prion protein, PrPC, into the misfolded and pathogenic form PrPSc and are invariably fatal. Reducing iatrogenic and occupational prion transmission is challenging. First, prions can bind to and persist on surfaces for long periods of time. Second, prions are highly resistant to inactivation. Given this, surfaces can retain infectivity for long periods of time following ineffective decontamination. Not only can this pose a potential occupational risk for prion laboratory workers, but it could potentially cross-contaminate laboratory experiments utilizing sensitive prion amplification techniques. The protocol described here for a prion safety laboratory swipe test includes steps for the identification and documentation of high-traffic laboratory areas, recommended swabbing controls to ensure the validity of results, steps to identify proper responses to positive surface swabbing sites, representative results from prion swipe testing, as well as potential artifactual results. Overall, the prion safety laboratory swipe test can be implemented as part of a broader prion safety program to assess decontamination of surfaces, monitor common spaces for prion contamination, and implement the documentation of prion decontamination status.

A method to assess commonly used areas in laboratory settings for prion contamination and effective decontamination is lacking. The protocol described here provides key fundamentals for implementing a laboratory prion safety swipe test that can easily be modified to meet the individual needs of specific laboratories.

Test di strisciamento del laboratorio di sicurezza dei prioni

Transmission of iatrogenic prion disease has occurred from contaminated neurosurgical tools, transplant materials, and occupational exposure to ...

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). These neurodegenerative diseases affect humans and several animal species and include scrapie, zoonotic bovine spongiform encephalopathy (BSE), chronic wasting disease of cervids (CWD), and the newly identified camel prion disease (CPD). Diagnosis of TSEs relies on immunodetection of PrPSc by application of both immunohistochemistry (IHC) and western immunoblot methods (WB) on encephalon tissues, namely, the brainstem (obex level). IHC is a widely used method that uses&#160;primary antibodies (monoclonal or polyclonal) against antigens of interest in cells of a tissue section. The antibody-antigen binding can be visualized by a color reaction that remains localized in the area of the tissue or cell where the antibody was targeted. As such, in prion diseases, as in other fields of research, the immunohistochemistry techniques are not solely used for diagnostic purposes but also in pathogenesis studies. Such studies involve detecting the PrPSc patterns and types from those previously described to identify the new prion strains. As BSE can infect humans, it is recommended that biosafety laboratory level-3 (BSL-3) facilities and/or practices are used to handle cattle, small ruminants, and cervid samples included in the TSE surveillance. Additionally, containment and prion-dedicated equipment are recommended, whenever possible, to limit contamination. The PrPSc IHC procedure consists of a formic acid epitope-demasking step also acting as a prion inactivation measure, as formalin-fixed and paraffin-embedded tissues used in this technique remain infectious. When interpreting the results, care must be taken to distinguish non-specific immunolabeling from target labeling. For this purpose, it is important to recognize artifacts of immunolabeling obtained in known TSE-negative control animals to differentiate those from specific PrPSc immunolabeling types, which can vary between TSE strains, host species, and prnp genotype, further described herein.

Immunolabeling abnormal prion protein using immunohistochemistry protocols requires specific sample and anti-PrP antibody preparation methodologies. The present protocol describes the key steps in epitope demasking to ensure proper PrP immunolabeling and to minimize non-specific background staining. Also, this approach considers biosafety measures when conducting immunohistochemistry studies with the prion-infected tissues.

In tempo reale tremare-indotta conversione analisi per rilevazione di CWD prioni nel materiale fecale

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Monitoraggio Traffico di cellule immunitarie fluorescente Rods prioni ore dopo l'infezione intraperitoneale

Proteine ciclica Amplificazione misfolding di prioni

Procedure per l'identificazione Infettive prioni dopo il passaggio attraverso l'apparato digerente di una specie aviaria

Valutare l'encefalopatia spongiforme trasmissibile Specie Barriere con un

RNA del Virus di febbre rompiossa nel supernatante di coltura delle cellule infettate da reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale di misurazione

Quantificazione del virus della rabbia in varie strutture cerebrali bovine

qPCR è un metodo sensibile e rapido per il rilevamento del DNA Cytomegaloviral in fissato in formalina, incluse in paraffina biopsia

Sviluppo di un Quantitative ricombinasi Polymerase Amplificazione Assay con un controllo positivo interno

Test di strisciamento del laboratorio di sicurezza dei prioni

Rilevazione di proteine prioniche anomale mediante immunoistochimica

In tempo reale tremare-indotta conversione analisi per rilevazione di CWD prioni nel materiale fecale

Riepilogo

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Valutare l'encefalopatia spongiforme trasmissibile Specie Barriere con un

RNA del Virus di febbre rompiossa nel supernatante di coltura delle cellule infettate da reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale di misurazione

Quantificazione del virus della rabbia in varie strutture cerebrali bovine

qPCR è un metodo sensibile e rapido per il rilevamento del DNA Cytomegaloviral in fissato in formalina, incluse in paraffina biopsia

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