トレーニングとシカの PrP 細菌発現プラスミドを提供する博士バイロン コーイー (NIH ロッキー山研究所) に感謝しております。SG は、カナダの研究の椅子プログラムによってサポートされます。我々 はアルバータ州プリオン研究所ゲノム カナダとアルバータ州農業・林業ゲノム アルバータ州、カルガリー大学この作業を支援するから SG にこの研究のための資金を認めます。我々 は、動物研究のマーガレット ・ ガン財団から研究助成を認めます。

1 です RT QuIC 糞便材料を用いた 糞便 10 mL に 1 g の糞便材料を追加することによって <ol><li><ol><li>作る エキス シカの糞準備 の糞便磨砕液抽出バッファー (20 mM リン酸ナトリウム, pH 7.1 では、130 mM の NaCl、。0.05 %1 x 1 mM PMSF、トゥイーン 20 完了プロテアーゼ阻害剤、EDTA 無料) 最終濃度 10% (w/v) を与える。均質化のバッファーを利用する前に準備して-20 で格納できます ° C</li>
		<li>Homogenize 糞便ペレット (1 g) とチューブ (例えば、gentleMACS M 管) の製造業者から事前に設定プログラムで室温で 1 分のための蛋白質の分解を使用してバッファー (10 mL)。糞便のサンプルは、完全にバッファーに均質になるまで 2 〜 3 回この手順を繰り返します</li>。
		<li>パラフィルムで管を密封し、室温で 1 時間放置のロッキング プラットフォームまたはロータリー シェーカーに配置します</li>。
		<li>室温で 5 分間 18,000 × g でチューブを遠心します</li>。
		<li>収集タンパク質を含む培養上清を抽出し、それらを 1.5 mL チューブ因数。因数は、さらにアプリケーション-80 ° C で保存できます</li>。
	</ol></li> <li>濃度の PrP Sc 糞便抽出 注: 蛋白質の沈殿物のステップの追加による RT QuIC、検出感度を向上、糞抽出 CWD プリオンを集中するためにプロトコル。
	<ol><li>NaPTA 沈殿法</li> <li>N-ラウリルメタクリ油脂肪酸サルコシン (sarkosyl) 糞便蛋白質の 1 ml の 10% (w/v) の追加の 250 μ L を最終濃度 2% (v/v) の sarkosyl を与える抽出します</li>。
		<li>シール管パラフィルムでサンプルを含む、37 ° c、thermomixer で 1,400 rpm で一定振動下で 30 分間インキュベートします</li>。
		<li>リンタングステン酸ナトリウム、pH 7.4、最終濃度が 0.3% (w/v) リンタングステン酸試料中の塩化マグネシウムの 170 mM の 10% (w/v) を含む原液と糞便のタンパク質抽出物と sarkosyl のミックスを調整します</li>。
		<li>400 rpm で一定の揺れで 2 h の 37 ° C でサンプルをインキュベートします</li>。
		<li>遠心分離機の 14 ° c サンプル 15,800 x g に 30 分は培養上清を慎重に削除します</li>。
		<li>洗浄バッファーでそれらを再ペレットを洗浄 (10 mM pH 7.5、100 mM の NaCl、トリス-の Cl 0.5% トリトン X 100、10 ミリメートルの EDTA、0.5% ナトリウム 0.1% とデオキシ コール酸 (w/v)、sarkosyl (w/v)).</li>
		<li>遠心分離機の 14 ° c サンプル 15,800 x g に 15 分は培養上清を慎重に削除します</li>。
		<li>は、100 μ L でペレットを再懸濁します (1/10 糞便中の蛋白質の元のボリュームの抽出) RT QuIC 希釈バッファーの 。
		メモ: RT QuIC 希釈バッファー (20 mM リン酸ナトリウム, pH 6.9、130 mM の NaCl、0.1 %sds (w/v) および 1 つ X N2 の補足) は、利用前に用意しています。10 mL の容量は注射器を用いた 0.2 μ m acrodisc シリンジ フィルターで濾過、-20 ° C で使用されるまで保存されます</li>。
		<li>RT QuIC アッセイに活用までの-20 ° C で扱われる NaPTA サンプルを格納します</li>。
	</ol></li> <li>RT QuIC 法 <ol><li>新鮮な 10 mM Th T 原液 (二重蒸留 H 2 O の ml の 10 Th T の 0.032 g) を準備します</li>。
		<li>1:10 Th T ダブルで原液を蒸留 H 2 O を最終濃度 1 mm 目 T 0.2 μ m acrodisc 注射器を通してそれを注射器を用いたフィルター フィルターの希釈を行う</li>。
		<li>マウス組み換え PrP (rPrP、aa 23-231) 基板 (RT QuIC 反応あたり 10 μ g/mL) を氷に-80 ° C で保存を解凍</li>
		<li>ロード 500 μ 100 kDa のサイズの除外フィルター チューブに一度に rPrP 基板と 14,000 x g で (1 つのチューブ/フィルター使用可能最大 2 倍) 室温で 5 分間遠心します</li>。
		<li>滅菌 1.5 mL チューブに溶出した基板を転送し、使用するまで 4 ° C でそれを維持します</li>。
		<li>-20 に格納されている解凍 RT QuIC 希釈バッファー ° C</li>
		<li>RT QuIC の種 (糞便タンパク質抽出物) を希釈希釈バッファー: 
		原液のサンプル: 糞便タンパク質抽出原液を使用する 希釈 2 x 10 -1 希釈 2 x 10 -2 希釈 2 x 10 -3</li> <li>RT QuIC 反応混合物の貯蔵液の準備: リン酸緩衝生理食塩水 (PBS): 5 X NaCl: 2 M 在庫ダブル蒸留 H 2 o. で塩化ナトリウム 
		EDTA: 100 mM のダブルで準備 EDTA 原液を蒸留 H 2 o.</li>
		<li>(ステップ 1.3.8) のすべてのソリューションの利用前に注射器を用いた 0.2 μ m acrodisc シリンジ フィルターを介して各ソリューションを個別にフィルター、滅菌常温で置かなければ</li>。
		<li>は、すべての反応に十分な混合物を持っていることを確認するこのボリュームの 10% プラス使用するサンプル (サンプルあたり 98 μ L サンプルごとの反応量と 4 つレプリケートされます) の数に応じて RT QuIC 反応混合物の容量を準備します。
		RT QuIC の反応混合物を準備する <ol><li>使用 15 mL チューブ (20 mM リン酸ナトリウム, pH 6.9, 1 mM EDTA、10 μ M の 300 mM NaCl、Th T、10 μ G/ml rPrP 基板、および二重蒸留水反応 rPrP 最終濃度を調整する) 株式の sol を使用utions.</li>
			<li>は、フィルター先端のピペットを使用して上下ピペッティングでよくすべてのソリューションを混ぜます。渦の使用を可能な限り避ける</li>。
			<li>50 mL 使い捨てピペッティング シリンジに混合物を注ぐ</li>。
			<li>マルチ チャンネル ピペットを使用して光 96 ウェル底面プレートの各ウェルに RT QuIC 反応混合物の 98 μ L を読み込みます</li>。
		</ol></li> <li>各 RT QuIC 反応 2 μ 原液または 10 倍に希釈した糞便タンパク質抽出物を加えます。4 つのレプリケートで各サンプルをテストします 。
		注: 各実験 CWD 陰性と確認された CWD 陽性動物から糞便サンプル (2 x 10 -3 から原液まで) のシリアル希薄として使われる正と負のコントロールそれぞれ</li>。
		<li>プレート リーダー繰り返しサイクル 1 分二重軌道振動 (700 rpm) と潜伏中休憩 1 分で 25 時間 42 ° C で培養する前にシーリング テープでプレートをシールします</li>。
		<li>蛍光測定設定を定義: 
		励起: 450 nm 排出量: 480 nm 下を読むと、点滅の数: 20 手動ゲイン: 1000 (マシンによって異なります) 積分時間: 20 μ s</li> <li>25 h の終わりにプレート リーダーからプレートを取り外します</li>
		<li>井戸間の潜在的な汚染を避けるために 3 分間 3,000 x g でプレート スピンダウンします</li>。
		<li>プレートからシールを削除します</li>。
		<li>新鮮な基板と新鮮な蛍光を含む RT QuIC の反応混合物の 90 μ L Th T を染めるは、セクション 1.3.6 に 1.3.1 で説明を追加することによって新しい 96 ウェル プレートを準備します</li>。
		<li>新しく準備された 96 の最初のプレートの各ウェルから転送 10 μ L をウェル プレートします</li>。
		<li>は新しいプレートをシールし、ステップ 1.3.13 で説明されている手順に従って追加の 50 h の RT QuIC アッセイを続行します。50 h のこの追加の手順は、75 h の全反応時間になる 
		注: バイオ セーフティ キャビネットの下で RT QuIC アッセイのすべての手順を実行します</li>。
		<li>は、データを収集します。
		<li>読み取り、ドキュメントも 15 分毎回 T 蛍光信号</li> <ol>
			<li>データ解析ソフトウェアとスプレッドシートに転送を用いた, 反応の平均の総サイクル数のデータを収集します</li>。
			<li>は、データの平均値をプロットします。RT QuIC (h) の反応時間に対応する x 軸と y 軸が相対的な蛍光単位 (RFU) に対応します。各曲線は知られていたサンプルの希釈に対応します</li>。
			<li>各試験において陰性対照の最高の平均値を計算することでしきい値を画定プラス 5 の標準偏差電流に従って公開文献 41 。
			メモ:定義済みのしきい値を交差するすべての複製は、正と見なされます。敷居をまたぐ 4 つ複製のうち少なくとも 2 つ場合サンプルは、肯定的な見なされます</li>。
		</ol></li></ol></li></ol> 2。組み換えプリオンタンパク質 (rPrP) の精製 <ol><li>細菌の在庫と rPrP の式の成長 注: エシェリヒア属大腸菌 (E. 大腸菌) ひずみロゼッタ (DE3) ベクトル ペット 24 エンコーディングで変換、マウス PrP (23-231 残基) は、rPrP を準備していました。
	<ol><li>氷のペット 24 mPrP(23-231) と変換ロゼッタ (DE3) のグリセロール ストックを解凍</li>
		<li>連勝 LB (ルリア ベルターニカミラ) 最終濃度 50 μ G/ml のカナマイシンのプレートし、37 ° C のインキュベーターで一晩インキュベートします。細菌を含んでいる固体媒体で湿度結露を避けるためにプレートが逆さまにしていることを確認します。2 つのプレートの少なくとも 1 つの成長があることを確認する 2 つのプレートを準備します</li>。
		<li>準備 1 L LB とオートクレーブ滅菌すること</li>。
		<li>1 ml のカナマイシン (50 mg/mL)、クロラムフェニ コール (34 mg/mL) 1 mL 滅菌 LB 媒体のサプリメント 1 L.</li>
		<li>カナマイシンとクロラムフェニ コールを含む LB 培地 3 mL を接種する使い捨て接種ループを使用して、各プレートのコロニーを拾う</li>。
		<li>5-6 のための 225 rpm で一定の揺れで 37 ° C でインキュベーターでミニ文化の場所</li>
		<li>タンパク質発現の誘導のため一緒にエクスプレス Autoinduction システム 1 LB 媒体のオリジナル 1 l の残りの部分にミニ文化を追加します</li>。
		<li>場所 2 L フラスコ、またはより大きい、20-24 のための 200 の rpm で一定の揺れで 37 ° C でインキュベーターでの培養</li>
		<li>4 × 250 mL 遠沈管に 1 L 文化を分割します</li>。
		<li>室温で 20 分間 3,750 × g で文化を含んでいる管でスピンダウンします</li>。
		<li>は、上澄みを廃棄し、50 mL 遠沈管に細菌のペレットを収集、処理まで-80 ° C でそれらを凍結します。結果として得られるペレットが良い蛋白質収量 3 に 4 g を圧迫している</li>。
	</ol></li> <li>封入体の準備 <ol><li>数分の 37 ° C で冷凍餌 (3 に 4 g) を解凍します</li>。
		<li>の凍結のペレット-80 ° C で 10 分間の 1 つのより多くの時間と再び解凍。さらに 2 回を凍結融解のこの手順を繰り返します</li>。
		<li>は、1 X で細菌のペレットを再懸濁します 溶解試薬 (例えば BugBuster マスター ミックス) によって徹底的にピペッティングします。細菌のペレットの 1 g に 5 mL の試薬を使用します。完全にミックスを均質化することを確認します</li>。
		<li>室温で 20 分間ロッカーの磨砕液をインキュベートします</li>。
		<li>室温で 20 分間 16,000 x g でホモジネートを遠心します</li>。
		<li>慎重にそれにオフを注ぐことによって培養上清を破棄</li>
		<li>溶解試薬として、前の手順で使用されている X 1 の同じ量のペレットをホモジナイズしてください</li>。
		<li>常温ロッカー上で 15 分間ホモジネートをインキュベートします</li>。
		<li>1:10 の十分な量を追加 (0.1 x) 40 mL の総磨砕液の容積を得るため溶解試薬。よく均質化確認する逆解析によるミックス</li>。
		<li>4時 15 分 7,900 x g でホモジネートを遠心分離機 ° C</li>
		<li>慎重にそれを注ぐことによって上澄みを廃棄</li>
		<li>溶解試薬 x 0.1 40 mL にペレットを再懸濁します</li>。
		<li>4時 15 分 16,000 x g でホモジネートを遠心分離機 ° C</li>
		<li>それを注ぐことによって慎重に上澄みを廃棄し、さらに処理するまで-20 ° C で封入体を含むペレットを格納します</li>。
	</ol></li> <li>蛋白質の浄化 <ol><li>室温で封入体を解凍</li>。
		<li>14 ml 8 M グアニジン HCl の解凍の封入体を溶解 (38 g グアニジン塩酸塩 0.1 M ナポ 4 pH 8.0 で塗りつぶし H 2 O 50 mL に懸濁液で最終的な解決の pH を調整しない) タンパク質の可溶化</li>。
		<li>上下ピペッティングでよく均質化してください</li>。
		<li>加温 50 分間室温でロッカーのライセート</li>
		Ni NTA 樹脂の準備 18 g <li>ビーズ (3 に 4 g 細菌ペレットの 18 g) 100 mL の真空と 100 mL 0.22 μ m ボトル上部フィルターを使用して水でそれらをすすいでください。
		<ol><li>50 mL のチューブで Ni NTA 樹脂ビーズの 18 g を配置し、最終巻をするためにバッファー (100 mM リン酸ナトリウム、10 mM トリス、pH 8.0、6 M グアニジン塩酸塩、pH 8) の変化の十分な量を追加 50 mL まで</li>。
			<li>常温ロッカー上で 50 分間変性バッファーのビードを平衡します</li>。
		</ol></li> <li>不溶性の残骸を削除する 5 分 16,000 x g でライセートの封入体を遠心します</li>。
		<li>平衡のビーズに上清を追加し、ペレットを破棄します</li>。
		<li>は、Ni NTA 樹脂に結合する蛋白質を許可する部屋の温度で 40 分のロッカーにミックスを入れて 。
		注: ニッケル キレート ビーズは、ニッケル親和性によって PrP を浄化するために使用されます。PrP のヒスチジン豊富な N 末端領域はニッケル イオン任意の彼タグなしにバインドする蛋白質を可能にするニッケル (ii) への親和性をレンダリングします</li>。
		<li>(A と B) の両方のラインをきれいに水で洗って FPLC</li>。
		<li>変性バッファー (100 mM リン酸ナトリウム、10 mM トリス、pH 8.0、6 M グアニジン塩酸塩、pH 8) プライム (列が添付されていない) システムに両方のライン (A および B) を実行</li>
		<li>は、列上に樹脂をロードします。気泡を最小限に抑えることを確認してください</li>。
		<li>は、FPLC に列をアタッチし、変性バッファー 0% と 100% 年末までにバッファーを巻き戻しする変性バッファー A 100% と 0% のリフォールディング バッファー B (100 mM リン酸ナトリウム、10 mM トリス、pH 8.0) 最初から線形グラデーションを実行します。この徐々 にシフトが 240 分 0.75 mL/min の流速で実行され、PrP の適切な折りたたみに必要です 。
		注: クロマトグラフィー精製過程では、変性の PrP は最初ゆっくり refolded 樹脂の変性バッファーを交換するリフォールディング バッファーの線形グラデーションを適用することによって。このステップはまたカオトロ ピック グアニジン HCl を削除します</li>。
		<li>100% リフォールディング バッファーは 0.75 mL/分でさらに 30 分間カラムを通過し続けて確認</li>
		<li>リンス水溶出バッファー (100 mM リン酸ナトリウム、10 mM トリス、500 mM のイミダゾール pH 5.8) A の行、列をバイパスします。これが AKTA における溶出バッファーと今取替えは変性バッファーが消去されます</li>。
		<li>2 mL/分リフォールディング バッファー B と 0% 溶出バッファー A 最初に巻き戻しバッファーと 100% 溶出バッファー 0% に 100% から 40 分間の線形グラデーションを実行することによってタンパク質を想定し, 浸出液 。
		注: 溶出バッファーのイミダゾールの集中は PrP を競う &#39; s、ニッケルの (ii) にバインドします。蛋白質一次ピークの溶出がグラデーションを介しての方法の約 1/3 始めるべきであります。
		<ol><li>増加する OD 280 nm のクロマト グラムを見る</li>。
		</ol></li> <li>大きなピークの中心に蛋白質を含んでいる管のみを収集します 。
		注: 各 2 mL の溶出画分は 15 mL チューブに収集されます</li>。
		<li>透析バッファー (10 mM リン酸ナトリウム, pH 5.8) の約 1/3 量 (1 mL) ですぐにチューブに含まれる蛋白質を希釈します</li>。
		<li>すぐに氷のチューブを配置</li>
		<li>チューブに含まれる溶出蛋白質をプールします</li>。
		<li>悪い透析カセット (分子量カットオフ 10 kDa) にタンパク質</li>。
		<li>は中古冷蔵透析バッファー (3.6 L) 4 ° C で 2 時間にカセットを入れ、一晩のため新鮮な透析バッファー (3.6 L) にカセットを転送します。作る透析バッファーが一定の攪拌下にあることを確認します</li>。
		<li>タンパク質を透析後注射器を用いた 0.2 μ m acrodisc シリンジ フィルターをフィルター処理します</li>。
		<li>BCA タンパク質定量キットを用いたタンパク質濃度を測定します</li>。
		<li>濃縮または希釈タンパク質濃度 0.3 mg/mL に調整する必要がある場合 。
		注: SDS ページとブルー染色で純度を確認します</li>。
		<li>マイクロ遠心チューブ用のタンパク質の 1 mL 因数を行い、すぐにさらに使用するまで-80 ° C で保存、RT QuIC プロトコルで説明されているようです</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

RT QuIC 以前尿と糞便経口感染したミュールジカとオジロジカ38エキス CWD のプリオンを検出するため採用されました。この原稿に示すシステムは、RT QuIC アッセイの適応方法です。追加の手順は、検出と CWD プリオン感染した動物の糞便材料のためのアッセイの感度を改善するために「古典的な」RT QuIC 法に取り込まれました。
糞便抽出における検出感度は RT QuIC プロトコルの改善に私たちを導いた。敏感な生体外の糞便におけるプリオンの検出を達成するために重要なステップはプリオン変換および/または伝播を妨げるし、検出感度を向上させるコンポーネントを削除するためにサンプルの準備のために追加されました。CWD 感染前臨床・臨床のエルク、播種活動を検出および糞便抽出におけるプリオン変換の検出限界を高めるために不可欠だった RT QuIC と NaPTA/sarkosyl 治療のプロトコルで基板交換を組み込む.
NaPTA 降水量は、通常を特定し検出可能なレベルに PrPScを集中 sarkosyl 抽出を伴う一般的な手法です。NaPTA は、sarkosyl は携帯無料システム44の低濃度でプリオン変換を容易にするために知られている洗剤は PrPSc好ましく沈殿させる PrPC 43以上知られています。これでアライメント、NaPTA と sarkosyl の組み合わせを使用して可能性があります収率を生成高い繊維集合体の in vitroの45,46,47の前に示すように。この方法論は、精製唾液39および全血中40の供試体で正常に末梢の CWD のプリオンを検出する RT QuIC アッセイに以前に組み込まれています。我々 の研究は、糞便のサンプル準備のプロトコルで NaPTA/sarkosyl 浄化を組み込むことできる CWD プリオン検出 RT QuIC の最初の証拠を提供します。さらに、この方法で我々 は RT QuIC アッセイの CWD 負糞便ホモジネート rPrP 基板の自発的な転換を減らすためにことができた。
基板交換30の効果を説明する潜在的なメカニズムが提案されています。(前に新鮮な基質の添加) 反応の最初のラウンドでのみ少量の種子は RT QuIC 反応に追加されます。RPrP の部分だけがシード反応に組み込まれ、基板の残りの部分がどちらか非アミロイド集合体を形成する反応プレート井戸の壁との相互作用によってや、使用が少なくを参照して変換する形式に変更します。ded RT QuIC 製品ではなく、元の種子。その結果、種 rPrP の取り込み速度が遅いと線維形成は遅れ位相で検出できません。遅れ位相でシード RT QuIC 産物は、「高速アセンブリ ステージ」に到達する最終的に細長い、プリオンより小さい総計急速握手をして分割で増幅または横の追加ことができます。この段階での反応に追加されます新鮮な基板は容易に形成不明確な集計ではなく、シード製品に組み込まれます。私達のプロトコルで基板交換ステップの設立された感度を増加する変更PrPSc前臨床動物および/または阻害化合物からの非常に低い量のサンプルでプリオン種子を検出に便利でした。
PMCA フォールディング増幅分析最初の in vitroタンパク質説明21は、いくつかの利点ではなく、RT QuIC 試金を使用してください。PMCA でチューブを培養し、; 超音波発生装置内に含まれる水浴の超音波処理超音波発生装置の周囲に配置されている管は増幅管センター 48に位置と比較しての有効性は低下を示しています。震えている RT QuIC システム コントロールが容易になるようです。96 の井戸のフォーマットの使用は、RT-QuIC、しかし、Moudjoらによって開発された mb PMCA の本当の利点49,50、同様の利点を示したが、まだ少ない PMCA で使用します。
基板として RT QuIC 使用組換え rPrP 変換;対照的に、ほとんどの場合 PMCA は正常な脳のホモジネートを使用します。さらに、RT QuIC 配列相同性は必要ありません種子と基板51-53の間。
PMCA でプリオン レプリケーションに必要な因子の存在を感染結果の製品。ただし、RT QuIC のアッセイでは、増幅された PrP は感染しません。体外増幅の試金では、PrPCの自然変換により最もおそらく偽陽性反応の発生は定期的な問題です。したがって、試金と本研究で使用される条件は、シード rPrP 変換と自然変換の違いを最大限にこのような障害を最小限に抑えるために合わせて調整されました。
結論としては、NaPTA/sarkosyl 治療糞便内アッセイ阻害剤の除去を有効にし自発的な変換を削減します。興味深いことに、治療は precipitatedPrPScの種まき活動を妨げませんでした。さらに、基板交換は付随して採用されたときで、検出の感度が大幅に改善。

プリオン病または伝染性海綿状脳症 (TSE) は、牛海綿状脳症 (BSE) 牛、スクレイピー羊とヤギ、無駄に慢性的な人間のクロイツ フェルト ・ ヤコブ病 (CJD) を含む神経変性疾患シカ科1,2病 (CWD)。Tse は、特徴的な海綿状外観と脳のニューロンの損失によって特徴付けられます。「タンパク質のみ」の仮説によれば、プリオンは主に PrPSc (スクレイピーの ' Sc') 3、PrPCホストでエンコードされたプリオン蛋白変性アイソ フォーム成る。PrPScは PrPCのバインドし、他の PrPC分子に変換するシードとして機能できる ᵦ シート4,5,6の濃縮形態への変換に起因します。新しく生成された PrPSc分子は小さいオリゴマー、感染核の高い数値で結果に分解成長ポリマー 7、8に組み込まれます。PrPSc集計しやすいプロテアーゼ9,10に部分的に耐性があります。
CWD に影響を与える野生と養殖のエルク (Cervus canadensis)、ミュールジカ (ジューテリウム ドルノゴビ)、オジロジカ (WTD;ジューテリウムで子鹿) (Alces alces) ムースやトナカイ (となかい座 tarandus tarandus) 11,12,13。それはシカの相互作用と感染14,15の環境の永続性によって支持される水平伝播と最も伝染のプリオン病と見なされます。その他プリオン PrPSc蓄積と感染が脳に限られているとは異なり CWD にこれらにも、末梢組織や体液など唾液、尿、糞便16,17,18。
免疫組織化学は、CWD PrPSc分布と海綿状病変19,20を検出する診断のゴールド スタンダードと見なされます。ELISA よりまれに、西部のしみ CWD 診断に使われまた。したがって、現在のプリオン病の診断は主に事後組織でプリオンを検出に基づいています。CWD の殺診断は、扁桃腺や直腸肛門粘膜関連リンパ組織 (RAMALT) バイオプシー;ただし、このプロシージャは侵襲性があり、動物の捕獲が必要です。したがって、尿や糞便などの簡単にアクセスできる検体の使用は、CWD プリオン検出のための実用的な方法でしょう。しかし、これら糞尿港プリオン現在診断法の検出限界値以下の濃度が比較的低い。その結果より高感度・高スループットの診断ツールが必要です。変換システムの in vitroタンパク質フォールディング繰返し増幅など分析 (PMCA) 21、アミロイド播種法とリアルタイムで揺れる誘起変換 (RT QuIC) 試金22,23,24はプリオン変換プロセス体外を模倣する PrPScの自己増殖する能力を悪用し、それによりごく微量検出レベル25 に PrPScの存在を増幅する非常に強力なツール ,26。RT QuIC 法はただし、変換製品の β シートの二次構造の濃縮が thioflavin T (Th T) をバインドできる具体的事実を活用します。したがって、組み換え PrP (rPrP) シードの変換時に、バインド Th T と、検出できるリアルタイムで Th T 時間をかけて相対的な蛍光ユニット (RFU) として表現の蛍光を測定することによってアミロイド線維に生えています。監視、RFU は相対的な播種活動と遅れ位相など定量的パラメーターを評価する使用できます。遅れ位相は、どの rPrP Th T 蛍光の検出限界値以下は反応の早い段階で変換のしきい値に到達するために必要な時間 (h) を表します。明らかラグの段階では、十分なアミロイド核 (核/伸び) の形成に付随の終わりは、Th T 蛍光閾値レベルを超えているし、ポジティブになるときに発生します。アミロイド線維は実際の時間と初期の PrPScやサンプルに含まれているシードの活動で検出できるの成長はより多くの種を生成するセグメンテーションによって増幅されます。これらの種は順番、アミロイド線維の成長の急速な指数段階を誘発します。
この試金は低 1 として検出することができるので PrPSc 24fg、感度の高い資格様々 な末梢組織、排泄物や他の PrPScを検出することにより、事前事後分析や非侵襲的診断を達成するためにこのテクニック感染性の低レベルをかくまっている標本の種類。RT QuIC 再現性、実用性、速さ (50 h 未満)、生物検定と比較して低コストで他のアッセイの利点を間違いなく提供します。PMCA; で使用される超音波処理など技術的な複雑さを回避します。また、各ウェルのエアロゾル汚染の危険性を最小にするテープ ・ シールのマイクロ プレートでそれを行います。複数井戸のフォーマット実験では同じ最大 96 サンプルの解析が可能。 にします。偽陽性の問題を再発と生体外の試金の変換 rPrP の自発的な転換に対抗するには、RT QuIC でしきい値 (カットオフ) の実装に便利です。確かに、ネガティブ コントロール (否定的なサンプル +5 SD 27の平均 RFU) の結果に基づき、基準を設定するから正と負のサンプル間の差別を行うことができます。各サンプルの 4 つの複製の使用はこうして複製の少なくとも 50%、肯定的な信号を示すとき肯定的なサンプルの定義に助けることができる、すなわちカットオフ28を渡ります。例えば以前の研究ではハムスター rPrP 発見されたヒトの PrPvCJDの相同の基板と比較してより敏感な基板にシードし、羊スクレイピー シード反応、RT-QuIC でシードと基板との間の相同性は必要ありません。29. ハムスター羊キメラ rPrP も人間 rPrP 30人間バリアント CJD プリオンを検出するよりもより適して基板に示唆されました。したがって、rPrP 基板上の異なる種からの使用は、この試金で非常に一般的です。この試金は散発的な CJD 31,32,33, gen などのいくつかのプリオン病に正常に適用されています。エティックのプリオン疾患34BSE 35,36,37、スクレイピー 23,36,40,4139,CWD 38、、、 42。用いた研究処理髄液、全血、唾液、尿 RT QuIC で種子が40,4139,PrPSc 38、、、を検出するすべての成功したも42アミロイド線維形成阻害剤を含む血漿などのサンプルで検出能力を育成する Orrú et al.。(2011)Scの PrP の免疫沈降 (IP) ステップと RT quic 社によるアミロイド線維形成阻害剤を削除するための戦略を開発、「quic 社強化」の試金 (eQuIC) の名前。さらに、基板交換の手順は、感度を向上させるために反応時間 〜 24 時間後採用されました。最終的には、として低 1 として PrPScの ag eQuIC 30によって検知されました。
糞便抽出物を浄化し、糞便中に可能なアッセイの阻害剤を削除、するために糞便経口感染実験にエルクから前臨床、臨床段階で収集された洗剤とプロテアーゼ阻害剤を含むバッファーで均質化されました。糞便抽出物は、ナトリウム リンタングステン酸アルゼンチンタンゴダンスプロフェッショナル降水による蛋白質の沈殿物を利用したサンプルの PrPScを集中する異なる方法論をさらに堤出されました。最初 Safarらによって記述された NaPTA 沈殿法43, を使用して、テスト サンプルに PrPScを集中します。PrPCよりもむしろ PrPScの優遇の沈殿物のサンプルの結果と NaPTA のインキュベーション。ただし、分子メカニズムはまだ明らかではありません。このステップはまたを含む、いくつかのケースで観察される rPrP の自発的な変換を防ぐことを助けた。最後に、糞便抽出物は、最適化された RT-QuIC 基板としてマウス rPrP (aa 23-231) を使用して、プロトコルに基板交換を含む検出の感度を改善するために、テストされました。
ここでの結果は、この改良法 CWD プリオンの非常に低い集中を検出することができますなり、検出と糞便 NaPTA 降水量と基板交換せずプロトコルと比較して特異性の感度を示します。このメソッドは、可能性のある他の組織や体液に適用することができます、野生と飼育下のシカ科の CWD 監視のための偉大な使用することができます。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc seringe filters</td><td>PALL</td><td>4652</td><td></td></tr><tr><td>amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit</td><td>Millipore</td><td>UCF901024</td><td></td></tr><tr><td>BD 10 ml seringe</td><td>VWR</td><td>CA75846-842</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Corning bottle-top vacuum filters</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431118</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS M Tube</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Guanidine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) broth</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12780029</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15502048</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ML9150</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K</td><td>PALL</td><td>OD100C34</td><td></td></tr><tr><td>Nunc sealing tapes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>232702</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor tablet</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Calbiochem</td><td>7910-OP</td><td></td></tr><tr><td>sodium phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>496626</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin T</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Triton-100</td><td>Calbiochem</td><td>9410-OP</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Commercial buffers and solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BugBuster Master Mix</td><td>Nogagen</td><td>71456-4</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow</td><td>Qiagen</td><td>1018401</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X)</td><td>Life Technoligies</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Distilled Water</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Standards and commercial kits&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Express Autoinduction System 1</td><td>Novagen</td><td>71300-4</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment setup&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA protein purification systems FPLC</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman Avanti J-25 Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman rotor JA-25.50</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman rotor JA-10</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega microplate reader</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sofware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MARS Data Analysis</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism6</td><td>GraphPad software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

real-time quaking-induced conversion assay for detection of cwd prions in fecal material

RT QuIC 法は、機密性の高い体外無細胞プリオン増幅試金シードの折りたたみと変換のためテンプレートとしてプリオン種子を用いた組換えプリオン蛋白質 (PrP) 基板の集計は主に基づいています。RT QuIC はリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) に類似しているスループットの高い手法です。アミロイド線維の成長の検出は、Thioflavin T は、ᵦ シート豊富なタンパク質との特異的相互作用時に蛍光を発する色素に基づいています。したがって、アミロイド線維形成をリアルタイムで検出することができます。糞便抽出物の慢性消耗病 (CWD) プリオンを検出するための信頼性の高い非侵襲的なスクリーニング テストの開発を試みた。ここでは、我々 は具体的には PrPSc CWD の糞便内活動を播種感染シカ科を明らかにする RT QuIC 法を適応しています。当初、我々 は準備糞便抽出物の播種活動だった糞便材料の潜在的なアッセイの阻害によって RT-QuIC で比較的低かった。糞便抽出物の播種活動を改善し、潜在的なアッセイの阻害剤を削除は、洗剤とプロテアーゼ阻害剤を含むバッファーに糞便を均質化。また、ナトリウム リンタングステン酸と遠心力を使用して蛋白質の沈殿物に基づいて PrPScを集中する方法をサンプルを提出しました。最後に、糞便抽出物は、最適化された RT-QuIC 基板交換を検出の感度を改善するためにプロトコルに含まれてによって調べた。したがって、我々 は RT QuIC、CWD の非侵襲的診断のための実用的なツールをすることができますでの前臨床・臨床のシカ科の糞便内活動を播種 CWD プリオンの高感度検出のためのプロトコルを確立しました。

検出の感度は低い27まだ CWD 糞便抽出液 10% (w/v) を用意していた RT QuIC 反応を播くことできます。具体的な取得することを許可鹿 rPrP 結果27のではなく、糞便の均質化の特定のバッファーを使用していたマウス rPrP 基板の使用する併用 RT QuIC 反応の高いバック グラウンド蛍光を避けるために重要なステップ。NaPTA 沈殿物の添加は、増幅反応 (図 2) のシードの活性を阻害することがなく rPrP RT QuIC (図 1) での自発的な転換を削減しました。NaPTA 治療に優れた増幅を認めた CWD 正糞便サンプルの結果の蛍光信号がまだ低い (図 1)。さらに、いくつかのサンプルのプリオンの増幅低蛍光レベル一定高原に達して。RPrP の劣化/変性または rPrP プール30を消費する経路を団粒形成に起因することができます反応の飽和状態を示します。さらにプリオンの増幅と検出の感度を強化、基板交換の手順はプロトコルに組み込まれました。RT QuIC プロトコル (図 2) に基板交換の導入増加感度 (77% RT QuIC の 14 のうち 18 サンプルされた肯定的な) と特異性 (100%; RT QuIC になって肯定的で否定的なコントロールのどれも) の検出 (を参照してくださいチェンらからテーブル 127) します。 最後に、これらのすべての手順 (図 3) は、CWD プリオン感染性の低レベルを含む試験片を用いた RT QuIC 検出のための信頼性と機密性の高いプロトコルの最適化につながった。
基板交換は RT QuIC 反応の最初の 25 時間後に導入された、反応を補充することで新鮮な基板と新鮮な蛍光を含むバッファー染料 Th t.プロトコルで基板交換手順を導入し、RT QuIC の反応時間は 75 時間 50 h から延長されました。基板交換定款を図 2に示すとおり、プリオンの増幅率の有意な改善を認めた.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56373/56373fig1.jpg"> 
図 1: RT QuIC でマウス rPrP 基板の自然変換シード精製 CWD 負糞便ホモジネートと。非感染エルク (C181-006) やミュールジカの糞便の乳剤が最終濃度 10% (w/v) を得るために糞便抽出バッファーで均質化されました。浄化、これらの糞便の乳剤で処理、NaPTA 沈殿物によって集中される 10 回。Unpurified 糞便ホモジネート (、)、NaPTA 精製、濃縮フォーム (b) 示される、希釈は, RT QuIC 反応基質としてマウス rPrP のシードに使用されました。Y 表示 Th T 蛍光の相対的な単位、横軸は反応時間を描きます。自発的なコンバージョンの削減は、NaPTA 精製糞便 (b) で見られました。チェンらから使用するデータ27.<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56373/56373fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56373/56373fig2.jpg"> 
図 2。基板交換を使用して糞 CWD プリオンの検出の改善。CWD プリオンに感染 (C051 05, 05 C052) 個々 のエルクの糞便のホモジネート精製、NaPTA 沈殿物によって集中されます。NaPTA 処理を希釈した 2 x 10-1 2 x 10-3種子, RT QuIC 反応マウス rPrP 基板に使用する間。50 h または 75 h (b) の長期の潜伏期間で基板交換の通常期間で基板交換 (、) なし RT QuIC アッセイを行った後者のため基板交換は RT QuIC 反応の最初の 25 時間後導入されました。反応量の 90% を除去し、作りたて rPrP 基板と Th t. を含む RT QuIC 反応混合物に置き換えプロトコルの基板交換の手順を紹介、75 h チェンらから使用するデータ、RT QuIC の反応時間が 50 h から延長されました。27.<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56373/56373fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56373/56373fig3.jpg"> 
図 3: フロー図 CWD 感染シカ科から PrPSc糞便抽出を記述して、RT QuIC を使用してアクティビティとプリオンの増幅をシード アッセイします。CWD 感染動物の糞便、糞便抽出バッファーで均質化された、NaPTA 沈殿法に提出し、RT QuIC 法によるテストします。後者は、基板交換手順を導入することによって行われました。NaPTA と基板交換の手順の定款は、省自然変換と播種性プリオンの増幅の強力な改善で起因しました。<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56373/56373fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

ここでは、単純な高速かつ効率的なプリオンの増幅技術、リアルタイムで揺れる誘起変換 (RT QuIC) メソッドを記述するプロトコルを提案する.

リアルタイム揺れる誘起変換用糞便材料の CWD プリオンの検出

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

real-time-quaking-induced-conversion-assay-for-detection-cwd-prions

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.5K ビュー.  University of Calgary. ここでは、単純な高速かつ効率的なプリオンの増幅技術、リアルタイムで揺れる誘起変換 (RT QuIC) メソッドを記述するプロトコルを提案する.

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Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such as Chronic Wasting Disease (CWD) of cervids and scrapie in sheep. The Prion hypothesis asserts that this abnormal conformer constitutes most or all of the infectious prion. The role of the immune system in early events in peripheral prion pathogenesis has been convincingly demonstrated for CWD and scrapie 1-3. Transgenic and pharmacologic studies in mice revealed an important role of the Complement system in retaining and replicating prions early after infection 4-6. In vitro and in vivo studies have also observed prion retention by dendritic cells 7-10, although their role in trafficking remains unclear 11-16. Macrophages have similarly been implicated in early prion pathogenesis, but these studies have focused on events occurring weeks after infection 3,11,17. These prior studies also suffer from the problem of differentiating between endogenous PrPC and infectious prions. Here we describe a semiquantitative, unbiased approach for assessing prion uptake and trafficking from the inoculation site by immune cells recruited there. Aggregated prion rods were purified from infected brain homogenate by detergent solubilization of non-aggregated proteins and ultracentrifugation through a sucrose cushion. Polyacrylamide gel electrophoresis, coomassie blue staining and western blotting confirmed recovery of highly enriched prion rods in the pelleted fraction. Prion rods were fluorochrome-labeled then injected intraperitoneally into mice. Two hours later immune cells from peritoneal lavage fluid, spleen and mediastinal and mesenteric lymph nodes were assayed for prion rod retention and cell subsets identified by multicolor flow cytometry using markers for monocytes, neutrophils, dendritic cells, macrophages and B and T cells. This assay allows for the first time direct monitoring of immune cells acquiring and trafficking prions in vivo within hours after infection. This assay also clearly differentiates infectious, aggregated prions from PrPC normally expressed on host cells, which can be difficult and lead to data interpretation problems in other assay systems. This protocol can be adapted to other inoculation routes (oral, intravenous, intranervous and subcutaneous, e.g.) and antigens (conjugated beads, bacterial, viral and parasitic pathogens and proteins, egg) as well.

Here we describe a novel assay for monitoring prion uptake and trafficking by immune cells immediately following intraperitoneal inoculation by purifying and fluorescently labeling aggregated prion rods from infected brain material then monitoring their uptake and movement from the injection site and characterizing the cells mediating these events.

腹腔内感染後に免疫細胞の人身売買蛍光プリオンロッドの時間を監視

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such ...

免疫・感染学

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Prions are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein has two distinct isoforms, the non-infectious host-encoded protein (PrPC) and the infectious protein (PrPSc), an abnormally-folded isoform of PrPC 8.
One of the challenges of working with prion agents is the long incubation period prior to the development of clinical signs following host inoculation13. This traditionally mandated long and expensive animal bioassay studies. Furthermore, the biochemical and biophysical properties of PrPSc are poorly characterized due to their unusual conformation and aggregation states.
PrPSc can seed the conversion of PrPC to PrPSc in vitro14. PMCA is an in vitro technique that takes advantage of this ability using sonication and incubation cycles to produce large amounts of PrPSc, at an accelerated rate, from a system containing excess amounts of PrPC and minute amounts of the PrPSc seed19. This technique has proven to effectively recapitulate the species and strain specificity of PrPSc conversion from PrPC, to emulate prion strain interference, and to amplify very low levels of PrPSc from infected tissues, fluids, and environmental samples6,7,16,23 .
This paper details the PMCA protocol, including recommendations for minimizing contamination, generating consistent results, and quantifying those results. We also discuss several PMCA applications, including generation and characterization of infectious prion strains, prion strain interference, and the detection of prions in the environment.

Protein misfolding cyclic amplification (PMCA) is an in vitro assay for the study of prion conversion and strain and species barriers. It can also be used as a prion detection assay.

プリオンのタンパク質のミスフォールディングサイクリック増幅

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

鳥類の消化器系を通過した後の感染プリオンを識別するための手順

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

と伝達性海綿状脳症種の障壁を評価する<em&gt;インビトロ</em&gt;プリオンタンパク質変換アッセイ

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

医学

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in research laboratories, as well as for molecular diagnosis, because of its sensitivity, specificity, and convenience. However, in most cases, the quantitative PCR (qPCR) assay generally used to detect virus infection has relied on the purification of viral nucleic acid prior to the PCR step. In this study, the fluorescence-based reverse transcription qPCR (RT-qPCR) assay is developed through the combination of a processing buffer and a one-step RT-PCR reagent so that the whole process, from the harvest of the culture supernatant of virus-infected cells until real-time detection, can be performed without viral RNA purification. The established protocol enables the quantification of a wide range of RNA concentrations of dengue virus (DENV) within 90 min. In addition, the adaptability of the direct RT-qPCR assay to the evaluation of an antiviral agent is demonstrated by an in vitro experiment using a previously reported DENV inhibitor, mycophenolic acid (MPA). Moreover, other RNA viruses, including yellow fever virus (YFV), Chikungunya virus (CHIKV), and measles virus (MeV), can be quantified by direct RT-qPCR with the same protocol. Therefore, the direct RT-qPCR assay described in this report is useful for monitoring RNA virus replication in a simple and rapid manner, which will be further developed into a promising platform for a high-throughput screening study and clinical diagnosis.

Real-time quantitative polymerase chain reaction analysis combined with reverse transcription (RT-qPCR) has been widely used to measure the level of RNA virus infections. Here we present a direct RT-qPCR assay, which does not require an RNA purification step, developed for the quantification of several RNA viruses, including dengue virus.

量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応による感染細胞の培養上清中のデング ウイルス RNA を測定

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

Quantitation of Rabies Virus in Various Bovine Brain Structures

Bovine paralytic rabies (BPR) is a form of viral encephalitis that is of substantial economic importance throughout Latin America, where it poses a major zoonotic risk. Here, our objective was to utilize a laboratory protocol to determine the relative copy number of the rabies virus (RABV) genome in different bovine brain anatomical structures using quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). qRT-PCR quantifies the specific number of gene copies present in a sample based on fluorescence emitted after amplification that is directly proportional to the amount of target nucleic acid present in the sample. This method is advantageous owing to its short duration, reduced risk of contamination, and potential to detect viral nucleic acids in different samples more easily compared to other techniques. The brains of six rabid animals were divided into six anatomical structures, namely the Ammon&#8217;s horn, cerebellum, cortex, medulla, pons, and thalamus. All brains were identified as positive for RABV antigens based on a direct immunofluorescence test. The same anatomical structures from the brains of four RABV-negative bovines were also assessed. RNA was extracted from each structure and used for qRT-PCR. An assay was performed to determine the copy numbers of RABV genes using an in vitro transcribed nucleoprotein gene. The standard curve used to quantify viral RNA exhibited an efficiency of 100% and linearity of 0.99. Analysis revealed that the cortex, medulla, and thalamus were the ideal CNS portions for use in RABV detection, based on the observation that these structures possessed the highest levels of RABV. The test specificity was 100%. All samples were positive, no false positives were detected. This method can be used to detect RABV in samples that contain low levels of RABV during diagnosis of BPR.

This protocol presents a qRT-PCR-based approach for determining the rabies virus nucleoprotein (N) gene copy number within various bovine brain anatomical structures using in vitro transcription.

各種牛脳構造における狂犬病ウイルスの定量

Bovine paralytic rabies (BPR) is a form of viral encephalitis that is of substantial economic importance throughout Latin America, where it poses a major ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

定量PCRは、ホルマリン固定、パラフィン包埋された生検組織中のサイトメガロウイルスDNAの検出のための高感度かつ迅速な方法であり、

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

生物学

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

内部陽性対照との定量的リコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイの開発

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

Prion Safety Laboratory Swipe Test

Transmission of iatrogenic prion disease has occurred from contaminated neurosurgical tools, transplant materials, and occupational exposure to prion-contaminated laboratory tools. Prions cause disease by the templated misfolding of the normal cellular form of the prion protein, PrPC, into the misfolded and pathogenic form PrPSc and are invariably fatal. Reducing iatrogenic and occupational prion transmission is challenging. First, prions can bind to and persist on surfaces for long periods of time. Second, prions are highly resistant to inactivation. Given this, surfaces can retain infectivity for long periods of time following ineffective decontamination. Not only can this pose a potential occupational risk for prion laboratory workers, but it could potentially cross-contaminate laboratory experiments utilizing sensitive prion amplification techniques. The protocol described here for a prion safety laboratory swipe test includes steps for the identification and documentation of high-traffic laboratory areas, recommended swabbing controls to ensure the validity of results, steps to identify proper responses to positive surface swabbing sites, representative results from prion swipe testing, as well as potential artifactual results. Overall, the prion safety laboratory swipe test can be implemented as part of a broader prion safety program to assess decontamination of surfaces, monitor common spaces for prion contamination, and implement the documentation of prion decontamination status.

A method to assess commonly used areas in laboratory settings for prion contamination and effective decontamination is lacking. The protocol described here provides key fundamentals for implementing a laboratory prion safety swipe test that can easily be modified to meet the individual needs of specific laboratories.

プリオン安全研究所 スワイプ試験

Transmission of iatrogenic prion disease has occurred from contaminated neurosurgical tools, transplant materials, and occupational exposure to ...

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). These neurodegenerative diseases affect humans and several animal species and include scrapie, zoonotic bovine spongiform encephalopathy (BSE), chronic wasting disease of cervids (CWD), and the newly identified camel prion disease (CPD). Diagnosis of TSEs relies on immunodetection of PrPSc by application of both immunohistochemistry (IHC) and western immunoblot methods (WB) on encephalon tissues, namely, the brainstem (obex level). IHC is a widely used method that uses&#160;primary antibodies (monoclonal or polyclonal) against antigens of interest in cells of a tissue section. The antibody-antigen binding can be visualized by a color reaction that remains localized in the area of the tissue or cell where the antibody was targeted. As such, in prion diseases, as in other fields of research, the immunohistochemistry techniques are not solely used for diagnostic purposes but also in pathogenesis studies. Such studies involve detecting the PrPSc patterns and types from those previously described to identify the new prion strains. As BSE can infect humans, it is recommended that biosafety laboratory level-3 (BSL-3) facilities and/or practices are used to handle cattle, small ruminants, and cervid samples included in the TSE surveillance. Additionally, containment and prion-dedicated equipment are recommended, whenever possible, to limit contamination. The PrPSc IHC procedure consists of a formic acid epitope-demasking step also acting as a prion inactivation measure, as formalin-fixed and paraffin-embedded tissues used in this technique remain infectious. When interpreting the results, care must be taken to distinguish non-specific immunolabeling from target labeling. For this purpose, it is important to recognize artifacts of immunolabeling obtained in known TSE-negative control animals to differentiate those from specific PrPSc immunolabeling types, which can vary between TSE strains, host species, and prnp genotype, further described herein.

Immunolabeling abnormal prion protein using immunohistochemistry protocols requires specific sample and anti-PrP antibody preparation methodologies. The present protocol describes the key steps in epitope demasking to ensure proper PrP immunolabeling and to minimize non-specific background staining. Also, this approach considers biosafety measures when conducting immunohistochemistry studies with the prion-infected tissues.

リアルタイム揺れる誘起変換用糞便材料の CWD プリオンの検出

要約

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この動画の章

腹腔内感染後に免疫細胞の人身売買蛍光プリオンロッドの時間を監視

プリオンのタンパク質のミスフォールディングサイクリック増幅

鳥類の消化器系を通過した後の感染プリオンを識別するための手順

と伝達性海綿状脳症種の障壁を評価する

量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応による感染細胞の培養上清中のデングウイルス RNA を測定

各種牛脳構造における狂犬病ウイルスの定量

定量PCRは、ホルマリン固定、パラフィン包埋された生検組織中のサイトメガロウイルスDNAの検出のための高感度かつ迅速な方法であり、

内部陽性対照との定量的リコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイの開発

プリオン安全研究所スワイプ試験

免疫組織化学による異常プリオンタンパク質の検出

リアルタイム揺れる誘起変換用糞便材料の CWD プリオンの検出

要約

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腹腔内感染後に免疫細胞の人身売買蛍光プリオンロッドの時間を監視

プリオンのタンパク質のミスフォールディングサイクリック増幅

鳥類の消化器系を通過した後の感染プリオンを識別するための手順

と伝達性海綿状脳症種の障壁を評価する

量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応による感染細胞の培養上清中のデング ウイルス RNA を測定

各種牛脳構造における狂犬病ウイルスの定量

定量PCRは、ホルマリン固定、パラフィン包埋された生検組織中のサイトメガロウイルスDNAの検出のための高感度かつ迅速な方法であり、

内部陽性対照との定量的リコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイの開発

プリオン安全研究所 スワイプ試験

免疫組織化学による異常プリオンタンパク質の検出

量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応による感染細胞の培養上清中のデングウイルス RNA を測定

プリオン安全研究所スワイプ試験