Os autores agradecem Ruth Zelkha, MS, por sua assistência generosa em imagem. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Clínica de Desenvolvimento Scientist Award K12EY021475 para mim, conceder R01 EY024349-01A1 a ARD, EY01792 concessão núcleo do National Eye Institute, NIH, e um donativo incondicional da Pesquisa para prevenir a cegueira. ARD é o destinatário de um Prémio Carreira de Desenvolvimento de Pesquisa para prevenir a cegueira.

Todos os procedimentos realizados em animais em conformidade com a Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia declarações para o uso de animais em pesquisa visão. Quatorze quatro a 6J de seis meses de idade, macho / fêmea C57BL / tipo selvagem foram utilizados: dez ratos para o modelo de lesão e quatro como animais de controlo (córneas sem ferimentos). 1. Preparação de animais <ol><li> Anestesiar um rato com uma injecção intraperitoneal de 100 mg / kg de cetamina e 5 mg / kg de mistura de xilazina. Após a anestesia começou a produzir efeitos, apertar o dedo do pé para confirmar a profundidade da anestesia; o animal não deve reagir. </li><li> Inspecione o olho sob uma lâmpada de fenda antes de realizar os experimentos para verificar a ausência de qualquer lesão da córnea anterior. </li><li> Instilar uma gota de cloridrato de tetracaína a 1% para o olho. Depois de 60-90 segundos, teste do reflexo corneal para confirmar a ausência de sensação. Anestalcon 0,5% pode ser usado em seu lugar. </li><li> Quando a perda de sensibilidade da córnea édeterminado, suavemente colocar uma gota de 5% de povidona-iodo no olho e no cabelo em torno do olho. Limpe a queda após 1 min ou espalhá-lo sobre o cabelo ao redor do olho para evitar que o cabelo de interferir com a ponta da ferramenta. </li></ol> 2. Equipamento abrasivo do epitélio corneano <ol><li> Usar luvas cirúrgicas e um vestido. Prepare as ferramentas necessárias: uma rebarba rotativa estéril e um par de pinças estéreis. Para um melhor controle, use uma pinça dobrados. Coloque as ferramentas em uma folha esterilizada durante o procedimento. </li><li> Usando a pinça dobrados, estabilizar o olho, agarrando as tampas do lado nasal e gentilmente proptosing o olho. Evitar o uso de muita pressão. </li><li> Sob um microscópio cirúrgico, fazer a barba 360 ° ao redor da área de limbo duas vezes utilizando a broca rotativa estéril. Vá ao redor do limbo com uma velocidade de 5-6 segundos por rodada. NOTA: A broca tem uma velocidade fixa. No entanto, para que o mesmo rode à velocidade estabelecida, a &quot;porca final&quot; deve ser completamente apertados. </li><li> Remover todo o epitélio corneano do limbo a limbo com a rebarba giratória. Para melhores resultados, mover a ferramenta de forma circular e prendê-lo de alguma forma paralela à superfície da córnea para trabalhar com a face lateral da ponta da mesma. Tome cuidado para não ferir o estroma por não re-escovar as áreas onde o epitélio já foi removido. Não aplique pressão sobre o olho. Limpe a ponta do pincel conforme necessário. </li><li> Instilar uma gota de tampão fosfato estéril sobre a córnea e limpe as folhas epiteliais isolada com um tecido de limpeza macio. </li><li> Raspar o epitélio remanescente, se alguma. </li><li> Preste atenção para a cauda do rato durante a cirurgia. NOTA: Se ocorrer qualquer movimento, a profundidade da anestesia se desvaneceu e mais injeção é necessária. Um terço a dois terços do volume injectado primária deve ser suficiente. Não overdose do animal com a medicação anestésica. </li><li> Esterilizar todas as ferramentas antes de usá-los em outro olho. </li></ol> 3. Confirmar remoção epitelial completa <ol><li> Aplicar uma gota de 1 mg / ml de fluoresceína de sódio sobre a córnea. Limpe a córnea após 30 seg e examiná-lo sob um microscópio com um filtro azul cobalto para verificar a completa remoção do epitélio. NOTA: As áreas de córnea com defeitos epiteliais são visualizados em verde. </li></ol> 4. Pós-operação Cuidados <ol><li> Coloque o animal em um cobertor de aquecimento e mantê-lo em um lugar seguro (por exemplo, em sua gaiola), enquanto em recuperação. Não manter um animal inconsciente na companhia de os conscientes. </li><li> Aplicar uma pomada oftálmica% eritromicina. Isso também irá prevenir o ressecamento dos olhos. Continuar a aplicação da diária de antibiótico por uma semana. </li><li> Injectar 0,1 mg / kg de buprenorfina por via subcutânea, após o procedimento e novamente após 12 horas. Continuar a injecção duas vezes por dia durante dois dias. </li><li> Observar o animal durante 30 - 45 min, até a recuperação completa da anestesia. NOTA: Movimento suave dos músculos respiratórios na superfície ventral indica bem-estar animal enquanto em recuperação. </li></ol>

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The authors declare that they have nothing to disclose.

Este artigo descreve uma técnica reproduzível e relativamente simples para criar um modelo de mouse LSCD. Há vários aspectos importantes deste modelo que são dignos de nota. Em primeiro lugar, ao contrário dos modelos que usam produtos químicos 11, 12, a lesão envolve primariamente o epitélio de superfície (e membrana basal), com danos mínimos para o estroma corneano subjacente ou para outras estruturas intra-oculares. Assim, existe apenas a inflamação limitada e cicatrizes, ambos os quais podem complicar o processo e torná-lo mais difícil de avaliar os resultados de quaisquer intervenções que visam as células-tronco do limbo. Um recente estudo interessante por Li et al. 10, que compara a utilização da broca rotativa com diferentes combinações de tratamentos cirúrgicos e químicos, também descobriram a rebarba de ser mais seguro e mais eficaz na criação de LSCD em coelhos. Em segundo lugar, o modelo parece ser estável durante pelo menos três meses até 1. A criação deste modelo envolve o uso dea broca rotativa, um instrumento que é familiar para os clínicos que trabalham com a córnea, bem como para aqueles que fazem estudos rato ferimento. Sua vantagem sobre usando uma espátula crua é que a lesão é mais uniforme e reprodutível 1. Para melhor destruir as células estaminais do limbo, a área de limbo, foi tratada duas vezes. Com base em experiências de trabalho em olhos de rato, o tratamento de mais do que duas rondas frequentemente abrades vasos sanguíneos do limbo e provoca o sangramento. No caso da técnica é usada em outros animais, este passo pode ser modificado dependendo da espessura do epitélio da córnea. Neste estudo, uma ferramenta motorizada com uma ponta da rebarba de 0,5 mm foi utilizada; dicas rebarba em outras formas e tamanhos também estão disponíveis e podem ser utilizados em vez disso, dependendo das especificações da córnea e do tamanho do olho. Li et al. 10 relataram a broca de 2,5 mm para ser adequado para remover consistentemente e epitélios da córnea de coelho limbo. Para se obter a óptimaresultado, epitélios do limbo e da córnea foram raspada em uma forma circular e foi usado o lado lateral da broca. Para evitar que os pêlos de interferir com a ponta da ferramenta, a queda de povidona-iodo foi espalhada sobre o cabelo em torno do olho, em vez de ser apagado. A ferramenta não deve ser operado estaticamente em um ponto, pois isso pode causar perfuração. Tratar o limbo em um ritmo muito lento pode resultar em sangramento; uma velocidade de quase 6 segundos por rodada é adequado para um olho de rato C57BL / 6J. É fundamental para evitar a re-escovar o estroma nua, pois isso irá induzir mais inflamação e opacificação do estroma. A pressão não deve ser aplicada ao olho para desgastar por abrasão, enquanto o epitélio. Após o procedimento, a córnea foi corada com corante de fluoresceína para se certificar de remoção completa epitelial. É importante evitar a secura ocular durante a recuperação animal. Limitações são que esta técnica não é possível remover 100% das células estaminais. É também um pouco dependente do operador e requer prática para dar coresultados nsistent. Ao estudar o fenótipo epitelial da córnea, toda a coloração de montagem é a melhor maneira de avaliar o resultado deste modelo. Isto é porque permite que todo o epitélio corneano a ser avaliado ao mesmo tempo, ao passo que secções transversais daria apenas informações sobre cada secção particular. Esta técnica pode induzir controlável LSCD em ratinhos, e provavelmente em outros animais bem. Ele fornece um modelo adequado de LSCD para estudar novos tratamentos e descobrir aspectos mais amplos da fisiopatologia da doença. Com algumas alterações, pode ser útil no estudo de cicatrização da córnea de feridas, angiogénese, linfangiogénese e bem.

O epitélio corneano é necessária para manter a clareza ea integridade da córnea. É constantemente renovada ao longo da vida através das células estaminais epiteliais que residem no limbo-uma zona estreita na junção da córnea e da conjuntiva. Estas células estaminais do limbo auto-renovação desempenham um papel crucial na regeneração do epitélio da córnea, tanto normalmente e após a lesão. esgotamento parcial ou total destas células estaminais irão resultar em erosões corneanas recorrentes, dor, cicatrização da córnea e neovascularização, a aparência das células caliciformes, e, se deixados sem tratamento cegueira, da córnea. Esta condição é conhecida como deficiência límbica (LSCD) e pode ser idiopática; hereditária; ou adquirida devido a lesões químicas ou térmicas, lentes de contacto prolongado desgaste, e inflamação crônica 1-6. Investigação sobre LSCD exige um modelo animal adequado que não imita apenas a doença em seres humanos, mas é reprodutível e sustentável, com o mínimo ummontagem de prejuízo para outras estruturas da córnea e oculares. Este modelo é necessário avaliar tratamentos e esclarecer os mecanismos da doença em níveis moleculares e celulares. Tal como descrito antes 1, com a utilização de uma broca rotativa, pode-se facilmente desenvolver um modelo de ratinho de LSCD que apresenta as vantagens acima mencionadas e persiste durante pelo menos três meses. O objetivo deste estudo é apresentar um modelo simples, reprodutível e sustentável do rato de LSCD. A broca rotativa é uma ferramenta útil que remove uniformemente o epitélio sem ferir o estroma subjacente 1. Ele tem sido usado para induzir a erosão da córnea central 7, 8 em estudos de cicatrização de feridas. A técnica apresentada, ora para criar LSCD em um mouse não tem sido relatada antes. Anteriormente introduzidos métodos de raspagem do epitélio com um resultado espátula romba num menos uniforme lesão, particularmente no limbo e um fenótipo mais variável 1, 9, com mais restauração óepitélio normal da córnea f 1. Ao contrário do raspador sem corte, a broca rotativa elimina a membrana basal epitelial bem como 7, 8, 10. Outros métodos descritos para separar as células estaminais envolvem a utilização de produtos químicos, tais como hidróxido de sódio, n-heptanol, e cloreto de benzalcónio, o que não só pode induzir lesão indesejada para estruturas oculares subjacentes, mas também pode levar a inflamação significativa e subsequente opacificação da córnea ou metaplasia escamosa epitelial 11-15. A rebarba de rotação não está associado a estas complicações graves. A remoção cirúrgica do epitélio do limbo, sozinho ou com o uso de produtos químicos 10, 11, 16, é mais difícil de realizar e não é a melhor opção em animais com pequenas olhos e um epitélio do limbo fina (como ratos). Além disso, surpreendentemente, limbectomy pode ainda deixar algum do epitélio do limbo para trás 10. A técnica descrita abaixo irá resultar em LSCD com uma neovascularizaçãod conjuntivalização que imita a apresentação de LSCD completa em pacientes e tem a duração de pelo menos três meses 1. É apropriado para aqueles que pretendem estudar LSCD ou fisiopatologia cicatrização de feridas, imunologia e potenciais tratamentos em ratinhos. Possivelmente, com algumas modificações, este procedimento pode ser realizado em ratos ou coelhos 10. À medida que a rebarba rotativo remove eficientemente o epitélio, ele pode ser utilizado em qualquer pesquisa relativos à abrasão da córnea epitelial / ferimento e em qualquer tratamento relacionada ou estudos de biologia molecular.

<table><tbody><tr><td>Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover&amp;nbsp;</td><td>Rumex International Co, Clearwater, FL</td><td>16-141</td><td>0.5 mm burr. Also available from other companies.</td></tr><tr><td>Surgical microscope</td><td>Wild Heerbrugg, Switzerland</td><td>Wild M691</td><td></td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>Nikon, Thailand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon FS-2 slit lamp</td><td>Nikon, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal anti-CK12 antibody</td><td>Santa Cruz Blotechnology, CA,</td><td>SC-17101</td><td>1:100 concentration</td></tr><tr><td>Monoclonal anti-CK8 antibody</td><td>TROMA-I-s, Iowa City, IA</td><td>AB_531826</td><td>1:50 concentration</td></tr></tbody></table>

a simple mechanical procedure to create limbal stem cell deficiency in mouse

deficiência límbica (LSCD) é um estado de mau funcionamento ou perda de células-tronco epiteliais do limbo, após o qual o epitélio corneano é substituído por conjuntiva. Os pacientes sofrem de defeitos da córnea recorrentes, dor, inflamação, e perda de visão. Anteriormente, foi descrito um modelo de murídeo de LSCD e comparado com dois outros modelos. O objetivo era produzir um modelo de rato consistente de LSCD que ambos os imita o fenótipo em humanos e dura o tempo suficiente para torná-lo possível estudar a fisiopatologia da doença e avaliar novos tratamentos. Aqui, a técnica é descrita em mais detalhe. Uma ferramenta motorizada com uma broca rotativa foi concebida para remover os anéis de ferrugem a partir da superfície da córnea ou para suavizar a cama pterígio em pacientes. É um dispositivo adequado para criar o modelo LSCD desejado. É um fácil de usar ferramenta prontamente disponível, com uma ponta fina que torna apropriado para trabalhar em pequenos olhos, comoem ratinhos. A sua aplicação impede traumas desnecessários ao olho e que não resultam em lesões indesejadas, como é frequentemente o caso com os modelos de lesão química. Ao contrário de um raspador romba, que remove o epitélio com a membrana basal. Neste protocolo, a área límbica foi desgastada duas vezes, e então todo o epitélio corneano foi raspada do limbo a limbo. Para evitar lesões estroma, o cuidado foi tomado para não escovar a superfície da córnea uma vez que o epitélio já foi removido.

Dentro de um mês após a realização desta técnica, 100% das córneas desenvolveram neovascularização superficial (Figura 1A. As fotos foram tiradas com uma câmera conectada a uma lâmpada de fenda sob um campo brilhante e filtro azul cobalto). Em 18/20 (90%) dos olhos, neovascularização envolvida a totalidade da superfície da córnea (Figura 1A). Em 2/20 (10%), a neovascularização foi observada em três dos quatro quadrantes da córnea, mas ainda atingido o centro da córnea. Para validar o desenvolvimento de LSCD, toda a imunocoloração montagem foi realizada 1. Este passo não é uma parte do protocolo e pode ser alterada dependendo objectivos e interesses. Três variações foram consideradas como indicadores de LSCD: ausência de citoqueratina (CK) 12, um filamento intermediário específico para células epiteliais da córnea normais 17, 18; aparecimento de CK8, um marcador epitélios simples <saté&gt; 20 que não está presente na córnea normal; e presença de células caliciformes na superfície da córnea. Para avaliar o fenótipo epitelial da córnea, a imunocoloração dupla para ck12 e CK8 foi realizada em amostras inteiras de montagem de três meses após a lesão, conforme descrito anteriormente 1, 9. Existência de células caliciformes foi avaliada por MUC5AC-taça específica de células-mucina imunocoloração 1, 15, 19 45 dias após a remoção epitelial. O aparecimento de células caliciformes no tempo reduz. Para obter os melhores resultados, é importante efectuar a coloração inferior a dois meses após a lesão. Normais não lesionados, córneas expressa-ck12 um marcador específico de células epiteliais da córnea maduros 17, 18 -throughout a superfície da córnea, mas que são desprovidas de qualquer CK8 ou células caliciformes (MUC5AC) por parte da córnea de toda a amostra de montagem (Figura 1B) . Em comparação aos olhos normais, expressão ck12 é quase ausente no injur<html> y córneas modelo, enquanto eles mostram significativamente coloração positiva para CK8 e células caliciformes (Figura 1B). Estas observações indicam o desenvolvimento de LSCD. Se estiver interessado em quantificar os resultados de positividade, o uso da imagem-J para quantificar separadamente 20 densidades imunocoloração sobre as imagens originais, inalteradas tomadas pelo microscópio sob as mesmas configurações. Resumidamente, selecionar a parte da córnea de toda a amostra de montagem, medir a densidade integrada e área para aquela região, e calcular a densidade corrigido para o fundo 20. A proporção de ck12 para densidades Ck8 foram anteriormente apresentados em um maior número de amostras 1. A proporção reduzida em comparação com os controlos (córneas normais) e a aparência de células caliciformes na superfície da córnea demonstrar o desenvolvimento de LSCD. 658 / 54658fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Fenótipo da córnea após criar LSCD em camundongos. O exame com lâmpada de fenda, que mostra todas as córneas desenvolver algum grau de neovascularização de um mês (A, Barra de escala: 0,5 mM). A córnea normal expressa ck12 tudo sobre a córnea, mas é desprovido de qualquer CK8 ou células caliciformes (MUC5AC). Ck12 está ausente no modelo LSCD, enquanto CK8 e células caliciformes aparece na córnea (B, Barra de escala: 200? M). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54658/54658fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

O seguinte artigo fornece uma técnica fácil, reprodutível para efetivamente criar um modelo do rato sustentável da deficiência límbica (LSCD). Este modelo animal é útil em testar e comparar a eficácia dos tratamentos para as doenças de células estaminais do limbo.

Um procedimento mecânico simples de criar Limbal Deficiência Stem Cell no mouse

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

8.3K visualizações.  University of Illinois at Chicago.  O seguinte artigo fornece uma técnica fácil, reprodutível para efetivamente criar um modelo do rato sustentável da deficiência límbica (LSCD). Este modelo animal é útil em testar e comparar a eficácia dos tratamentos para as doenças de células estaminais do limbo. 

Vídeo: A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Estabelecimento e propagação de Tumores Humanos em Retinoblastoma Imune camundongos deficientes

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Medicina

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.

In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

Um método para Lineage Tracing de células da córnea Usando Multi-cor repórter fluorescente Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Biologia do Desenvolvimento

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene therapy in organ-cultured corneas. The diabetic corneal disease is a complication of diabetes with frequent abnormalities of corneal nerves and epithelial wound healing. We have also documented significantly altered expression of several putative epithelial stem cell markers in human diabetic corneas. To alleviate these changes, adenoviral gene therapy was successfully implemented using the upregulation of c-met proto-oncogene expression and/or the downregulation of proteinases matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) and cathepsin F. This therapy accelerated wound healing in diabetic corneas even when only the limbal stem cell compartment was transduced. The best results were obtained with combined treatment. For possible patient transplantation of normalized stem cells, an example is also presented of the optimization of gene transduction in stem cell-enriched cultures using polycationic enhancers. This approach may be useful not only for the selected genes but also for the other mediators of corneal epithelial wound healing and stem cell function.

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

Adenoviral terapia genética para Diabetic Ceratopatia: Efeitos sobre a cicatrização de feridas e Stem Cell marcador expressão em humanos Corneas Organ-cultivadas e células epiteliais Limbal

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy and stem cell transplantations have become key therapeutic tools for treating blindness resulting from retinal degenerative diseases. Several forms of autologous transplantation for age-related macular degeneration (AMD), such as iris pigment epithelial cell transplantation, have generated encouraging results, and human clinical trials have begun for other forms of gene and stem cell therapies.2 These include RPE65 gene replacement therapy in patients with Leber's congenital amaurosis and an RPE cell transplantation using human embryonic stem (ES) cells in Stargardt's disease.3-4 Now that there are gene therapy vectors and stem cells available for treating patients with retinal diseases, it is important to verify these potential therapies in animal models before applying them in human studies. The mouse has become an important scientific model for testing the therapeutic efficacy of gene therapy vectors and stem cell transplantation in the eye.5-8 In this video article, we present a technique to inject gene therapy vectors or stem cells into the subretinal space of the mouse eye while minimizing damage to the surrounding tissue.

This surgical technique illustrates the injection of gene therapy vectors and stem cells into the subretinal space of the mouse eye.

Injeção de sub-retiniana de Vetores da terapia genética e células-tronco no olho do rato

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imagem Multimodal de implante de células-tronco no sistema nervoso central de camundongos

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Neurociência

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Limbo Abordagem-Subretinal injeção de vetores virais para terapia genética em ratos Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Um método de punção de biópsia modificado para queimaduras alcalinas precisas em camundongos

Corneal and Limbal Alkali Injury Induction Using a Punch-Trephine Technique in a Mouse Model

The cornea is critical for vision, and corneal healing after trauma is fundamental in maintaining its transparency and function. Through the study of corneal injury models, researchers aim to enhance their understanding of how the cornea heals and develop strategies to prevent and manage corneal opacities. Chemical injury is one of the most popular injury models that has extensively been studied on mice. Most previous investigators have used a flat paper soaked in sodium hydroxide to induce corneal injury. However, inducing corneal and limbal injury using flat filter paper is unreliable, since the mouse cornea is highly curved. Here, we present a new instrument, a modified biopsy punch, that enables the researchers to create a well-circumscribed, localized, and evenly distributed alkali injury to the murine cornea and limbus. This punch-trephine method enables researchers to induce an accurate and reproducible chemical burn to the entire murine cornea and limbus while leaving other structures, such as the eyelids, unaffected by the chemical. Moreover, this study introduces an enucleation technique that preserves the medial caruncle as a landmark for identifying the nasal side of the globe. The bulbar and palpebral conjunctiva, and lacrimal gland are also kept intact using this technique. Ophthalmologic examinations were performed via slit lamp biomicroscope and fluorescein staining on days 0, 1, 2, 6, 8, and 14 post-injury. Clinical, histological, and immunohistochemical findings confirmed limbal stem cell deficiency and ocular surface regeneration failure in all experimental mice. The presented alkali corneal injury model is ideal for studying limbal stem cell deficiency, corneal inflammation, and fibrosis. This method is also suitable for investigating pre-clinical and clinical efficacies of topical ophthalmologic medications on the murine corneal surface.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa no tratamento e regeneração da opacidade da córnea 

This protocol describes a method to induce an accurate and reproducible corneal and limbal alkali injury in a mouse model. The protocol is advantageous as it allows for an evenly distributed injury to the highly curved mouse cornea and limbus.

Indução de lesão de córnea e límplice alcalino pela técnica punch-trephine em modelo murino

The cornea is critical for vision, and corneal healing after trauma is fundamental in maintaining its transparency and function. Through the study of ...

Visão revitalizante: terapia com células-tronco para degeneração da retina

Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal diseases at advanced stages. We have shown human recombinant retina-specific laminin isoform matrix is able to support the differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) to photoreceptor progenitors. In addition, sub-retinal injection of these cells has also shown partial restoration in the rd10 rodent and rabbit models. Sub-retinal injection is known to be an established method that has been used to deliver pharmaceutical compounds to the photoreceptor cells and retinal pigmented epithelial (RPE) layer of the eye due to its proximity to the target space. It has also been used to deliver adeno-associated viral vectors into the sub-retinal space to treat retinal diseases. The sub-retinal delivery of pharmaceutical compounds and cells in the murine model is challenging due to the constraint in the size of the murine eyeball. This protocol describes the detailed procedure for the preparation of hESC-derived photoreceptor progenitor cells for injection and the sub-retinal delivery technique of these cells in genetic retinitis pigmentosa mutant, rd10 mice. This approach allows cell therapy to the targeted area, in particular the outer nuclear layer of the retina, where diseases leading to photoreceptor degeneration occur.

Autor em destaque: Avançando na restauração da visão - terapia baseada em células-tronco para doenças da retina 

We describe a detailed protocol for the preparation of post-cryopreserved hESC-derived photoreceptor progenitor cells and the sub-retinal delivery of these cells in rd10 mice.

Liberação Sub-Retiniana de Progenitores de Fotorreceptores Derivados de Células-Tronco Embrionárias Humanas em Camundongos rd10

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal ...

Um procedimento mecânico simples de criar Limbal Deficiência Stem Cell no mouse

Resumo

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Estabelecimento e propagação de Tumores Humanos em Retinoblastoma Imune camundongos deficientes

Um método para Lineage Tracing de células da córnea Usando Multi-cor repórter fluorescente Mice

Adenoviral terapia genética para Diabetic Ceratopatia: Efeitos sobre a cicatrização de feridas e Stem Cell marcador expressão em humanos Corneas Organ-cultivadas e células epiteliais Limbal

Injeção de sub-retiniana de Vetores da terapia genética e células-tronco no olho do rato

Imagem Multimodal de implante de células-tronco no sistema nervoso central de camundongos

Limbo Abordagem-Subretinal injeção de vetores virais para terapia genética em ratos Retinal Pigment Epithelium

Indução de lesão de córnea e límplice alcalino pela técnica punch-trephine em modelo murino

Indução de lesão de córnea e límplice alcalino pela técnica punch-trephine em modelo murino

Indução de lesão de córnea e límplice alcalino pela técnica punch-trephine em modelo murino

Liberação Sub-Retiniana de Progenitores de Fotorreceptores Derivados de Células-Tronco Embrionárias Humanas em Camundongos rd10