Gli autori ringraziano Ruth Zelkha, MS, per la sua generosa assistenza nella diagnostica per immagini. Questa ricerca è stata sostenuta dal programma clinico Scientist Development Award K12EY021475 a me, concedere R01 EY024349-01A1 a ARD, nucleo concessione EY01792 dal National Eye Institute, NIH, e una sovvenzione illimitata di ricerca per la prevenzione cecità. ARD è il destinatario di un Development Award carriera da Research per prevenire la cecità.

Tutte le procedure eseguite su animali siano conformi con l&#39;Associazione per la Ricerca in Oftalmologia dichiarazioni di visione e per l&#39;uso di animali nella ricerca visione. Quattordici quattro a sei mesi di età 6J maschio / femmina C57BL / selvatici tipo sono stati utilizzati: dieci topi per il modello infortunio e quattro come animali di controllo (cornee illesi). 1. Preparazione degli animali <ol><li> Anestetizzare un mouse con un&#39;iniezione intraperitoneale di 100 mg / kg di ketamina e xilazina miscela 5 mg / kg. Dopo l&#39;anestesia ha avuto effetto, pizzicare la punta di confermare la profondità dell&#39;anestesia; l&#39;animale non dovrebbe reagire. </li><li> Controllare l&#39;occhio sotto una lampada a fessura prima di condurre gli esperimenti per verificare l&#39;assenza di qualsiasi lesione corneale precedente. </li><li> Instillare una goccia di 1% tetracaina cloridrato sull&#39;occhio. Dopo 60-90 secondi, testare il riflesso corneale per confermare l&#39;assenza di sensazione. Proparacaina cloridrato 0,5% può essere usato al posto. </li><li> Quando la perdita di sensibilità corneale ècerto, inserire delicatamente un calo del 5% iodopovidone sull&#39;occhio e sui capelli intorno all&#39;occhio. Pulire la caduta dopo 1 min o diffonderlo sui capelli intorno all&#39;occhio per evitare che i capelli di interferire con la punta dello strumento. </li></ol> 2. abrasione l&#39;epitelio corneale <ol><li> Indossare guanti chirurgici e un abito. Preparare gli strumenti necessari: una fresa rotante sterile e un paio di pinzette sterili. Per un migliore controllo, utilizzare una pinzetta piegate. Posizionare gli strumenti su un foglio sterile durante la procedura. </li><li> Utilizzando le pinzette piegate, stabilizzare l&#39;occhio afferrando i coperchi dal lato nasale e proptosing delicatamente l&#39;occhio. Evitare l&#39;uso di troppa pressione. </li><li> Sotto un microscopio operatorio, la barba di 360 ° intorno alla zona limbare due volte utilizzando la fresa rotante sterile. Andare in giro per il limbo, con una velocità di 5 - 6 secondi per ogni turno. NOTA: La fresa ha una velocità fissa. Tuttavia, per farlo ruotare alla velocità stabilita, il &quot;dado estremità&quot; deve essere completamente serrato. </li><li> Rimuovere l&#39;intero epitelio corneale dal limbus al limbo con la bava rotante. Per ottenere risultati migliori, spostare l&#39;utensile in modo circolare e tenerlo po parallelo alla superficie corneale per lavorare con il lato laterale della sua punta. Fare attenzione a non danneggiare lo stroma, non ri-spazzolare le aree in cui è già stato rimosso l&#39;epitelio. Non applicare alcuna pressione sugli occhi. Pulire la punta del pennello, come richiesto. </li><li> Instillare una goccia di sterile PBS sulla cornea e rimuovere eventuali fogli epiteliali indipendente con un panno di pulizia morbido. </li><li> Radere l&#39;epitelio rimanente, se presente. </li><li> Prestare attenzione alla coda di topo durante l&#39;intervento chirurgico. NOTA: se si verifica un movimento, la profondità dell&#39;anestesia è sbiadito ed è necessaria un&#39;ulteriore iniezione. Un terzo a due terzi del volume iniettato primario dovrebbe essere sufficiente. Non overdose l&#39;animale con il farmaco anestetico. </li><li> Sterilizzare tutti gli strumenti prima di utilizzarli su un altro occhio. </li></ol> 3. Conferma completa rimozione epiteliale <ol><li> Applicare una goccia di 1 mg / ml di sodio fluoresceina sulla cornea. Pulire la cornea dopo 30 sec ed esaminare sotto un microscopio con un filtro blu cobalto, per verificare la completa rimozione dell&#39;epitelio. NOTA: le zone corneali con difetti epiteliali sono visualizzati in verde. </li></ol> 4. Post-operazione di cura <ol><li> Mettere l&#39;animale su una coperta di riscaldamento e di conservarlo in un luogo sicuro (ad esempio, nella sua gabbia), mentre sotto di recupero. Non tenere un animale privo di sensi in compagnia di quelli coscienti. </li><li> Applicare 1% eritromicina pomata oftalmica. Questo sarà anche prevenire la secchezza oculare. Continuare l&#39;applicazione del quotidiano antibiotico per una settimana. </li><li> Iniettare 0,1 mg / kg per via sottocutanea buprenorfina dopo la procedura e dopo 12 ore. Continuare l&#39;iniezione due volte al giorno per due giorni. </li><li> Osservare l&#39;animale per 30 - 45 minuti, fino al recupero completo dall&#39;anestesia. NOTA: Il movimento lieve dei muscoli respiratori sulla superficie ventrale indica benessere degli animali, mentre sotto di recupero. </li></ol>

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The authors declare that they have nothing to disclose.

Questo articolo descrive una tecnica riproducibile e relativamente semplice per creare un modello murino di LSCD. Ci sono diversi aspetti importanti di questo modello, che sono degni di nota. Innanzitutto, a differenza modelli che utilizzano sostanze chimiche 11, 12, la lesione coinvolge principalmente l&#39;epitelio superficiale (e membrana basale), con il minimo danno al stroma corneale sottostante o ad altre strutture intraoculari. Quindi, vi è solo l&#39;infiammazione limitata e cicatrici, entrambi i quali possono complicare la procedura e rendere più difficile valutare l&#39;esito di eventuali interventi volti a le cellule staminali del limbus. Uno studio recente interessante da Li et al. 10, che confronta l&#39;utilizzo della fresa rotante con diverse combinazioni di trattamenti chirurgici e chimiche, anche trovato la fresa per essere più sicuri e più efficaci nella creazione LSCD nei conigli. In secondo luogo, il modello sembra essere stabile per almeno fino a tre mesi 1. La creazione di questo modello prevede l&#39;uso dila fresa rotante, uno strumento che è familiare a clinici che lavorano con la cornea, nonché a coloro che fanno studi topo ferimento. Il suo vantaggio rispetto all&#39;utilizzo di una spatola smussato è che la lesione è più uniforme e riproducibile 1. Per distruggere meglio le cellule staminali del limbus, la zona limbare è stato trattato due volte. Sulla base di esperienza di lavoro su occhi del mouse, il trattamento di più di due turni spesso abrades vasi sanguigni del limbus e provoca sanguinamento. Nel caso la tecnica è utilizzata in altri animali, questo passo può essere modificato a seconda dello spessore corneale epiteliale. In questo studio, un utensile motorizzato con una punta bava 0,5 mm è stato utilizzato; punte bava in altre forme e dimensioni sono disponibili e possono essere utilizzati al posto, a seconda delle specifiche della cornea e delle dimensioni degli occhi. Li et al. 10 ha riferito la bava da 2,5 mm per essere adatto per rimuovere costantemente corneale di coniglio e epiteli limbare. Per ottenere l&#39;ottimalerisultato, epiteli limbari corneali e sono state rasate in modo circolare ed è stato usato il lato laterale della bava. Per evitare che il pelo di interferire con la punta dell&#39;utensile, la caduta di povidone-iodio è stato diffuso sui capelli intorno all&#39;occhio, invece di essere cancellati. Lo strumento non deve essere utilizzato in modo statico in un punto, in quanto ciò potrebbe causare perforazione. Trattare il limbus a un ritmo molto lento può provocare sanguinamento; una velocità di quasi 6 secondi per ogni turno è adatto per un occhio topo C57BL / 6J. E &#39;fondamentale per evitare una nuova spazzolare lo stroma nuda, in modo da indurre più infiammazione e stroma opacizzazione. La pressione non deve essere applicata all&#39;occhio mentre abrasione dell&#39;epitelio. Dopo la procedura, la cornea era macchiato con fluoresceina per assicurarsi di rimozione epiteliale completa. E &#39;importante per prevenire la secchezza oculare durante il recupero degli animali. Le limitazioni sono che questa tecnica non può rimuovere il 100% delle cellule staminali. E &#39;anche un po&#39; operatore-dipendente e richiede pratica per dare corisultati nsistent. Quando si studia il fenotipo epiteliale corneale, tutto il monte colorazione è il modo migliore per valutare l&#39;esito di questo modello. Questo è perché permette l&#39;intera dell&#39;epitelio corneale da valutare contemporaneamente, mentre le sezioni trasversali sarebbe solo dare informazioni su ogni sezione particolare. Questa tecnica controllabile può indurre LSCD nei topi, e probabilmente in altri animali. Esso fornisce un modello adeguato di LSCD per studiare nuovi trattamenti e scoprire più ampi aspetti della fisiopatologia della malattia. Con alcune modifiche, può essere utile nello studio della cornea guarigione delle ferite, l&#39;angiogenesi, e linfoangiogenesi pure.

L&#39;epitelio corneale è necessaria per mantenere la chiarezza e l&#39;integrità della cornea. Si rinnova continuamente per tutta la vita dalle cellule staminali epiteliali che risiedono nel-un limbo zona ristretta a livello della giunzione della cornea e della congiuntiva. Queste cellule staminali del limbus auto-rinnovamento svolgono un ruolo cruciale nella rigenerazione dell&#39;epitelio corneale, sia normalmente e dopo l&#39;infortunio. esaurimento parziale o completa di queste cellule staminali si tradurrà in erosioni corneali ricorrenti, dolore, cicatrici corneali e la neovascolarizzazione, comparsa di cellule calice, e se non trattata, la cecità corneale. Questa condizione è nota come la carenza di cellule staminali limbari (LSCD) e può essere idiopatica; ereditaria; o acquisita a causa di infortuni chimici o termici, lenti a contatto a lungo termine indossare, e infiammazione cronica 1-6. La ricerca sulle LSCD richiede un modello animale adatto che non solo imita la malattia negli esseri umani, ma è riproducibile e sostenibile, con il minimo di unmonte di lesioni ad altre strutture corneali e oculari. Questo modello è necessario valutare i trattamenti e per chiarire i meccanismi della malattia a livello molecolare e cellulare. Come descritto in precedenza 1, con l&#39;uso di una fresa rotante, si può facilmente sviluppare un modello murino di LSCD che offre i vantaggi suddetti e persiste per almeno tre mesi. L&#39;obiettivo di questo studio è quello di presentare un modello semplice, riproducibile e sostenibile del mouse di LSCD. La bava di rotazione è un pratico strumento che rimuove in modo uniforme l&#39;epitelio senza ferire lo stroma sottostante 1. È stato usato per indurre erosione corneale centrale 7, 8 in studi guarigione di ferite. La tecnica presente-presentato per creare LSCD in un topo non è stato riportato in precedenza. Precedentemente introdotto metodi di raschiare l&#39;epitelio con un risultato spatola smussato in meno uniforme infortuni particolarmente al limbus e un fenotipo più variabile 1, 9, con più o ristorazionef normale epitelio corneale 1. Diversamente il raschietto smussato, la fresa rotante rimuove la membrana basale dell&#39;epitelio e 7, 8, 10. Altri metodi riportati di sever cellule staminali comportano l&#39;uso di sostanze chimiche, quali idrossido di sodio, n-eptanolo, e cloruro di benzalconio, che non solo può indurre lesioni indesiderato strutture oculari sottostanti, ma può anche portare a infiammazione significativa e successiva opacizzazione corneale o epiteliali metaplasia squamosa 11-15. La bava di rotazione non è associata a queste gravi complicazioni. Rimuovere chirurgicamente l&#39;epitelio limbare, da solo o con l&#39;uso di prodotti chimici 10, 11, 16, è più difficile da eseguire e non è l&#39;opzione migliore in animali con occhi piccoli e un sottile epiteli limbare (come topi). Inoltre, a sorpresa, limbectomy può ancora lasciare un po &#39;dell&#39;epitelio limbare dietro 10. La tecnica di seguito descritta comporta LSCD con neovascolarizzazione und conjunctivalization che imita la presentazione di completa LSCD in pazienti e dura per almeno tre mesi 1. E &#39;adatto per coloro che mirano a studiare LSCD o ferite fisiopatologia guarigione, immunologia, e potenziali trattamenti nei topi. Possibilmente, con alcune modifiche, questa procedura può essere eseguita in ratti o conigli 10. Come la fresa rotante rimuove efficacemente l&#39;epitelio, può essere utilizzato in ogni ricerca di pertinenza corneale epiteliale all&#39;abrasione / ferimento e in qualsiasi trattamento correlata o studi di biologia molecolare.

<table><tbody><tr><td>Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover&amp;nbsp;</td><td>Rumex International Co, Clearwater, FL</td><td>16-141</td><td>0.5 mm burr. Also available from other companies.</td></tr><tr><td>Surgical microscope</td><td>Wild Heerbrugg, Switzerland</td><td>Wild M691</td><td></td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>Nikon, Thailand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon FS-2 slit lamp</td><td>Nikon, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal anti-CK12 antibody</td><td>Santa Cruz Blotechnology, CA,</td><td>SC-17101</td><td>1:100 concentration</td></tr><tr><td>Monoclonal anti-CK8 antibody</td><td>TROMA-I-s, Iowa City, IA</td><td>AB_531826</td><td>1:50 concentration</td></tr></tbody></table>

a simple mechanical procedure to create limbal stem cell deficiency in mouse

carenza di cellule staminali limbari (LSCD) è uno stato di malfunzionamento o la perdita delle cellule staminali epiteliali limbari, dopo di che l&#39;epitelio corneale viene sostituito con congiuntiva. I pazienti che soffrono di difetti ricorrenti corneali, dolore, infiammazione, e la perdita della vista. In precedenza, un modello murino di LSCD stato descritto e confrontato con altri due modelli. L&#39;obiettivo era quello di produrre un modello di topo consistente di LSCD che entrambi imita il fenotipo negli esseri umani e dura abbastanza a lungo da permettere di studiare la fisiopatologia della malattia e per valutare nuovi trattamenti. Qui, la tecnica è descritta in dettaglio. Uno strumento motorizzato con una fresa rotante è stato progettato per rimuovere gli anelli di ruggine dalla superficie corneale o per lisciare il letto pterigio nei pazienti. Si tratta di un dispositivo atto a creare il modello LSCD desiderato. È facilmente disponibile, facile da usare con una punta fine che lo rende adatto per la lavorazione di piccoli occhi, comenei topi. La sua applicazione evita inutili traumi all&#39;occhio e non comporti lesioni indesiderati, come spesso accade con i modelli danno chimico. Al contrario di un raschietto smussato, rimuove l&#39;epitelio con la membrana basale. In questo protocollo, la zona limbare è stata abrasa due volte, e quindi l&#39;intero epitelio corneale è stato rasato dal limbus al limbus. Per evitare lesioni stroma, si è avuto cura di non spazzolare la superficie della cornea una volta che l&#39;epitelio è già stato rimosso.

Nel giro di un mese dopo l&#39;esecuzione di questa tecnica, il 100% delle cornee sviluppato neovascolarizzazione superficiale (Figura 1A. Le foto sono state scattate con una macchina fotografica collegata ad una lampada a fessura sotto un campo chiaro e blu cobalto filtro). In 18/20 (90%) degli occhi, neovascolarizzazione coinvolto l&#39;intera superficie della cornea (Figura 1A). In 2/20 (10%), neovascolarizzazione è stata osservata in tre dei quattro quadranti corneali, ma ancora raggiunto il centro della cornea. Per convalidare lo sviluppo di LSCD, tutto il monte immunocolorazione è stata effettuata 1. Questa fase non è una parte del protocollo e può essere modificato a seconda degli obiettivi e interessi. Tre varianti sono stati considerati come indicatori di LSCD: assenza di citocheratina (CK) 12, un filamento intermedio specifico normali cellule epiteliali corneali 17, 18; aspetto di CK8, un semplice marcatore epiteli <sup&gt; 20 che non è presente sulla cornea normale; e la presenza di cellule caliciformi sulla superficie corneale. Per valutare il fenotipo epiteliale corneale, doppio immunostaining per CK12 e CK8 è stato eseguito su campioni interi montare tre mesi dopo l&#39;infortunio, come descritto in precedenza 1, 9. Esistenza delle cellule Goblet è stata valutata mediante MUC5AC-calice specifiche cellule mucina-immunocolorazione 1, 15, 19 45 giorni dopo la rimozione dell&#39;epitelio. La comparsa di cellule caliciformi riduce nel tempo. Per i migliori risultati, è importante effettuare la colorazione meno di due mesi dopo la ferita. Normale, cornee illesi espresso CK12-un marker specifico di mature cellule epiteliali corneali 17, 18 -throughout la superficie corneale, ma privi di CK8 o calice cellule (MUC5AC) da parte della cornea di tutto campioni di montaggio (Figura 1B) . In confronto ad occhi normali, espressione CK12 è quasi assente in injur<html> y cornee modello, mentre mostrano in modo significativo colorazione positiva per CK8 e calice cellule (Figura 1B). Queste osservazioni indicano lo sviluppo di LSCD. Se siete interessati a quantificare i risultati di immunoistochimica, Usa immagine-J per quantificare separatamente 20 densità immunoistochimica sulle immagini originali, inalterati prese dal microscopio sotto le stesse impostazioni. In breve, selezionare la parte della cornea dell&#39;intero campione monte, misurare la densità integrata e un&#39;area per quella regione, e calcolare la densità corretta per lo sfondo 20. Il rapporto di CK12 a densità CK8 stati precedentemente presentato su un numero maggiore di campioni 1. Il rapporto ridotto rispetto ai controlli (cornee normali) e la comparsa di cellule caliciformi sulla superficie corneale dimostrano lo sviluppo di LSCD. 658 / 54658fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Fenotipo corneale dopo la creazione LSCD nei topi. L&#39;esame con lampada a fessura mostra che tutte le cornee di sviluppare un certo grado di neovascolarizzazione di un mese (A, Barra di scala: 0.5 mm). Una cornea normale esprime CK12 tutta la cornea, ma è priva di qualsiasi CK8 o cellule caliciformi (MUC5AC). CK12 è assente nel modello LSCD, mentre CK8 e calice cellule appaiono sulla cornea (B, Barra di scala: 200 micron). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54658/54658fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

Il seguente articolo fornisce un facile, tecnica riproducibile per creare efficacemente un modello sostenibile del mouse di carenza di cellule staminali limbari (LSCD). Questo modello animale è utile in fase di test e confrontando l&#39;efficacia dei trattamenti per le malattie di cellule staminali del limbus.

Una semplice procedura meccanica per creare Limbal carenza Stem Cell in mouse

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

a-simple-mechanical-procedure-to-create-limbal-stem-cell-deficiency

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

8.3K Views.  University of Illinois at Chicago.  Il seguente articolo fornisce un facile, tecnica riproducibile per creare efficacemente un modello sostenibile del mouse di carenza di cellule staminali limbari (LSCD). Questo modello animale è utile in fase di test e confrontando l'efficacia dei trattamenti per le malattie di cellule staminali del limbus. 

Video: A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Istituzione e Propagazione dei Tumori retinoblastoma umani in topi privi di sistema immunitario

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Ricerca

Medicina

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.

In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

Un metodo per Lineage Tracing di cellule corneali Utilizzando multicolori topi reporter fluorescente

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Biologia dello sviluppo

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene therapy in organ-cultured corneas. The diabetic corneal disease is a complication of diabetes with frequent abnormalities of corneal nerves and epithelial wound healing. We have also documented significantly altered expression of several putative epithelial stem cell markers in human diabetic corneas. To alleviate these changes, adenoviral gene therapy was successfully implemented using the upregulation of c-met proto-oncogene expression and/or the downregulation of proteinases matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) and cathepsin F. This therapy accelerated wound healing in diabetic corneas even when only the limbal stem cell compartment was transduced. The best results were obtained with combined treatment. For possible patient transplantation of normalized stem cells, an example is also presented of the optimization of gene transduction in stem cell-enriched cultures using polycationic enhancers. This approach may be useful not only for the selected genes but also for the other mediators of corneal epithelial wound healing and stem cell function.

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

Adenovirale Terapia genica per diabetici cheratopatia: Effetti sulla guarigione delle ferite e Stem Cell Marker Expression in Human Organ cornee-coltura e le cellule epiteliali Limbal

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy and stem cell transplantations have become key therapeutic tools for treating blindness resulting from retinal degenerative diseases. Several forms of autologous transplantation for age-related macular degeneration (AMD), such as iris pigment epithelial cell transplantation, have generated encouraging results, and human clinical trials have begun for other forms of gene and stem cell therapies.2 These include RPE65 gene replacement therapy in patients with Leber's congenital amaurosis and an RPE cell transplantation using human embryonic stem (ES) cells in Stargardt's disease.3-4 Now that there are gene therapy vectors and stem cells available for treating patients with retinal diseases, it is important to verify these potential therapies in animal models before applying them in human studies. The mouse has become an important scientific model for testing the therapeutic efficacy of gene therapy vectors and stem cell transplantation in the eye.5-8 In this video article, we present a technique to inject gene therapy vectors or stem cells into the subretinal space of the mouse eye while minimizing damage to the surrounding tissue.

This surgical technique illustrates the injection of gene therapy vectors and stem cells into the subretinal space of the mouse eye.

Iniezione sottoretinico di vettori di terapia genica e cellule staminali nel Eye mouse

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imaging multimodale impianto di cellule staminali nel sistema nervoso centrale di topi

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Neuroscienze

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Limbare Approccio-sottoretinico iniezione di vettori virali per la terapia genica nei topi retina epitelio pigmentato

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Un metodo di punzone per biopsia modificato per ustioni alcaline precise nei topi

Corneal and Limbal Alkali Injury Induction Using a Punch-Trephine Technique in a Mouse Model

The cornea is critical for vision, and corneal healing after trauma is fundamental in maintaining its transparency and function. Through the study of corneal injury models, researchers aim to enhance their understanding of how the cornea heals and develop strategies to prevent and manage corneal opacities. Chemical injury is one of the most popular injury models that has extensively been studied on mice. Most previous investigators have used a flat paper soaked in sodium hydroxide to induce corneal injury. However, inducing corneal and limbal injury using flat filter paper is unreliable, since the mouse cornea is highly curved. Here, we present a new instrument, a modified biopsy punch, that enables the researchers to create a well-circumscribed, localized, and evenly distributed alkali injury to the murine cornea and limbus. This punch-trephine method enables researchers to induce an accurate and reproducible chemical burn to the entire murine cornea and limbus while leaving other structures, such as the eyelids, unaffected by the chemical. Moreover, this study introduces an enucleation technique that preserves the medial caruncle as a landmark for identifying the nasal side of the globe. The bulbar and palpebral conjunctiva, and lacrimal gland are also kept intact using this technique. Ophthalmologic examinations were performed via slit lamp biomicroscope and fluorescein staining on days 0, 1, 2, 6, 8, and 14 post-injury. Clinical, histological, and immunohistochemical findings confirmed limbal stem cell deficiency and ocular surface regeneration failure in all experimental mice. The presented alkali corneal injury model is ideal for studying limbal stem cell deficiency, corneal inflammation, and fibrosis. This method is also suitable for investigating pre-clinical and clinical efficacies of topical ophthalmologic medications on the murine corneal surface.

Autore in primo piano: Avanzamento della ricerca nel trattamento e nella rigenerazione dell'opacità corneale 

This protocol describes a method to induce an accurate and reproducible corneal and limbal alkali injury in a mouse model. The protocol is advantageous as it allows for an evenly distributed injury to the highly curved mouse cornea and limbus.

Induzione di lesioni alcaline corneali e limbari utilizzando una tecnica punch-trephine in un modello murino

The cornea is critical for vision, and corneal healing after trauma is fundamental in maintaining its transparency and function. Through the study of ...

Vista rivitalizzante: terapia con cellule staminali per la degenerazione retinica

Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal diseases at advanced stages. We have shown human recombinant retina-specific laminin isoform matrix is able to support the differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) to photoreceptor progenitors. In addition, sub-retinal injection of these cells has also shown partial restoration in the rd10 rodent and rabbit models. Sub-retinal injection is known to be an established method that has been used to deliver pharmaceutical compounds to the photoreceptor cells and retinal pigmented epithelial (RPE) layer of the eye due to its proximity to the target space. It has also been used to deliver adeno-associated viral vectors into the sub-retinal space to treat retinal diseases. The sub-retinal delivery of pharmaceutical compounds and cells in the murine model is challenging due to the constraint in the size of the murine eyeball. This protocol describes the detailed procedure for the preparation of hESC-derived photoreceptor progenitor cells for injection and the sub-retinal delivery technique of these cells in genetic retinitis pigmentosa mutant, rd10 mice. This approach allows cell therapy to the targeted area, in particular the outer nuclear layer of the retina, where diseases leading to photoreceptor degeneration occur.

Autore in primo piano: Miglioramento del ripristino della vista - Terapia basata su cellule staminali per le malattie della retina 

We describe a detailed protocol for the preparation of post-cryopreserved hESC-derived photoreceptor progenitor cells and the sub-retinal delivery of these cells in rd10 mice.

Somministrazione sottoretinica di progenitori di fotorecettori derivati da cellule staminali embrionali umane in topi rd10

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal ...

Una semplice procedura meccanica per creare Limbal carenza Stem Cell in mouse

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Istituzione e Propagazione dei Tumori retinoblastoma umani in topi privi di sistema immunitario

Un metodo per Lineage Tracing di cellule corneali Utilizzando multicolori topi reporter fluorescente

Adenovirale Terapia genica per diabetici cheratopatia: Effetti sulla guarigione delle ferite e Stem Cell Marker Expression in Human Organ cornee-coltura e le cellule epiteliali Limbal

Iniezione sottoretinico di vettori di terapia genica e cellule staminali nel Eye mouse

Imaging multimodale impianto di cellule staminali nel sistema nervoso centrale di topi

Limbare Approccio-sottoretinico iniezione di vettori virali per la terapia genica nei topi retina epitelio pigmentato

Induzione di lesioni alcaline corneali e limbari utilizzando una tecnica punch-trephine in un modello murino

Induzione di lesioni alcaline corneali e limbari utilizzando una tecnica punch-trephine in un modello murino

Induzione di lesioni alcaline corneali e limbari utilizzando una tecnica punch-trephine in un modello murino

Somministrazione sottoretinica di progenitori di fotorecettori derivati da cellule staminali embrionali umane in topi rd10