저자는 영상에서 그녀의 관대 한 지원, 루스 Zelkha, MS 감사합니다. 이 연구는 ME에 임상 과학자 개발 프로그램 상 K12EY021475에 의해 지원되었다, ARD, 국립 안과 연구소, NIH, 그리고 실명을 방지하기 위해 연구에서 무제한 부여에서 핵심 보조금 EY01792에 R01의 EY024349-01A1을 부여합니다. ARD 연구에서 실명 예방에 대한 경력 개발 상을받는 사람입니다.

동물에서 수행 모든 절차는 비전 연구에서 동물 사용을위한 비전 및 안과 문 연구 협회을 준수합니다. 6 개월 된 남성 / 여성 C57BL / 6J 야생형 마우스에 열네 4 ~ 사용 하였다 : 열 부상 모델 쥐와 대조군 4 개의 (unwounded 각막을). 1. 동물 준비 <ol><li> 는 A 100 ㎎ / ㎏의 케타민 복강 내 주사, 5 밀리그램 / kg 자일 라진 혼합물로 마우스를 마취. 마취 효과를 찍은 후, 마취의 깊이를 확인하기 위해 발가락을 꼬집어; 동물은 반응하지 않아야합니다. </li><li> 이전 각막 손상의 유무를 확인하기 위해 실험을 실시하기 전에 슬릿 램프 아래에서 눈을 검사한다. </li><li> 눈 상에 1 % 염산 tetracaine에 방울을 주입. 60 후 - 90 초, 감각의 부재를 확인하기 위해 각막 반사를 테스트합니다. Proparacaine 염산염 0.5 %를 대신 사용할 수있다. </li><li> 하면 각막 감각의 손실이특정 부드럽게 눈과 눈 주위의 머리에 5 % 포비돈 - 요오드 한 방울을 배치합니다. 1 분 후, 드롭 닦아 또는 공구 팁과 간섭 모발을 방지하기 위해 눈 주위의 머리에 확산. </li></ol> 2. 각막 상피를 연마 <ol><li> 수술 장갑과 가운을 착용 할 것. 멸균 회전 버 멸균 핀셋 : 필요한 도구를 준비합니다. 더 나은 제어를 위해, 구부러진 핀셋을 사용합니다. 절차 동안 멸균 시트에 도구를 놓습니다. </li><li> 절곡 핀셋을 사용하여, 비강 측으로부터 덮개를 잡아 부드럽게 눈 proptosing 의해 눈을 안정화. 너무 많은 압력을 사용하지 마십시오. </li><li> 수술 현미경 배로 멸균 회전 숫돌을 사용 윤부 주변 360 면도. 라운드 당 6 초 - 5의 속도로 윤부 주위에 이동합니다. 주 : 버가 하나의 고정 속도를 가지고있다. 그러나, 기존의 속도로 회전하는 상기 &quot;최종 너트&quot;완전 체결한다. </li><li> 회전 버와 윤부하는 윤부에서 전체 각막 상피를 제거합니다. 더 나은 결과를 위해, 원형 방식으로 도구를 이동하고 각막 표면에 다소 평행의 팁의 측면에서 작동하도록 유지. 다시 칫솔질하지 않음으로써 상피 세포가 이미 제거 된 영역을 기질을 손상하지 않도록주의하십시오. 눈에 어떤 압력을 가하지 마십시오. 필요에 따라 브러쉬를 청소합니다. </li><li> 각막에 멸균 인산 완충 생리 식염수 방울을 주입하고 부드럽고 깨끗한 티슈로 모든 분리 된 상피 시트를 닦아. </li><li> 어떤 경우 나머지 상피 면도. </li><li> 수술하는 동안 마우스 꼬리에주의를 기울이십시오. 참고 : 움직임이 발생하면, 마취 깊이가 퇴색하고 추가 주입이 필요합니다. 차 주입 볼륨의 3 분의 2로 한 세 번째는 충분합니다. 마취 약물 치료와 동물을 과다 복용하지 마십시오. </li><li> 또 다른 눈에 사용하기 전에 모든 도구를 소독. </li></ol> 3. 확인 완료 상피 제거 <ol><li> 각막에 1 ㎎ / ㎖ 플루 오레 신 나트륨 한 방울을 적용합니다. 30 초 후 각막을 청소하고 상피 세포의 완전한 제거를 확인하기 위해 코발트 블루 필터를 현미경으로 검사합니다. 참고 : 상피 결손과 각막 영역이 녹색으로 가시화된다. </li></ol> 4. 후 작업 관리 <ol><li> 가열 담요에 동물을 넣고 복구 아래에있는 동안 (그 새장에, 예를 들면) 안전한 장소에 보관합니다. 의식이있는 사람의 회사에서 의식이없는 동물을 보관하지 마십시오. </li><li> 1 % 에리스로 마이신 안과 연고를 적용합니다. 이것은 또한 눈의 건조를 방지 할 수 있습니다. 응용 프로그램을 일주일 동안 항생제 매일 계속합니다. </li><li> kg 프레 노르 핀 피하 절차 후 다시 12 시간 후 / 0.1 mg을 주입한다. 이틀 동안 두 번 하루에 주사를 계속합니다. </li><li> 마취에서 완전히 회복 될 때까지 45 분 - 30 동물을 관찰한다. 노트: 복부 표면에 호흡 근육의 가벼운 운동은 복구 아래에있는 동안 동물의 건강을 나타냅니다. </li></ol>

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The authors declare that they have nothing to disclose.

이 문서는 LSCD의 마우스 모델을 만들 수있는 재생 가능한 비교적 간단한 기술에 대해 설명합니다. 주목할 가치가이 모델의 몇 가지 중요한 측면이 있습니다. 먼저, 화학 11, 12를 사용하는 모델과는 달리, 부상 주로 하부 각막 기질 또는 다른 인공 구조물을 최소화 손상 표면 상피 (및 기저막)를 포함한다. 따라서, 절차가 복잡하고 어려워 윤부 줄기 세포를 대상으로하는 간섭의 결과를 평가할 수있는 양으로 만 한정 염증 및 흉터있다. 리 등의 알에 의해 흥미로운 최근 연구. 수술, 화학 치료법의 다른 조합과 상기 회전 숫돌의 사용을 비교 (10)는 또한 안전하고 토끼 LSCD을 만드는 더 효과적 버어 알았다. 두번째 모델은 적어도 최대 세 달 1 안정적인 것으로 보인다. 이 모델 생성의 사용을 포함회전 버, 마우스 상처 연구를 수행하는 사람들에게뿐만 아니라, 각막 작업 임상의에게 친숙한 악기. 무딘 주걱을 사용을 통해 그 장점은 부상이 더 균일하고 1 재현 할 것입니다. 더 윤부 줄기 세포의 파괴, 윤부 영역 회 처리 하였다. 마우스 눈에 근무 경험을 바탕으로, 두 개 이상의 라운드의 치료는 종종 윤부 혈관을 abrades 출혈이 발생합니다. 경우에, 기술은 다른 동물들에 사용되며,이 단계는 각막 상피의 두께에 따라 수정 될 수있다. 본 연구에서는 0.5 mm 버 팁과 전동 공구를 사용 하였다; 다른 형상 및 크기의 버어 팁도 가능하며 각막 사양에 눈 크기에 따라 대신에 사용될 수있다. 리 등. 10 지속적으로 토끼의 각막과 각막 윤부 상피를 제거하기 적합하도록 2.5 mm 버를보고했다. 최적를 얻으려면결과 윤부 각막 상피는 원형 방식으로 면도하고, 버어의 측면을 사용 하였다. 공구 팁 방해 동물의 머리를 방지하기 위해, 포비돈 - 요오드 드롭 대신 닦아 존재의, 눈 주위의 머리에 확산되었다. 이 천공의 원인이 될 수 도구는, 한 자리에 정적으로 운영되어서는 안된다. 출혈이 발생할 수 있습니다 매우 느린 속도로 윤부를 처리하는 단계; 라운드 당 거의 6 sec의 속도가 C57BL / 6J 마우스의 눈에 적합하다. 이보다 염증과 기질의 혼탁을 유발하므로 다시 닦고 노출 된 기질을 방지하는 것이 중요합니다. 상피 연마하면서 압력이 눈에 적용되지 않아야한다. 절차 후, 각막은 완전한 상피 제거 확인하기 위해 형광 염료로 염색했다. 동물, 복구 중에 안구 건조를 방지하는 것이 중요하다. 제한이 방법은 줄기 세포를 100 % 제거 할 수있다. 또한 다소 운영자 의존과 협력을 제공하는 연습이 필요nsistent 결과. 각막 상피 ​​표현형을 연구 할 때, 전체 마운트 염색이 모델의 결과를 평가하는 가장 좋은 방법입니다. 이 단면에만 각각의 특정 부분에 대한 정보를주고있는 반면 전체 각막 상피는 한번 평가 될 수 있기 때문이다. 이 제어 기술은 다른 동물에서 아마 마우스에 LSCD을 유도하고 있습니다. 그것은 LSCD의 적절한 모델 소설 치료를 연구하고 질병의 병태 생리의 넓은 측면을 발견하기를 제공합니다. 약간의 변형으로, 그것뿐만 아니라 각막 창상 치유, 혈관 및 림프관을 연구에 유용 할 수있다.

각막 상피 ​​세포는 각막의 명확성 및 완전성을 유지하기 위해 필요하다. 그것은 지속적으로 각막과 결막의 교차점에서 윤부 - 좁은 영역에 존재하는 상피 줄기 세포에 의해 수명이 다할 때까지 갱신됩니다. 이러한 자기 갱신 윤부 줄기 세포는 모두 일반적으로 부상 한 후, 각막 상피의 재생에 중요한 역할을한다. 이러한 줄기 세포의 일부 또는 전체 고갈 재발 성 각막 미란, 통증, 각막 흉터 및 신생 혈관, 술잔 세포의 모양을 초래할 것이다 치료, 각막 실명을 떠나는 경우. 이 조건은 윤부 줄기 세포 결핍증 (LSCD)로 알려져 있고, 특발성 일 수있다; 유전; 나 때문에 화학 물질 또는 열 손상, 장기간 콘택트 렌즈 착용, 만성 염증 1-6에 인수했다. LSCD에 대한 연구는 적절한 동물 모델을 필요로 그뿐만 아니라 모방 인간의 질병이 있지만 최소한으로 재현 및 지속다른 각막과 안구 구조에 손상 마운트. 이 모델은 치료를 평가하는 분자 및 세포 수준에서 질병의 메커니즘을 명확하게하는 것이 필요하다. 회전 숫돌을 사용하여, 하나 앞에 설명한 바와 같이, 하나의 용이 상기의 이점을 제공하며 3 개월 이상 지속 LSCD의 마우스 모델을 개발할 수있다. 이 연구의 목표는 LSCD의 단순한 재현, 지속 가능한 마우스 모델을 제시하는 것입니다. 회전 버 균등 기본 기질 1 부상없이 상피를 제거하는 편리한 도구입니다. 이는 상처 치유 연구 각막 미란 (7, 8)을 유도하기 위해 사용되어왔다. 마우스에 LSCD를 작성하는 저작물을-제시 기술은 이전에보고되지 않았습니다. 이전보다 복원 오와 함께, 덜 유니폼 부상, 특히 윤부 및 더 많은 변수 표현형 (1), (9)에 무딘 주걱 결과와 상피를 긁어 방법을 소개F 정상 각막 상피 1. 무딘 스크레이퍼 달리 회전 버어도 7, 8, 10 등의 상피 기저막을 제거한다. 줄기 세포를 절단 할 수있는 다른보고 된 방법들은 근본적인 안구 구조에 불필요한 손상을 유도 할뿐만 아니라, 심각한 염증 및 이후 각막 혼탁 또는 원인이 아니라, 수산화 나트륨, N- 헵탄 및 염화 벤잘 코늄 등의 화학 물질의 사용을 포함 상피 편평 상피 화생 11-15. 회전 버 이러한 심각한 합병증과 연관되지 않습니다. 수술 단독으로 또는 화학 물질 10, 11, 16를 사용하여, 윤부 상피를 제거, 수행하는 것이 더 어렵다 작은 눈 (마우스 등) 얇은 각막 윤부 상피 세포와 동물에서 최고의 옵션이 아닙니다. 또한, 놀랍게도, limbectomy는 여전히 10 뒤에 윤부 상피의 일부를 남겨 둘 수 있습니다. 아래 설명 된 기술은 신생 혈관의와 LSCD가 발생합니다환자의 전체 LSCD의 프리젠 테이션을 모방하고 3 개월 이상 1 지속 개발 conjunctivalization. 이 마우스에서 LSCD 또는 상처 치유의 병태 생리, 면역학, 잠재적 인 치료를 연구하는 것을 목표로하는 사람들에게 적합하다. 아마도, 일부 수정과,이 절차는 쥐 또는 토끼 (10)에서 수행 할 수 있습니다. 상기 회전 숫돌을 효율적 상피를 제거으로서, 각막 상피는 마모 / 상처와 관련된 모든 치료 또는 분자 생물학 연구에 관한 모든 연구에 이용 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover&amp;nbsp;</td><td>Rumex International Co, Clearwater, FL</td><td>16-141</td><td>0.5 mm burr. Also available from other companies.</td></tr><tr><td>Surgical microscope</td><td>Wild Heerbrugg, Switzerland</td><td>Wild M691</td><td></td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>Nikon, Thailand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon FS-2 slit lamp</td><td>Nikon, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal anti-CK12 antibody</td><td>Santa Cruz Blotechnology, CA,</td><td>SC-17101</td><td>1:100 concentration</td></tr><tr><td>Monoclonal anti-CK8 antibody</td><td>TROMA-I-s, Iowa City, IA</td><td>AB_531826</td><td>1:50 concentration</td></tr></tbody></table>

a simple mechanical procedure to create limbal stem cell deficiency in mouse

윤부 줄기 세포 결핍증 (LSCD)가 고장 나 각막 상피는 결막로 치환 한 후, 윤부 상피 줄기 세포의 상실의 상태이다. 환자는 재발 성 각막 결함, 통증, 염증, 시력의 손실을 겪고 있습니다. 이전 LSCD의 쥐 모델을 설명하고 다른 두 모델에 비교 하였다. 목적은 두 모방 인간 표현형 및 질병의 병태 생리학 연구와 새로운 치료법을 평가하는 것을 가능하게하기에 충분히 긴 지속 LSCD 일관된 마우스 모델을 제조 하였다. 여기서,이 기술은 더 상세하게 설명한다. 회전 버와 전동 도구는 각막 표면의 녹 반지를 제거하거나 환자의 군 날개 침대를 원활하게하기 위해 설계되었습니다. 원하는 LSCD 모델을 만들 수있는 적절한 장치입니다. 그것은으로, 작은 눈에 작업에 적절하게 좋은 팁과 쉽게 사용할 수, 사용하기 쉬운 도구입니다마우스입니다. 그 응용이 눈에 불필요한 외상 방지 종종 화학적 손상 모델의 경우와 같이 그것을 원하지 않는 손상을 초래하지 않는다. 무딘 스크레이퍼 반대로, 상기 기저막과 상피 세포를 제거한다. 이 프로토콜에서, 윤부 영역은 두 번으로 연마 한 후, 전체 각막 윤부 상피에서 윤부를 면도 하였다. 기질 부상을 방지하기 위해주의 상피가 이미 제거 된 후 각막 표면을 브러시하지 않도록주의한다.

이 기술을 수행 한 후 한 달 이내에, 각막의 100 %가 피상적 인 혈관 신생 개발 (그림 1A합니다. 사진 밝은 필드와 코발트 블루 필터에서 슬릿 램프에 연결된 카메라로 촬영했다). 눈의 18/20 (90 %)에서, 혈관 신생이 전체 각막 표면 (도 1A)을 포함했다. 2/20 (10 %)에서, 혈관 신생 3-4 각막 사분면에서 관찰 되었으나, 여전히 각막 중심에 도달했다. LSCD의 발전을 확인하려면, 전체 마운트 면역 염색 1을 수행 하였다. 이 단계는 프로토콜의 일부가 아닌 목표와 관심에 따라 변경 될 수 있습니다. 세 가지 변화는 LSCD의 지표로 간주되었다 : 사이토 케라틴 (CK)의 부재 (12), 정상 각막 상피 세포 17, 18에 해당하는 중간 필라멘트; CK8의 외관, 간단한 상피 마커 <s업&gt; 정상 각막에 존재하지 않는 (20); 각막 표면에 잔 세포의 존재감. 이전 1,9 바와 같은 각막 상피 표현형을 평가하기 위해, CK12 및 CK8 이중 면역 염색은 3 개월 후 상처 전체 마운트 샘플에 대해 수행 하였다. 잔 세포의 존재는 MUC5AC-잔에 의해 평가 된 세포 특이 점액 - 면역 염색 상피 제거 다음, 19 사십오일 15 일. 술잔 세포의 출현은 시간이 감소시킨다. 최상의 결과를 위해, 부상 후에 염색 채 2 개월 수행하는 것이 중요하다. 그들이 전체 마운트 샘플의 각막 부분에 세포 (MUC5AC) 어떤 CK8없는 또는 받침 달린 명시 CK12-성숙한 각막 상피 세포 (17), 각막 표면 -throughout (18)의 특정 마커 있지만, 보통, 손상되지 않은 각막 (그림 1B) . 정상의 눈에 비해, CK12 식 injur 거의 존재하지<html> Y 모델 각막, 그들은 크게 CK8에 대한 긍정적 인 염색을 표시하고 (그림 1B)를 세포 받침 달린있다. 이러한 관찰은 LSCD의 발전을 나타낸다. 면역 염색 결과를 정량화에 관심이있는 경우, 이미지-J는 별도로 동일한 설정 아래에있는 현미경으로 촬영 한 원본, 변경되지 않은 이미지를 20 면역 염색 밀도를 정량화하기 위해 사용합니다. 요약하면, 전체 마운트 샘플의 각막 부분을 선택하는 지역의 통합 밀도와 면적을 측정하고, 배경 (20)에 대한 보정 밀도를 계산한다. CK8 밀도에 CK12의 비율은 이전에 샘플 (1)의 더 큰 수에 제시 하였다. 컨트롤과 비교하여 감소 된 비율 (정상 각막) 각막 표면의 술잔 세포의 모양 LSCD의 발전을 보여준다. 658 / 54658fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 : 마우스에 LSCD을 만든 후 각막 표현형. 슬릿 램프 검사는 모든 각막 한 달 (0.5 mm A, 스케일 바)에 의해 신생 혈관의 어느 정도를 개발하는 것을 알 수있다. 정상 각막은 모든 각막을 통해 CK12을 표현하고 있지만 CK8 또는 술잔 세포 (MUC5AC)의 결여이다. CK8와 받침 달린 세포가 각막 (200 μm의 B, 스케일 바)에 표시하는 동안 CK12는 LSCD 모델의 부재. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54658/54658fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

다음 문서에서는 효과적으로 윤부 줄기 세포 결핍 (LSCD)의 지속 가능한 마우스 모델을 만들 수있는 쉬운, 재생 가능한 기술을 제공한다. 이 동물 모델 시험 및 윤부 줄기 세포 질환에 대한 치료 효능을 비교하기에 유용하다.

간단한 기계 절차 마우스에서 윤부 줄기 세포 결핍을 만드는 방법

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

8.3K 조회수.  University of Illinois at Chicago.  다음 문서에서는 효과적으로 윤부 줄기 세포 결핍 (LSCD)의 지속 가능한 마우스 모델을 만들 수있는 쉬운, 재생 가능한 기술을 제공한다. 이 동물 모델 시험 및 윤부 줄기 세포 질환에 대한 치료 효능을 비교하기에 유용하다. 

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Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

면역 결함 마우스의 확립과 인간 Retinoblastoma 종양의 전파

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

연구

의학

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.

In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

멀티 컬러 형광 기자 마우스를 사용하여 각막 세포의 리니지 추적하는 방법

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

발생학

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene therapy in organ-cultured corneas. The diabetic corneal disease is a complication of diabetes with frequent abnormalities of corneal nerves and epithelial wound healing. We have also documented significantly altered expression of several putative epithelial stem cell markers in human diabetic corneas. To alleviate these changes, adenoviral gene therapy was successfully implemented using the upregulation of c-met proto-oncogene expression and/or the downregulation of proteinases matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) and cathepsin F. This therapy accelerated wound healing in diabetic corneas even when only the limbal stem cell compartment was transduced. The best results were obtained with combined treatment. For possible patient transplantation of normalized stem cells, an example is also presented of the optimization of gene transduction in stem cell-enriched cultures using polycationic enhancers. This approach may be useful not only for the selected genes but also for the other mediators of corneal epithelial wound healing and stem cell function.

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

당뇨병 각막에 대한 아데노 바이러스 유전자 치료 : 인간 장기 배양 각막 및 윤부 상피 세포에 상처 치유에 효과 및 세포 마커의 발현 줄기

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy and stem cell transplantations have become key therapeutic tools for treating blindness resulting from retinal degenerative diseases. Several forms of autologous transplantation for age-related macular degeneration (AMD), such as iris pigment epithelial cell transplantation, have generated encouraging results, and human clinical trials have begun for other forms of gene and stem cell therapies.2 These include RPE65 gene replacement therapy in patients with Leber's congenital amaurosis and an RPE cell transplantation using human embryonic stem (ES) cells in Stargardt's disease.3-4 Now that there are gene therapy vectors and stem cells available for treating patients with retinal diseases, it is important to verify these potential therapies in animal models before applying them in human studies. The mouse has become an important scientific model for testing the therapeutic efficacy of gene therapy vectors and stem cell transplantation in the eye.5-8 In this video article, we present a technique to inject gene therapy vectors or stem cells into the subretinal space of the mouse eye while minimizing damage to the surrounding tissue.

This surgical technique illustrates the injection of gene therapy vectors and stem cells into the subretinal space of the mouse eye.

마우스 눈에 유전자 치료 벡터와 줄기 세포의 Subretinal 주입

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

마우스의 중추 신경계에서 줄기 세포 주입의 Multimodal 이미징

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

신경과학

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

마우스 망막 색소 상피의 유전자 치료에 대한 바이러스 벡터의 윤부 접근 - 망막 주입

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

생쥐의 정확한 알칼리 연소를 위한 수정된 생검 펀치 방법

Corneal and Limbal Alkali Injury Induction Using a Punch-Trephine Technique in a Mouse Model

The cornea is critical for vision, and corneal healing after trauma is fundamental in maintaining its transparency and function. Through the study of corneal injury models, researchers aim to enhance their understanding of how the cornea heals and develop strategies to prevent and manage corneal opacities. Chemical injury is one of the most popular injury models that has extensively been studied on mice. Most previous investigators have used a flat paper soaked in sodium hydroxide to induce corneal injury. However, inducing corneal and limbal injury using flat filter paper is unreliable, since the mouse cornea is highly curved. Here, we present a new instrument, a modified biopsy punch, that enables the researchers to create a well-circumscribed, localized, and evenly distributed alkali injury to the murine cornea and limbus. This punch-trephine method enables researchers to induce an accurate and reproducible chemical burn to the entire murine cornea and limbus while leaving other structures, such as the eyelids, unaffected by the chemical. Moreover, this study introduces an enucleation technique that preserves the medial caruncle as a landmark for identifying the nasal side of the globe. The bulbar and palpebral conjunctiva, and lacrimal gland are also kept intact using this technique. Ophthalmologic examinations were performed via slit lamp biomicroscope and fluorescein staining on days 0, 1, 2, 6, 8, and 14 post-injury. Clinical, histological, and immunohistochemical findings confirmed limbal stem cell deficiency and ocular surface regeneration failure in all experimental mice. The presented alkali corneal injury model is ideal for studying limbal stem cell deficiency, corneal inflammation, and fibrosis. This method is also suitable for investigating pre-clinical and clinical efficacies of topical ophthalmologic medications on the murine corneal surface.

저자 스포트라이트: 각막 혼탁 치료 및 재생에 대한 연구 발전 

This protocol describes a method to induce an accurate and reproducible corneal and limbal alkali injury in a mouse model. The protocol is advantageous as it allows for an evenly distributed injury to the highly curved mouse cornea and limbus.

마우스 모델에서 펀치-트레핀 기술을 사용한 각막 및 변막 알칼리 손상 유도

The cornea is critical for vision, and corneal healing after trauma is fundamental in maintaining its transparency and function. Through the study of ...

시력 회복: 망막 변성을 위한 줄기세포 치료

Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal diseases at advanced stages. We have shown human recombinant retina-specific laminin isoform matrix is able to support the differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) to photoreceptor progenitors. In addition, sub-retinal injection of these cells has also shown partial restoration in the rd10 rodent and rabbit models. Sub-retinal injection is known to be an established method that has been used to deliver pharmaceutical compounds to the photoreceptor cells and retinal pigmented epithelial (RPE) layer of the eye due to its proximity to the target space. It has also been used to deliver adeno-associated viral vectors into the sub-retinal space to treat retinal diseases. The sub-retinal delivery of pharmaceutical compounds and cells in the murine model is challenging due to the constraint in the size of the murine eyeball. This protocol describes the detailed procedure for the preparation of hESC-derived photoreceptor progenitor cells for injection and the sub-retinal delivery technique of these cells in genetic retinitis pigmentosa mutant, rd10 mice. This approach allows cell therapy to the targeted area, in particular the outer nuclear layer of the retina, where diseases leading to photoreceptor degeneration occur.

저자 스포트라이트: 시력 회복의 발전 - 망막 질환을 위한 줄기세포 기반 치료 

We describe a detailed protocol for the preparation of post-cryopreserved hESC-derived photoreceptor progenitor cells and the sub-retinal delivery of these cells in rd10 mice.

rd10 마우스에서 인간 배아 줄기 세포 유래 광수용체 전구체의 망막하 전달

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal ...

간단한 기계 절차 마우스에서 윤부 줄기 세포 결핍을 만드는 방법

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면역 결함 마우스의 확립과 인간 Retinoblastoma 종양의 전파

멀티 컬러 형광 기자 마우스를 사용하여 각막 세포의 리니지 추적하는 방법

당뇨병 각막에 대한 아데노 바이러스 유전자 치료 : 인간 장기 배양 각막 및 윤부 상피 세포에 상처 치유에 효과 및 세포 마커의 발현 줄기

마우스 눈에 유전자 치료 벡터와 줄기 세포의 Subretinal 주입

마우스의 중추 신경계에서 줄기 세포 주입의 Multimodal 이미징

마우스 망막 색소 상피의 유전자 치료에 대한 바이러스 벡터의 윤부 접근 - 망막 주입

마우스 모델에서 펀치-트레핀 기술을 사용한 각막 및 변막 알칼리 손상 유도

마우스 모델에서 펀치-트레핀 기술을 사용한 각막 및 변막 알칼리 손상 유도

마우스 모델에서 펀치-트레핀 기술을 사용한 각막 및 변막 알칼리 손상 유도

rd10 마우스에서 인간 배아 줄기 세포 유래 광수용체 전구체의 망막하 전달