המחברים מודים רות Zelkha, MS, על עזרתם הנדיבה שלה בתחום ההדמיה. מחקר זה מומן על ידי פרס תכנית קליני פיתוח מדען K12EY021475 לי, להעניק R01 EY024349-01A1 כדי ARD, EY01792 מענק הליבה של העין הלאומית, NIH, וכן מענק בלתי מוגבל של מחקר כדי למנוע עיוורון. ARD הוא הנמען של פרס פיתוח קריירה של מחקר כדי למנוע עיוורון.

כל הניתוחים שבוצעו על בעלי חיים לציית האגודה למחקר בדוחות חזון עיניים לשימוש בבעלי חיים במחקר חזון. ארבע עשרה ארבע עד שישה חודשים בן זכר / נקבה C57BL / 6J סוג בר שימשו: עשר עכברים עבור דגם פציעה וארבעה כחיות מלאה (קרניות unwounded). 1. הכנת בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר עם זריקה intraperitoneal של 100 מ&quot;ג / ק&quot;ג קטמין תערובת 5 מ&quot;ג / ק&quot;ג xylazine. לאחר ההרדמה נקטה השפעה, לצבוט את בוהן כדי לאשר את עומק ההרדמה; החיה לא צריכה להגיב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את העין תחת מנורת סדק לפני ביצוע הניסויים כדי לוודא עדר כל פגיעה בקרנית קודמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחדיר טיפת hydrochloride tetracaine 1% אל מעל העין. לאחר 60 - 90 שניות, לבדוק את רפלקס הקרנית כדי לאשר את עדר התחושה. 0.5% hydrochloride Proparacaine יכול לשמש במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אובדן התחושה קרנית הואמסוימים, במקום ירידה של 5% povidone יוד על העין ועל השיער סביב העין בעדינות. תמחק את הירידה לאחר 1 דקות או למרוח אותו על השיער סביב העין כדי למנוע את השיער מלהתערב עם קצה הכלי. </li></ol> 2. כלי ליטוש האפיתל של הקרנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש להשתמש בכפפות כירורגית גלימה. הכן את הכלים הנדרשים: גרגור מסתובב סטרילית פינצטה סטרילית. עבור שליטה טובה יותר, להשתמש בפינצטה מכופף. מניחים את הכלים על גיליון סטרילי במהלך ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פינצטה הכפוף, לייצב את העין על ידי גרירה של העפעפיים מצד האף בעדינות proptosing העין. הימנע משימוש יותר מדי לחץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ כירורגי, לגלח 360 ° מסביב לאזור לימבלית פעמיים באמצעות בר מסתובב סטרילי. לך סביב לימבוס עם מהירות של 5 - 6 שניות לכל סיבוב. הערה: יש הבר מהירות אחת קבועה. עם זאת, עבור זה כדי לסובב במהירות הוקמה, &quot;אגוז הסוף&quot; יש להדק לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את אפיתל הקרנית כולה מן לימבוס כדי לימבוס עם בר מסתובב. לקבלת תוצאות טובות יותר, להזיז את הכלי בצורה מעגלית והחזק אותו במקצת במקביל פני הקרנית לעבוד עם הצד הלטרלי של קצהו. יש להיזהר שלא לפגוע stroma ידי לא מחדש צחצוח באזורים שבהם האפיתל כבר הוסר. אין ליישם את כל לחץ על העין. נקה את קצה המברשת כנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחדיר טיפת המלח שנאגר פוספט סטרילי על הקרנית ואת למחות כל גיליונות אפיתל מנותקים עם רקמות לניקוי רהיטים רכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את האפיתל הנותר, אם בכלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב זנב העכבר במהלך הניתוח. הערה: אם כל תנועה מתרחשת, את עומק ההרדמה דהה וכתב הזרקה נוספת נדרשת. שליש עד שני שלישים של נפח המוזרק העיקרי צריכה להספיק. אל יתר החיה עם תרופות ההרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את כל הכלים לפני השימוש בהם על עין נוספת. </li></ol> 3. אשר הסרת אפיתל שלמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ירידה של 1 מ&quot;ג / נתרן והעמסת מ&quot;ל על הקרנית. נקו את הקרנית לאחר 30 שניות ולבחון אותה תחת מיקרוסקופ עם פילטר כחול קובלט לאמת הסרה מלאה של האפיתל. הערה: אזורים קרניים עם מומים אפיתל הם דמיינו בירוק. </li></ol> 4. הודעת הפעולה Care <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את החיה על שמיכת חימום ולשמור אותו במקום בטוח (למשל, בתוך הכלוב שלה) תוך תחת התאוששות. אין להשאיר חית מחוסר הכרה בחברה אלה בהכרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 1% משחת עיניים אריתרומיצין. זה גם ימנע יובש בעיניים. המשך יישום ביומון אנטיביוטי במשך שבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 0.1 מ&quot;ג / ק&quot;ג עצירות תת עורי לאחר ההליך ושוב לאחר 12 שעות. המשך הזריקה פעמיים ביום למשך יומיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את חית 30 - 45 דקות, עד להחלמה מלאה מן ההרדמה. הערה: תנועה קלה של שרירי הנשימה על פני שטח הגחון מציינת בריאות חיה בזמן תחת התאוששות. </li></ol>

<ol>
	<li>Afsharkhamseh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+limbal+stem+cell+deficiency+after+mechanical+and+thermal+injuries+in+mice.">Stability of limbal stem cell deficiency after mechanical and thermal injuries in mice.</a> Exp. Eye Res. 145, 88-92 (2015).</li><li>Dor&#224;, N. J., Hill, R. E., Collinson, J. M., West, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+in+the+adult+mouse+corneal+epithelium+supports+the+limbal+epithelial+stem+cell+hypothesis+with+intermittent+periods+of+stem+cell+quiescence.">Lineage tracing in the adult mouse corneal epithelium supports the limbal epithelial stem cell hypothesis with intermittent periods of stem cell quiescence.</a> Stem Cell Res. 15 (3), 665-677 (2015).</li><li>Ahmad, S., Osei-Bempong, C., Dana, R., Jurkunas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+and+transplantation+of+human+limbal+stem+cells.">The culture and transplantation of human limbal stem cells.</a> J. Cell Physiol. 225 (1), 15-19 (2010).</li><li>Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+clinical+implementation+of+corneal+epithelial+stem+cell+therapy+for+treatment+of+unilateral+limbal+stem+cell+deficiency.">Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency.</a> Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).</li><li>Ahmad, S., Figueiredo, F., Lako, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+epithelial+stem+cells:+characterization,+culture+and+transplantation.">Corneal epithelial stem cells: characterization, culture and transplantation.</a> Regen. Med. 1 (1), 29-44 (2006).</li><li>He, H., Yiu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+therapy+for+treating+limbal+stem+cells+deficiency:+A+review+of+different+strategies.">Stem cell-based therapy for treating limbal stem cells deficiency: A review of different strategies.</a> Saudi J. Ophthalmol. 28 (3), 188-194 (2014).</li><li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+the+basement+membrane+enhances+corneal+wound+healing.">Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing.</a> Exp Eye Res. 93 (6), 927-936 (2011).</li><li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals.">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Exp. Eye Res. 121, 178-193 (2014).</li><li>Amirjamshidi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+fibroblast+conditioned+media:+a+non-invasive+treatment+for+limbal+stem+cell+deficiency.">Limbal fibroblast conditioned media: a non-invasive treatment for limbal stem cell deficiency.</a> Mol. Vis. 17, 658-666 (2011).</li><li>Li, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+AlgerBrush+II+rotating+burr+as+a+tool+for+inducing+ocular+surface+failure+in+the+New+Zealand+White+rabbit.">Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit.</a> Exp. Eye Res. 147, 1-11 (2016).</li><li>Ti, S. E., Anderson, D., Touhami, A., Kim, C., Tseng, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+outcome+following+transplantation+of+ex+vivo+expanded+limbal+epithelium+on+amniotic+membrane+for+total+limbal+deficiency+in+rabbits.">Factors affecting outcome following transplantation of ex vivo expanded limbal epithelium on amniotic membrane for total limbal deficiency in rabbits.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43 (8), 2584-2592 (2002).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+chemically+burned+rat+corneal+surface+by+bone+marrow-derived+human+mesenchymal+stem+cells.">Reconstruction of chemically burned rat corneal surface by bone marrow-derived human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 24 (2), 315-321 (2006).</li><li>Bu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+activated+omental+cells+on+rat+limbal+corneal+alkali+injury.">Effects of activated omental cells on rat limbal corneal alkali injury.</a> Exp. Eye Res. 121, 143-146 (2014).</li><li>Luengo Gimeno, F., Lavigne, V., Gatto, S., Croxatto, J. O., Correa, L., Gallo, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+corneal+stem-cell+transplantation+in+rabbits+with+severe+ocular+alkali+burns.">Advances in corneal stem-cell transplantation in rabbits with severe ocular alkali burns.</a> J. Cataract Refract. Surg. 33 (11), 1958-1965 (2007).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+limbal+stem+cell+deficiency+induced+by+topical+medication+with+the+preservative+benzalkonium+chloride.">A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).</li><li>Huang, A. J., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+epithelial+wound+healing+in+the+absence+of+limbal+epithelium.">Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32 (1), 96-105 (1991).</li><li>Liu, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cornea-specific+expression+of+K12+keratin+during+mouse+development.">Cornea-specific expression of K12 keratin during mouse development.</a> Curr. Eye Res. 12 (11), 963-974 (1993).</li><li>Nakatsu, M. N., Gonz&#225;lez, S., Mei, H., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+limbal+mesenchymal+cells+support+the+growth+of+human+corneal+epithelial+stem/progenitor+cells.">Human limbal mesenchymal cells support the growth of human corneal epithelial stem/progenitor cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (10), 6953-6959 (2014).</li><li>Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+goblet+cells+and+their+niche:+implications+for+corneal+stem+cell+deficiency.">Corneal goblet cells and their niche: implications for corneal stem cell deficiency.</a> Stem Cells. 30 (9), 2032-2043 (2012).</li><li>McCloy, R. A., Rogers, S., Caldon, C. E., Lorca, T., Castro, A., Burgess, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+inhibition+of+Cdk1+in+G+2+phase+overrides+the+SAC+and+decouples+mitotic+events.">Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events.</a> Cell Cycle. 13, 1400-1412 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have nothing to disclose.

מאמר זה מתאר טכניקה לשחזור ופשוט יחסית ליצור מודל עכבר של LSCD. ישנם כמה היבטים חשובים של מודל זה כי ראוי לציין. ראשית, מודלים בניגוד המשתמשות בכימיקלים 11, 12, הפציעה כרוכה בעיקר האפיתל פני השטח (ו קרום במרתף), עם ניזק מינימאלי stroma הקרני הבסיסי או למבנים תוך עיניים אחרות. לפיכך, יש דלקת מוגבלת בלבד וצלקות, אשר שניהם יכולים לסבך את ההליך ולעשות את זה יותר קשה להעריך את התוצאה הסופית של כל התערבויות שמטרתן תאי גזע limbal. מחקר אחרון מעניין ידי ואח Li. 10, אשר משווה את השימוש בר מסתובב עם שילובים שונים של טיפולים כירורגיים וכימיים, גם מצאו את הבר להיות בטוח ויעיל יותר ביצירת LSCD בארנבונים. שנית, המודל נראה יציב לפחות עד שלושה חודשים 1. יצירת מודל זה כרוך בשימושהזמזום מסתובב, מכשיר מוכר לרופאים שעובדים עם הקרנית, כמו גם לאלה שעושים מחקרים ופציעתם עכבר. יתרונו על פני בעזרת מרית בוטה הוא כי הפגיעה היא יותר אחידה 1 לשחזור. כדי להיטיב להשמיד את תאי הגזע לימבלית, באזור לימבלית טופלה פעמיים. בהתבסס על ניסיון בעבודה על עיני עכבר, טיפול של יותר משני סיבובים לעתים קרובות מגרד לי כלי דם לימבלית וגורם לדימום. במקרה הטכניקה משמשת בבעלי חיים אחרים, צעד זה עשוי להיות שונה בהתאם לעובי אפיתל הקרנית. במחקר זה, כלי ממונע עם טיפ בר 0.5 מ&quot;מ נוצל; טיפים ברים בצורות וגדלים אחרים זמינים גם וניתן להשתמש בו במקום, בהתאם למפרט קרני על גודל עין. Li et al. 10 דיווח על בר 2.5 המ&quot;מ מתאים לשמש להסיר ארנב קרני בעקביות epithelia לימבלית. כדי להשיג את אופטימליepithelia מכך, לימבלית ו הקרני גולח בצורה מעגלית והצד לרוחב של הבר היה בשימוש. כדי למנוע שיער בעלי חיים מלהתערב עם קצה הכלי, הירידה povidone- יוד נפרשה על השיער סביב העין, במקום להיות ומחה. הכלי לא צריך להיות מופעל באופן סטטי במקום אחד, מאחר והדבר עלול לגרום ניקוב. טיפול לימבוס בקצב מאוד איטי יכול לגרום לדימום; במהירות של כמעט 6 שניות לכל סיבוב מתאים עין עכבר C57BL / 6J. זה קריטי כדי למנוע מחדש צחצוח stroma החשוף, כמו זה יהיה לגרום יותר דלקות opacification stroma. לחץ אין להחיל את העין תוך abrading האפיתל. לאחר ההליך, הקרנית הייתה מוכתמת צבע פלואורסצנטי לוודא הסרת האפיתל להשלים. חשוב כדי למנוע יובש בעיניים במהלך ההתאוששות מן החי. מגבלות הן כי טכניקה זו לא ניתן להסיר 100% של תאי גזע. כמו כן במידה מסוימת למפעיל תלוי דורש תרגול לתת שיתוףתוצאות nsistent. כאשר לומדים את הפנוטיפ אפיתל הקרני, כל מכתים ההר הוא הדרך הטובה ביותר להעריך את סיכויי מודל זה. זאת, משום שהיא מאפשרת האפיתל של הקרנית כולה להיבדק בבת אחת, ואילו חתכים ינתנו מידע רק על כל מקטע מסוים. טכניקה לשליטה זה יכול לגרום LSCD בעכברים, וכנראה גם חיות אחרות. הוא מספק מודל מתאים של LSCD ללמוד טיפולים חדשניים ולגלות היבטים רחבים יותר של הפתופיזיולוגיה המחלה. עם כמה שינויים, זה יכול להיות שימושי בלימוד ריפוי פצע בקרנית, אנגיוגנזה, lymphangiogenesis גם כן.

אפיתל הקרנית נדרשים בכדי לשמור על בהירות ושלמות של הקרנית. זה מתחדש כל הזמן לאורך כל החיים על ידי תאי גזע אפיתל המתגוררים לימבוס-אזור צר בצומת של הקרנית ואת לחמית. עצמי לחידוש אלה תאי גזע limbal לשחק תפקיד מכריע התחדשות אפיתל הקרנית, הוא בדרך כלל ואחרי פציעה. דלדול חלקי או מלא של תאי גזע אלה יגרום ארוזיות בקרנית חוזרת, כאב, הצטלקות קרנית נאווסקולריזציה, מראה של תאי גביע, אם אינו מטופל, עיוורון קרני. מצב זה ידוע בתור חסר בתאי גזע limbal (LSCD) ויכול להיות אידיופטית; תוֹרַשְׁתִי; או נרכש עקב פציעות כימיות או תרמית, עדשות מגע לטווח ארוכות ללבוש, וכרוני דלקת 1-6. מחקר על LSCD דורש מודל בעל חיים מתאים לו שלא רק מחקה את המחלה בבני אדם, אך ניתן לשחזור ובת קיימא, עם לפחותהר של פגיעה במבנים קרניים של עין אחרות. מודל זה יש צורך להעריך טיפולים ולהבהיר את מנגנוני המחלה ברמות מולקולרית תאית. כפי שתואר קודם לכן 1, עם השימוש של בר מסתובב, אפשר בקלות לפתח מודל עכבר של LSCD כי תכונות היתרונות הנ&quot;ל נמשך לפחות שלושה חודשים. מטרת מחקר זה היא להציג מודל עכבר פשוט, לשחזור, ובר-קיימא של LSCD. נהמתם מסתובבת הוא כלי שימושי זה שווה מסיר האפיתל מבלי לפצוע את stroma הבסיסית 1. זה כבר נעשה שימוש כדי לגרום לשחיקה קרנית מרכזית 7, 8 במחקרי ריפוי פצע. הטכניקה-המובאת כאן ליצור LSCD בעכבר טרם דווחה בעבר. בעבר הציג שיטות של גירוד האפיתל עם תוצאה מרית בוטה במדי פחות פציעה-במיוחד בבית לימבוס-ו פנוטיפ 1 משתנה יותר, 9, עם o שיקום יותררגיל ו קרני אפיתל 1. בניגוד המגרד הבוטה, הזמזום מסתובב מסיר את הקרום במרתף אפיתל כמו גם 7, 8, 10. שיטות דיווח אחרות לניתק תאי גזע לערב את השימוש בכימיקלים, כגון סודיום הידרוקסיד, n-heptanol, ו בנזלקוניום כלוריד, אשר לא רק יכול לגרום לפגיעה בלתי רצויה למבני עין בסיסיים, אלא גם עלול להוביל לדלקת משמעותית עכירות בקרנית לאחר או מטפלזיה קשקשית אפיתל 11-15. נהמתם מסתובבת אינה משויכת סיבוכים חמורים אלה. בניתוח הסרת האפיתל לימבלית, לבד או עם השימוש בכימיקלים 10, 11, 16, הוא יותר קשה לביצוע הוא לא האפשרות הטובה ביותר בחיות בעיניים קטנות epithelia לימבלית דק (כמו עכברים). בנוסף, באופן מפתיע, limbectomy עדיין עשוי להשאיר חלק האפיתל לימבלית מאחורי 10. הטכניקה המתוארת להלן תגרום LSCD עם נאווסקולריזציהד conjunctivalization המחקה את הצגת LSCD המלא בחולים ונמשך לפחות 1 שלושה חודשים. היא מתאימה למי שואף ללמוד LSCD או פתופיזיולוגיה ריפוי פצעים, אימונולוגיה, וטיפולים פוטנציאל בעכברים. ואולי, עם כמה שינויים, הליך זה יכול להתבצע אצל חולדות או ארנבות 10. כמו הבר מסתובב ביעילות מסיר את האפיתל, זה יכול להיות מנוצל בכל מחקר הנוגע שחיקה אפיתל קרנית / פציעה ובכל טיפול קשור או מחקרים בביולוגיה מולקולריים.

<table><tbody><tr><td>Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover&amp;nbsp;</td><td>Rumex International Co, Clearwater, FL</td><td>16-141</td><td>0.5 mm burr. Also available from other companies.</td></tr><tr><td>Surgical microscope</td><td>Wild Heerbrugg, Switzerland</td><td>Wild M691</td><td></td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>Nikon, Thailand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon FS-2 slit lamp</td><td>Nikon, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal anti-CK12 antibody</td><td>Santa Cruz Blotechnology, CA,</td><td>SC-17101</td><td>1:100 concentration</td></tr><tr><td>Monoclonal anti-CK8 antibody</td><td>TROMA-I-s, Iowa City, IA</td><td>AB_531826</td><td>1:50 concentration</td></tr></tbody></table>

a simple mechanical procedure to create limbal stem cell deficiency in mouse

מחסור בתאי גזע limbal (LSCD) היא מצב של תקלה או אובדן של תאי גזע אפיתל limbal, שלאחריו אפיתל הקרנית מוחלף לחמית. חולים סובלים מפגמים קרניים חוזרים, כאבים, דלקות, ואובדן הראייה. בעבר, מודל Murine של LSCD תואר ולעומת שני מודלים אחרים. המטרה הייתה לייצר מודל עכבר עקבי של LSCD ששני מחק את הפנוטיפ בבני אדם ובבעלי נמשך מספיק זמן כדי לעשות את זה ניתן ללמוד בפתופיזיולוגיה המחלה ולהעריך טיפולים חדשים. כאן, הטכניקה מתוארת בפירוט רב יותר. כלי ממונע עם בר מסתובב תוכנן כדי להסיר את הטבעות החלודות מפני השטח של הקרנית או להחליק מיטת pterygium בחולים. זהו מכשיר מתאים כדי ליצור את מודל LSCD הרצוי. זהו כולים זמינים, קלים לשימוש במחט דקה זה עושה את זה מתאים לעבודה על עיניים קטנות, כמובעכברים. המריחה שלו מונעת טראומה מיותרת לעין וזה לא לגרום פציעות לא רצויות, כמו שקורה לעתים קרובות עם מודלי פציעה כימית. בניגוד מגרד בוטה, הוא מסיר את האפיתל עם קרום המרתף. בפרוטוקול זה, באזור לימבלית היה משופשף פעמים, ולאחר מכן האפיתל של הקרנית כולה ומהוקצע לימבוס כדי לימבוס. כדי למנוע פציעה stroma, טיפול נלקח לא להבריש את פני הקרנית פעם האפיתל היה כבר הוסרו.

בתוך חודש לאחר ביצוע טכניקה זו, 100% של הקרניות שפותחו נאווסקולריזציה שטחית (איור 1 א. תמונות צולמו במצלמת מחוברת מנורת סדק תחת שדה בהיר מסנן הכחול קובלט). ב 18/20 (90%) של העיניים, נאווסקולריזציה מעורב פני הקרנית כולה (איור 1 א). ב 2/20 (10%), נאווסקולריזציה נצפתה בשלושה מארבעה רביעים קרניים, אבל זה עדיין הגיע למרכז הקרני. כדי לאמת את התפתחות LSCD, immunostaining הר שלם בוצעה 1. שלב זה אינו חלק מן הפרוטוקול ניתן לשנות בהתאם מטרות ואינטרסים. שלוש וריאציות נחשבו כאינדיקטורים LSCD: בהעדר cytokeratin (CK) 12, חוט להט ביניים ספציפי לתאי האפיתל של הקרנית נורמלי 17, 18; מראה של CK8, סמן epithelia פשוט <sעד&gt; 20 שאינו קיים על הקרנית הנורמלית; ונוכחות של תאי גביע על פני הקרנית. כדי להעריך את הפנוטיפ אפיתל הקרנית, immunostaining כפול עבור CK12 ו CK8 בוצע על דגימות הר שלם שלושה חודשים לאחר הפציעה, כפי שתואר לעיל 1, 9. קיום תא וגביע הוערך על ידי תא ספציפי-גביע MUC5AC mucin-immunostaining 1, 15, 19 45 ימים לאחר הסרת האפיתל. הופעתו של תאי גביע מפחית בזמן. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, חשוב לבצע את מכתים פחות מחודשיים אחרי הפציעה. רגילה, קרניות וללא כל פגע המפורש CK12-סמן ספציפי של תאי אפיתל הקרניים הבוגרים 17, 18 -throughout פני הקרנית, אך הם נטולים כל CK8 או וגביע תאים (MUC5AC) מצד הקרנית של דגימות ההר השלמות (איור 1B) . בהשוואה בעין בלתי מזוינת, ביטוי CK12 הוא נעדר כמעט על injur<html> y קרניות מודל, תוך שהם משמעותיים להראות מכתים חיובי עבור CK8 ואת גביע תאים (איור 1B). תצפיות אלו מצביעות על התפתחות LSCD. אם מעוניינים בכימות תוצאות immunostaining, השתמש Image-J לכמת בנפרד 20 צפיפויות immunostaining על התמונות המקוריות, ללא שינוי שנקטה מיקרוסקופ תחת אותן הגדרות. בקצרה, לבחור את החלק הקרני של מדגם ההר השלם, למדוד את הצפיפות ואזור משולבים עבור אזור זה, ולחשב את צפיפות תיקן עבור הרקע 20. יחס CK12 לצפיפויות CK8 הוצגו בעבר על מספר גדול יותר של דגימות 1. היחס המופחת בהשוואה לקבוצת ביקורת (קרניות נורמליות) ואת המראה של תאי גביע על פני הקרנית להדגים את התפתחות LSCD. 658 / 54658fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1: הפנוטיפ קרני לאחר יצירת LSCD בעכברים. בדיקה במנורת סדק מראה שכל קרניות לפתח מידה מסוימת של נאווסקולריזציה בחודש אחד (א &#39;, בר סולם: 0.5 מ&quot;מ). קרנית נורמלית מבטא CK12 בכל רחבי הקרניים אך הוא נטול כל CK8 או תאי גביע (MUC5AC). CK12 תיאור במודל LSCD, בעוד CK8 ואת גביע תאים להופיע על הקרנית (B, סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54658/54658fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse at JoVE.com

A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

הכתבה הבאה מספקת טכניקה קלה, לשחזור כדי ליצור מודל עכבר קיימא ביעילות של מחסור בתאי גזע limbal (LSCD). במודל חיה זו שימושית בבדיקת והשוואת יעילותם של טיפולים למחלות תאי גזע limbal.

נוהל מכני פשוט ליצור מחסור בתאי גזע limbal עכבר

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

a-simple-mechanical-procedure-to-create-limbal-stem-cell-deficiency

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

8.3K Views.  University of Illinois at Chicago.  הכתבה הבאה מספקת טכניקה קלה, לשחזור כדי ליצור מודל עכבר קיימא ביעילות של מחסור בתאי גזע limbal (LSCD). במודל חיה זו שימושית בבדיקת והשוואת יעילותם של טיפולים למחלות תאי גזע limbal. 

Video: A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

הקמה התפשטות של גידולים רטינובלסטומה האדם עכברים החיסון לקויה

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.

In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

שיטה לאיתור שושלת של תאי קרנית באמצעות עכברים כתב ניאון רב-צבע

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Developmental Biology

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene therapy in organ-cultured corneas. The diabetic corneal disease is a complication of diabetes with frequent abnormalities of corneal nerves and epithelial wound healing. We have also documented significantly altered expression of several putative epithelial stem cell markers in human diabetic corneas. To alleviate these changes, adenoviral gene therapy was successfully implemented using the upregulation of c-met proto-oncogene expression and/or the downregulation of proteinases matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) and cathepsin F. This therapy accelerated wound healing in diabetic corneas even when only the limbal stem cell compartment was transduced. The best results were obtained with combined treatment. For possible patient transplantation of normalized stem cells, an example is also presented of the optimization of gene transduction in stem cell-enriched cultures using polycationic enhancers. This approach may be useful not only for the selected genes but also for the other mediators of corneal epithelial wound healing and stem cell function.

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

תרפיה adenoviral ג&#39;ין עבור סוכרתית keratopathy: השפעות על ריפוי פצע גזע ביטוי נייד מרקר ב קרניות אדם איברים בתרבית תאים לימבלית אפיתל

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy and stem cell transplantations have become key therapeutic tools for treating blindness resulting from retinal degenerative diseases. Several forms of autologous transplantation for age-related macular degeneration (AMD), such as iris pigment epithelial cell transplantation, have generated encouraging results, and human clinical trials have begun for other forms of gene and stem cell therapies.2 These include RPE65 gene replacement therapy in patients with Leber's congenital amaurosis and an RPE cell transplantation using human embryonic stem (ES) cells in Stargardt's disease.3-4 Now that there are gene therapy vectors and stem cells available for treating patients with retinal diseases, it is important to verify these potential therapies in animal models before applying them in human studies. The mouse has become an important scientific model for testing the therapeutic efficacy of gene therapy vectors and stem cell transplantation in the eye.5-8 In this video article, we present a technique to inject gene therapy vectors or stem cells into the subretinal space of the mouse eye while minimizing damage to the surrounding tissue.

This surgical technique illustrates the injection of gene therapy vectors and stem cells into the subretinal space of the mouse eye.

הזרקת subretinal של וקטורי ריפוי גנטי ותאי גזע לעיניים המאוסות

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Multimodal הדמיה של השתלת תא גזע במערכת העצבים המרכזית של עכברים

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Neuroscience

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

הזרקת גישת subretinal Limbal של ויראלי וקטורים לטיפול גנטי בעכברים הרשתית פיגמנט האפיתל

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

שיטת ניקוב ביופסיה שונה לכוויות אלקליות מדויקות בעכברים

Corneal and Limbal Alkali Injury Induction Using a Punch-Trephine Technique in a Mouse Model

The cornea is critical for vision, and corneal healing after trauma is fundamental in maintaining its transparency and function. Through the study of corneal injury models, researchers aim to enhance their understanding of how the cornea heals and develop strategies to prevent and manage corneal opacities. Chemical injury is one of the most popular injury models that has extensively been studied on mice. Most previous investigators have used a flat paper soaked in sodium hydroxide to induce corneal injury. However, inducing corneal and limbal injury using flat filter paper is unreliable, since the mouse cornea is highly curved. Here, we present a new instrument, a modified biopsy punch, that enables the researchers to create a well-circumscribed, localized, and evenly distributed alkali injury to the murine cornea and limbus. This punch-trephine method enables researchers to induce an accurate and reproducible chemical burn to the entire murine cornea and limbus while leaving other structures, such as the eyelids, unaffected by the chemical. Moreover, this study introduces an enucleation technique that preserves the medial caruncle as a landmark for identifying the nasal side of the globe. The bulbar and palpebral conjunctiva, and lacrimal gland are also kept intact using this technique. Ophthalmologic examinations were performed via slit lamp biomicroscope and fluorescein staining on days 0, 1, 2, 6, 8, and 14 post-injury. Clinical, histological, and immunohistochemical findings confirmed limbal stem cell deficiency and ocular surface regeneration failure in all experimental mice. The presented alkali corneal injury model is ideal for studying limbal stem cell deficiency, corneal inflammation, and fibrosis. This method is also suitable for investigating pre-clinical and clinical efficacies of topical ophthalmologic medications on the murine corneal surface.

מחבר זרקור: קידום המחקר בטיפול באטימות הקרנית והתחדשות 

This protocol describes a method to induce an accurate and reproducible corneal and limbal alkali injury in a mouse model. The protocol is advantageous as it allows for an evenly distributed injury to the highly curved mouse cornea and limbus.

השראת פציעה אלקלית בקרנית ובגפיים בטכניקת אגרוף-טרפין במודל עכבר

The cornea is critical for vision, and corneal healing after trauma is fundamental in maintaining its transparency and function. Through the study of ...

מראה מחייה: טיפול בתאי גזע לניוון הרשתית

Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal diseases at advanced stages. We have shown human recombinant retina-specific laminin isoform matrix is able to support the differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) to photoreceptor progenitors. In addition, sub-retinal injection of these cells has also shown partial restoration in the rd10 rodent and rabbit models. Sub-retinal injection is known to be an established method that has been used to deliver pharmaceutical compounds to the photoreceptor cells and retinal pigmented epithelial (RPE) layer of the eye due to its proximity to the target space. It has also been used to deliver adeno-associated viral vectors into the sub-retinal space to treat retinal diseases. The sub-retinal delivery of pharmaceutical compounds and cells in the murine model is challenging due to the constraint in the size of the murine eyeball. This protocol describes the detailed procedure for the preparation of hESC-derived photoreceptor progenitor cells for injection and the sub-retinal delivery technique of these cells in genetic retinitis pigmentosa mutant, rd10 mice. This approach allows cell therapy to the targeted area, in particular the outer nuclear layer of the retina, where diseases leading to photoreceptor degeneration occur.

מחבר זרקור: קידום שיקום ראייה - טיפול מבוסס תאי גזע למחלות רשתית 

We describe a detailed protocol for the preparation of post-cryopreserved hESC-derived photoreceptor progenitor cells and the sub-retinal delivery of these cells in rd10 mice.

העברה תת-רשתית של אבות פוטורצפטור שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בעכברי RD10

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal ...

נוהל מכני פשוט ליצור מחסור בתאי גזע limbal עכבר

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הקמה התפשטות של גידולים רטינובלסטומה האדם עכברים החיסון לקויה

שיטה לאיתור שושלת של תאי קרנית באמצעות עכברים כתב ניאון רב-צבע

תרפיה adenoviral ג'ין עבור סוכרתית keratopathy: השפעות על ריפוי פצע גזע ביטוי נייד מרקר ב קרניות אדם איברים בתרבית תאים לימבלית אפיתל

הזרקת subretinal של וקטורי ריפוי גנטי ותאי גזע לעיניים המאוסות

Multimodal הדמיה של השתלת תא גזע במערכת העצבים המרכזית של עכברים

הזרקת גישת subretinal Limbal של ויראלי וקטורים לטיפול גנטי בעכברים הרשתית פיגמנט האפיתל

השראת פציעה אלקלית בקרנית ובגפיים בטכניקת אגרוף-טרפין במודל עכבר

השראת פציעה אלקלית בקרנית ובגפיים בטכניקת אגרוף-טרפין במודל עכבר

השראת פציעה אלקלית בקרנית ובגפיים בטכניקת אגרוף-טרפין במודל עכבר

העברה תת-רשתית של אבות פוטורצפטור שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בעכברי RD10