Name: protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins ndc10 and ndc80
Uploaded: 2015-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80 at JoVE.com

We thank Dr. Oliver Kerscher for support and advice and members of the Basrai laboratory for their support and comments on the paper. This work was supported by the National Institutes of Health Intramural Research Program.

1. Crescimento de Células de Levedura <ol><li> Inoculação das células de levedura em 30 ml de YPD (Tabela 1) em um balão pequeno. Incubar a 30 ° C durante a noite com agitação. </li><li> Dilui-se as células até uma densidade óptica de 0,2 a 600 nm (DO 600 = 0,2) em 50 ml de meio YPD e incubar a 30 ° C com agitação. </li><li> Crescer a cultura a uma densidade óptica de 1,0 a 600 nm (DO600 = 1,0). </li><li> Centrifugar células durante 5 min a 2000 xg e desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 40 ml de água estéril e centrifugar durante 5 minutos a 2000 x g para lavar as células. Descartar o sobrenadante e o sedimento de células armazenar a -20 ° C. </li></ol> 2. Extracção de proteínas <ol><li> Ressuspender as células em 0,5 ml de tampão de guanidina arrefecido em gelo (Tabela 1) para o ensaio suspenso usando pérolas de Ni-NTA Superflow ou tampão A (Tabela 1) para imunoprecipitação. Manter tubos em gelo em todos os momentos. </li><li> Transferir a 2 ml tubo de tampa de rosca. </li><li> Adicionar o mesmo volume de esferas de vidro (Tabela de Materiais). </li><li> Conta-bater as células de uma mini-grânulo batedor (tabela de materiais) durante 2 min à temperatura ambiente, depois colocar sobre gelo durante 2-3 minutos. Repita isso três vezes. </li><li> Vortex em alta velocidade, a 4 ° C durante 30-60 min. Verificar as células por visualização sob o microscópio para garantir que as células são lisadas. Nota: As células lisadas aparece como fantasmas escuros e não têm um limite ou uma forma definida. Optimamente, pelo menos, 80% das células devem ser lisadas. </li><li> Perfurar um buraco no fundo do tubo usando um pino do impulso e coloque em uma coleção 15 ml tubo cônico (tampa de rosca deve ser solto). </li><li> Centrifugar a 1.000 xg durante 1 min para recolher o lisado. </li><li> Transferir o lisado para um tubo de micro centrífuga. </li><li> Centrifugar a 15.000 xg durante 30 min a 4 ° C para recolher as proteínas extraídas. </li><li> Medir a concentração das proteínas extraídas utilizando a proteína assay kit (Tabela de Materiais) e normalizar todos os extractos de conter a mesma quantidade de proteína. Levar o volume total a 1 ml com tampão apropriado. Nota: Cerca de 5 mg de proteína total é obtida a partir de 50 OD600 células. </li><li> Guardar a 50 ul (250 ug de proteína, se a proteína total extraído a partir do passo 5 é 2,10 mg) como extracto celular total (WCE). Adicionar 50 ul de tampão de amostra Laemmli 2x (Tabela 1) e incuba-se a 100 ° C num bloco de aquecimento durante 3-5 minutos. Carga de 10 ul de cada amostra num gel de SDS-PAGE para análise de Western Blot (Secção 5: Análise de Western blot). </li></ol> 3. Purificação de HF-Smt3 Conjugados <ol><li> Obter os grânulos Superflow Ni-NTA (Tabela de Materiais) necessários para os experimentos (100 ul de contas por amostra) por centrifugação a baixa velocidade (800-1,500 xg) durante 1 min. Remover o sobrenadante. </li><li> Grânulos lavagem 5x com 1 ml de PBS (Tabela de Materiais): Inverter top-sobre-inferior até que as contas são novamente suspensas, coletar pérolas por centrifugação a baixa velocidade, e remover o sobrenadante. </li><li> Suspender pérolas em 1 ml de tampão de guanidina (Tabela 1) e aliquotar-los para o número de tubos correspondentes a amostras a serem processadas. Coletar pérolas por centrifugação a baixa velocidade, e remover o sobrenadante. Misture as contas bem invertendo top-over inferior. Nota: Misture bem grânulos invertendo top-over inferior. </li><li> Para cada amostra, adicionar 950 ul de WCE remanescente (a partir do Passo 2.11: Extracção de proteínas) com 100 ul de contas de Ni-NTA Superflow. </li><li> Incubar numa plataforma de agitação a 4 ° C durante pelo menos 4 horas ou durante a noite. </li><li> Centrifugar a 800-1,500 xg durante 1 min a 4 ° C. </li><li> Economize 50 ul como sobrenadante (SUP). Adicionar 50 ul de tampão de amostra Laemmli 2x e incuba-se a 100 ° C num bloco de aquecimento durante 3-5 minutos. Carga de 10 ul de cada amostra num gel de SDS-PAGE para análise de Western Blot (Secção 5: Anal Western blotysis). </li><li> Lavar as pérolas uma vez com 1 ml de tampão de guanidina durante 5-10 min sobre uma plataforma oscilante. </li><li> Lavar as pérolas de 5x com 1 ml de tampão de Rebentamento (Tabela 1) durante 5-10 minutos numa plataforma de agitação. </li><li> Grânulos Ressuspender em 90 ul de tampão de amostra Laemmli 2x. </li><li> Adicionar 10 ul de 1 M de imidazol. Nota: Imidazole ajuda para dissociar a proteína marcada com His a partir das pérolas de Ni-NTA, devido à interacção entre a competir imidazole e os grânulos. </li><li> Incubar a 100 ° C num bloco de aquecimento durante 3-5 minutos. </li><li> Vortex, em seguida, centrifugar a 13.000 xg durante 30 seg. Transferir o sobrenadante para um tubo fresco. </li><li> Carga 10-20 ul de cada amostra num gel de SDS-PAGE para análise de Western Blot (Secção 5: Análise de Western blot). Nota: 10-20 ul corresponde a 0,5-1,0 mg de entrada, se 5 mg de EOC é usado. </li></ol> 4. Immunoprecipitation de Myc-marcados kinetochore Proteínas <ol><li> Obter anti-c-Myc de afinidade em gel de agarose umtibody (Tabela de Materiais) necessários para os experimentos (25 ul de resina por exemplo) por centrifugação a baixa velocidade (800-1,500 xg). Remover o sobrenadante. </li><li> Lavar 5x resina com 1 mL de tampão A: Inverter cima-baixo-cima até que a resina é ressuspensa, recolher resina por centrifugação a baixa velocidade, e remover o sobrenadante. </li><li> Suspender a resina em 1 ml de tampão A e aliquotar-los para o número de tubos correspondentes a amostras a serem processadas. Recolha resina por centrifugação a baixa velocidade, e remover o sobrenadante. Nota: Misture a resina bem invertendo-bottom top-over. </li><li> Adicionar 950 ul da WCE remanescente (a partir do Passo 2.11: Extracção de proteínas) com 25 ul de resina. </li><li> Incubar numa plataforma de agitação a 4 ° C durante a noite. </li><li> Centrifugar a 800-1,500 xg durante 1 min a 4 ° C. </li><li> Economize 50 ul como sobrenadante (SUP). Adicionar 50 ul de tampão de amostra Laemmli 2x e incuba-se a 100 ° C num bloco de aquecimento durante 3-5 minutos. Load 10 uL de cada amostra num gel de SDS-PAGE para análise de Western Blot (Secção 5: Análise de Western blot). </li><li> Lavar 5x resina com 1 mL de tampão A: Inverter cima-baixo-cima até que a resina é ressuspensa, recolher resina por centrifugação a baixa velocidade, e remover o sobrenadante. </li><li> Ressuspender a resina em 100 ul de tampão de amostra SUMEB (Tabela 1). Nota: tampão de amostra contém SUMEB Ureia 8 M e 1% de SDS (forte condição de desnaturação). </li><li> Incubar a 100 ° C num bloco de aquecimento durante 3-5 minutos. </li><li> Vortex, em seguida, centrifugar a 13.000 xg durante 30 seg. Transferir o sobrenadante para um tubo fresco. </li><li> Carga 10-20 ul de cada amostra num gel de SDS-PAGE para análise de Western Blot (Secção 5: Análise de Western blot). Nota: 10-20 ul corresponde a 0,5-1,0 mg de entrada, se 5 mg de EOC é usado. </li></ol> 5. Análise de mancha Ocidental <ol><li> Coloque os extratos de proteínas em 4-12% Bis-Tris géis (Tabela de Materiais) e perfeletroforese orm a 120 V durante 90 minutos (tampão corrente: Tabela de Materiais). </li><li> Transferir as proteínas do gel para uma membrana de nitrocelulose (Tabela de Materiais) usando um aparelho de transferência a 30 V durante 90 min (tampão de transferência: Tabela de Materiais). </li><li> Bloquear a membrana em 5% leite / TBST 1x (Tabela 1) durante 1 h à temperatura ambiente. </li><li> Incubar membrana com anticorpo primário (Tabela de Materiais) em 5% leite / TBST 1x durante a noite a 4 ° C. Para os anticorpos primários, usar uma diluição de 1: 1000 (os anticorpos anti-FLAG e anti-Ub) ou 1: 5000 (anticorpo anti-Myc). </li><li> Lavar 3x membrana durante 10 min cada com TBST 1x. </li><li> Incubar membrana com anticorpo secundário (Tabela de Materiais) em 5% leite / TBST 1x durante 1 hora à temperatura ambiente. Usar uma diluição de 1: 5000 de anticorpos secundários. </li><li> Lavar 3x membrana durante 10 min cada com TBST 1x. </li><li> Incubar membrana com ECL workisolução ng (Tabela de Materiais) durante 5 min. </li><li> Expor a membrana sensível ao azul filme X-Ray (Tabela de Materiais) e desenvolver usando um desenvolvedor automático (Tabela de Materiais). </li></ol>

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	<li>Johnson, P. R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-1:+Ubiquitin+gains+weight.">SUMO-1: Ubiquitin gains weight.</a> Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).</li><li>Hewawasam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psh1+is+an+E3+ubiquitin+ligase+that+targets+the+centromeric+histone+variant+Cse4.">Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4.</a> Mol Cell. 40, 444-454 (2010).</li><li>Ranjitkar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E3+ubiquitin+ligase+prevents+ectopic+localization+of+the+centromeric+histone+H3+variant+via+the+centromere+targeting+domain.">An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain.</a> Mol Cell. 40, 455-464 (2010).</li><li>Au, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+of+the+N+terminus+of+budding+yeast+histone+H3+variant+Cse4+in+ubiquitin-mediated+proteolysis.">A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis.</a> Genetics. 194, 513-518 (2013).</li><li>Akiyoshi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mub1/Ubr2+ubiquitin+ligase+complex+regulates+the+conserved+Dsn1+kinetochore+protein.">The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein.</a> PLoS Genet. 9, e1003216 (2013).</li><li>Biggins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conserved+protein+kinase+Ipl1+regulates+microtubule+binding+to+kinetochores+in+budding+yeast.">The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast.</a> Genes Dev. 13, 532-544 (1999).</li><li>Cheeseman, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospho-regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+the+Aurora+kinase+Ipl1p.">Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p.</a> Cell. 111, 163-172 (2002).</li><li>Liu, D., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+Aurora+B+kinase.">Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase.</a> Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).</li><li>Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation+of+the+budding+yeast+kinetochore+protein+Ndc10+is+required+for+Ndc10+spindle+localization+and+regulation+of+anaphase+spindle+elongation.">Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation.</a> J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).</li><li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum/nuclear+envelope.">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase-promoting+complex/cyclosome+controls+HEC1+stability.">Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability.</a> Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).</li><li>Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIZ1/SIZ2+control+of+chromosome+transmission+fidelity+is+mediated+by+the+sumoylation+of+topoisomerase+II.">SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II.</a> Genetics. 172, 783-794 (2006).</li><li>Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+inhibition+in+wild-type+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Biotechniques. 42, 158 (2007).</li><li>Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+microtubule+interaction+during+S+phase+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).</li><li>Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+assembly:+if+you+build+it,+they+will+come.">Kinetochore assembly: if you build it, they will come.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Marcadores de epitopo HA, tais como, Myc, Bandeira, e GST são amplamente utilizados para análise bioquímica de proteínas. Construção de estirpes com IC-Smt3 e proteínas cinetócoro Myc-tag, como Ndc10 e Ndc80, facilita a detecção de PTMs como sumoilação e ubiquitinação. HF-Smt3 puxar para baixo ensaio permite a detecção de proteínas cinetócoro sumoylated, Ndc10 e Ndc80 (Figura 1). O protocolo de purificação por afinidade e análise Western blot utilizando anticorpo anti-Flag estabelecer a especificidade da interacção entre a IC-Smt3 e proteínas alvo, tal como proteínas modificadas não foram detectados na estirpe de controlo, sem HF-Smt3. A utilização da marca Myc em substratos proteicos valida a presença de sumoylated Ndc10 e Ndc80 nos conjugados HF-Smt3. Além disso, de ambos sumoilação Ndc10 e Ndc80 foi reduzida nas células tratadas Nocodazole (Figura 1C e 1D). Diminuição sumoylation de Ndc10 em resposta a tratament nocodazolet, mas não Ndc80, foi anteriormente relatado por Montpetit et al. 9. Isto pode ser devido a diferenças no protocolo experimental e uso de um anticorpo anti-SUMO costume. Os nossos resultados para sumoilação de substratos cinetócoro sugerem que um protocolo semelhante pode ser usado para investigar outros substratos SUMO candidato. Para detectar ubiquitinação, proteínas cinetócoro marcada com myc foram imunoprecipitados primeiro e as fracções IP foram sondadas com anticorpo anti-Ub (Figura 2). O padrão de laddering Ndc10 e Ndc80 foi aumentada quando as células foram tratadas com MG132 para inibir a função do proteassoma (Figura 2B), indicando que estas proteínas são substratos da proteassoma. As fracções IP falhou para detectar sumoilação de Ndc10 ou Ndc80 em análise Western blot com anti-Flag ou anti-Smt3 anticorpo (dados não apresentados). Isto pode ser devido a razões técnicas, tais como os níveis de substrato sumoylated na fração IP ou o interference desde os marcadores de epitopo. Além disso optimização do protocolo IP, tal como a concentração de sais e condições de transferência Western deve facilitar a detecção de vários PTMs de qualquer proteína de interesse. Actualmente, é melhor sumoilação detectado pelo HF-Smt3 puxar para baixo de ensaio seguido por Western blot dos substratos candidato SUMO (Figura 1). Vários detalhes afectar a eficiência de purificação de proteínas e a capacidade de detectar a PTMs. Em primeiro lugar, todos os tubos devem ser mantidos em gelo para inibir as proteases, excepto conforme especificado. Em segundo lugar, uma proporção de 1: 1 de suspensão de células para os grânulos de vidro é essencial para romper as células por o batedor e / ou agitador grânulo. A lise celular deve ser monitorizada por análise das células ao microscópio. Em terceiro lugar, é muito importante para preparar um lisado clarificado para o ensaio de puxar para baixo ou IP. Curto ou centrifugação a baixa velocidade pode contribuir para a contaminação de detritos celulares no lisado e isto afecta a capacidade de detect o PTMs. Finalmente, a agitação vigorosa dos grânulos com um grande volume de lisado claro (cerca de 1 ml) num tubo de centrífuga de 1,5 ml de micro assegura que os grânulos são totalmente suspenso para puxar para baixo o ensaio ou IPs. Em resumo, a purificação de proteínas e detecção de técnicas, tais como os descritos aqui fornecem importantes descobertas mecanísticos sobre como PTM de proteínas cinetócoro afectar a sua estrutura e montagem para o cromossoma fiel segregação 14, 15.

Ubiquitinação e sumoilação permitir a conjugação de ubiquitina e modificador pequeno Ubiquitina-like (SUMO; Smt3 em S. cerevisiae 1) para uma proteína-alvo, respectivamente. PTMs de proteínas cinetócoro afectar os níveis celulares e interacções proteína-proteína durante as diferentes fases do ciclo celular para assegurar a segregação cromossómica fiel. Por exemplo, os níveis celulares de Cse4 / CENP-A e proteína cinetócoro exterior Dsn1 são regulados através de proteólise mediada por ubiquitina para assegurar a estabilidade do genoma 2-5. A desestabilização das ligações cinetócoro-microtúbulo incorrectas requer a IPL1 / Aurora B-quinase, que fosforila e Dam1 Ndc80 complexos que interagem directamente com os microtúbulos 6-8. Apesar da identificação de mais de setenta proteínas cinetócoro, há muito poucos estudos que investigam as modificações dessas proteínas com PTMs, por exemplo, ubiquitina e SUMO. Uma limitação importante é a capacidade de preservar a PTMs durante a purificação e a escassez de anticorpos para a detecção de mercadorias, tais como PTMs sumoilação, fosforilação, metilação, e outros. Caracterização de proteínas cinetócoro sumoylated Ndc10, Cep3, Bir1, e Ndc80 utilizou um anticorpo costume 9. Além disso, Ndc10 tem sido implicado como um substrato para ubiquitinação 10. Hec1 Humano (Ndc80 em S. cerevisiae) é também substrato para ubiquitinação, regulamentada pelo APC / C-hCdh1 E3 ligase 11. Portanto, Ndc10 e Ndc80 são bons candidatos para otimização do protocolo para detectar tanto sumoylation e ubiquitination em S. cerevisiae. Para facilitar a identificação de sumoilação, construiu-se as estirpes que expressam HF-Smt3 e marcada com myc Ndc10 ou Ndc80. O uso de marcadores de epitopo (HF: His6-Flag) minimiza o fundo devido à reatividade cruzada que é frequentemente observada no soro policlonal criado contra uma proteína candidato. Eu inventei um protocolo de afinidadepurificar conjugados HF-Smt3 e, em seguida, utilizado anti-Flag comercial e anticorpos anti-myc para detectar a presença de sumolyated Ndc10 e Ndc80 na preparação Smt3 purificado. Para ubiquitination, eu inventei um protocolo de imunoprecipitação modificado que preserva ubiquitinação das proteínas cinetócoro Myc marcadas e realizadas análises de Western blot com o anticorpo anti-Ub comercial para detectar ubiquitination de Ndc10 e Ndc80.

<table><tbody><tr><td>Glass beads</td><td>BioSpec Products</td><td>11079105</td><td>0.5 mm diameter</td></tr><tr><td>Mini beadbeater</td><td>BioSpec Products</td><td>#693</td><td>8 cell disrupter</td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8215</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7470</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>Primary antibody, dilution 1:1,000</td></tr><tr><td>c-Myc antibody (A-14)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-789</td><td>Primary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>Purified mouse antibody monoclonal 9E10</td><td>Covance</td><td>MMS-150P</td><td>Primary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody</td><td>Covance</td><td>MMS-258R</td><td>Primary antibody, dilution 1:1,000</td></tr><tr><td>ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA934V</td><td>Secondary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA931V</td><td>Secondary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>DC protein assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane</td><td>Novex</td><td>LC2001</td><td>0.45 mm pore size</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>Novex</td><td>NP0321BOX</td><td>1.0 mm, 10 well</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer</td><td>Novex</td><td>NP0002</td><td>20x</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer</td><td>Novex</td><td>NP0006-1</td><td>20x</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>34078</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS pH7.4</td><td>GIBCO</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Blue sensitive X-Ray film</td><td>Dbio</td><td>DBOF30003</td><td></td></tr><tr><td>Automatic developer</td><td>Kodak</td><td>M35AX-OMAT</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td>50 mg</td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2619</td><td>25 mg</td></tr></tbody></table>

protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins ndc10 and ndc80

As modificações pós-traducionais (PTMs), tais como fosforilação, metilação, acetilação, ubiquitinação, e sumoilação, regular a função de muitas proteínas celulares. PTMs de proteínas cinetócoro que se associam com DNA centromeric mediar segregação cromossômica fiéis para manter a estabilidade do genoma. Abordagens bioquímicas, tais como espectrometria de massa e análise de transferência de western são mais comumente utilizado para a identificação de PTMs. Aqui, um método de purificação de proteínas está descrito que permite a detecção de ambos sumoilação e ubiquitinação das proteínas cinetocoro, Ndc10 Ndc80, e em Saccharomyces cerevisiae. Uma estirpe que expressa polihistidina-Flag-etiquetado Smt3 (HF-Smt3) e marcada com myc Ndc10 ou Ndc80 foi construída e utilizada para os nossos estudos. Para a detecção de sumoylation, eu inventei um protocolo para purificar por afinidade proteínas sumoylated His-tag usando esferas de níquel e usado western blot com anti-Myc anticorpo para detectar sumoylated Ndc10 umnd Ndc80. Para a detecção de ubiquitinação, que concebido um protocolo para a imunoprecipitação das proteínas Myc-tag e utilizada a análise de Western blot com um anticorpo anti-Ub para mostrar que Ndc10 e Ndc80 são ubiquitinadas. Os nossos resultados mostram que o epitopo marcado com proteína de interesse na sua bandeira-tagged Smt3 estirpe facilita a detecção de vários PTMs. Estudos futuros deverão permitir a exploração desta técnica para identificar e caracterizar as interações proteína que são dependentes de um PTM específico.

Para detectar sumoilação de proteínas cinetócoro Ndc80 e Ndc10, estirpes com HF-Smt3 e proteínas cinetócoro marcada com myc (Ndc80 ou Ndc10) foram calculados (Tabela 2), como anteriormente descrito 9,12. HF-Smt3 conjugados foram purificados por afinidade utilizando esferas de Ni-NTA. A análise de Western blot de HF purificado-Smt3 com um anticorpo anti-Flag permitiu a detecção de formas sumoylated de substratos SUMO que estavam ausentes na estirpe de controlo, sem HF-Smt3 (Figura 1A e 1B, painel esquerdo). Como esperado, as múltiplas formas de substratos SUMO foram detectados na estirpe HF-Smt3. A seguir, determinado se Ndc80 e Ndc10 estão presentes no conjugado purificado HF-Smt3 fazendo análise de mancha de Western utilizando um anticorpo anti-Myc. Várias bandas que foram de peso molecular mais elevado do que o de Ndc80 ou Ndc10 foram claramente detectados (Figura 1A e 1B, painel da direita). Além disso, várias bandas de ambos Ndc80 e Ndc10foram reduzidos em células nocodazole tratados (Figura 1C e 1D). Estes resultados demonstram que a purificação de proteínas e análise Western blot descrita aqui permitem a detecção de sumoilação de Ndc80 e Ndc10, como previamente descrito 9. Para detectar a ubiquitinação de Ndc80 e Ndc10, marcada com myc Ndc80 ou Ndc10 foi imunoprecipitada (IP) e a análise por Western blot foi realizada com anti-Myc e anti-Ub anticorpos (Figura 2). Análise de extractos celulares totais (WCE) e sobrenadante (SUP) confirmou a expressão de Ndc80-Myc e Ndc10-Myc (Figura 2A). As bandas de baixo peso molecular no WCE pode representar produtos de degradação. Amostras IP sondadas com anti-Myc mostrou múltiplas bandas de elevado peso molecular, o que sugere que Ndc80 e Ndc10 conter PTMs. Um padrão de laddering amostras IP sondadas com anticorpo anti-Ub mostrou que Ndc80 e Ndc10 são ubiquitinadas (Figura 2A, α-Ub). O padrão de laddering Ndc80 e Ndc10 foram amplificados pelo tratamento com inibidor do proteassoma (MG132) (Figura 2B, α-Ub), confirmando ainda que essas bandas representam poli-ubiqutination. Os resultados representativos revelam que tanto Ndc80 e Ndc10 são substratos para sumoylation e ubiquitination em S. cerevisiae e que os métodos de purificação de proteínas descritos são úteis para a detecção de PTMs como sumoilação e ubiquitinação. De acordo com nosso conhecimento, este é o primeiro relatório que Ndc80 em S. cerevisiae é um substrato para ubiquitinação, embora proteólise mediada por ubiquitina do homólogo humano Hec1 foi publicado anteriormente 11. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52482/52482fig1.jpg" /> Figura 1: purificação de substratos sumolyated permite a identificação de proteínas e cinetócoro Ndc80 Ndc10 como substratos SUMO Pr.oteins foram extraídos e conjugados de HF-Smt3 foram preparados e analisados ​​por análise de Western blot após separação por SDS-PAGE. (A e B) e Ndc80 Ndc10 são sumoylated. As proteínas foram extraídas a partir de células em crescimento logarítmico em meio YPD. Painel esquerdo: Total de substratos SUMO foram detectados com um anticorpo anti-Flag. Painel da direita: Sumoylated Ndc80 ou Ndc10 foi detectada nos conjugados HF-Smt3 quando sondada com um anticorpo anti-Myc. (C e D) de sumoilação Ndc80 e Ndc10 é reduzida nas células tratadas nocodazole. Logaritmicamente células em crescimento em meio YPD foram tratadas com DMSO (-) ou DMSO + 20 ug / mL de nocodazole (+) durante 2 horas a 30 ° C. HF-Smt3 conjugados foram analisados ​​por análise de transferência de Western utilizando anticorpo anti-Myc. Estirpes isogénicas de levedura utilizadas são (A e C) YPH1800 (Ndc80-Myc), YMB7862 (His-Flag-SMT3 Ndc80-Myc) e (B e D) YPH1734 (Ndc10-Myc), YMB7867 (His-FlAG-SMT3 Ndc10-Myc). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52482/52482fig2.jpg" /> Figura 2:. Ubiquitinação de proteínas cinetócoro Ndc80 e Ndc10 Extracção da proteína e a imunoprecipitação foram realizados como descrito no protocolo. (A) e Ndc80 Ndc10 são ubiquitinadas. As proteínas foram extraídas a partir de células em crescimento logarítmico em meio YPD. Extracto de célula total (WCE), sobrenadante (SUP), e as fracções (IP) imunoprecipitados foram sujeitos a SDS-PAGE. As transferências de Western foram usadas para detectar proteínas marcada com myc e ubiquitinadas com anti-Myc e anticorpos anti-UB, respectivamente. (B) Ubiquitinação de Ndc80 e Ndc10 é aumentada em células tratadas com inibidor de proteassoma MG132. Células de crescimento logarítmico em meio YPD foram tratadas com DMSO (-) ou DMSO + 50 uM MG132 (+), na presença de 0,003% de SDS durante 3 h a 30 ° C, tal como previamente descrito 13 </sup&gt;. Western blot de fração IP foram feitas utilizando anti-Myc ou anti-Ub anticorpo. Linhagens isogênicas de levedura utilizadas são YMB7278 (His-Flag-SMT3), YMB7862 (His-Flag-SMT3 Ndc80-Myc) e YMB7867 (His-Flag-SMT3 Ndc10-Myc). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Solução </td><td> Componentes </td></tr><tr><td> YPD </td><td> 1% de extracto de levedura, 2% de Bacto-peptona, 2% de glucose </td></tr><tr><td> Tampão de guanidina </td><td> 0,1 M de Tris-HCl a pH 8,0, cloreto de guanidina a 6 M, 0,5 M de NaCl </td></tr><tr><td> Tampão A </td><td> 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM de NaCl, 0,2% de Triton X-100, os inibidores da protease 1x </td></tr><tr><td> Tampão de ruptura </td><td> 0,1 M de Tris-HCl pH 8,0, 20% de glicerol, 1 mM de PMSF </td></tr><tr><td> Tampão de amostra SUMEB </td><td> SDS a 1%, 8 M de ureia, 10 mM de MOPS pH 6,8, 10 mM de EDTA, 0,01% de azul de bromofenol </td></tr><tr><td> 2x tampão de amostra de Laemmli </td><td> MM de Tris-HCl 100pH 6,8, 4% SDS, 20% glicerol, 0,2% de azul de bromofenol (Antes da utilização: adiciona b-mercaptoetanol (BME) a ​​uma concentração final de 200 mM) </td></tr><tr><td> 1x TBST </td><td> 137 mM de cloreto de sódio, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1% de Tween-20 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Soluções. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Tabela 2. As estirpes de levedura utilizadas neste estudo *. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cepas </td><td> Principal </td><td> Genótipo </td><td> Referência </td></tr><tr><td> BY4741 </td><td></td><td> MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 </td><td> Abrir Biosystems </td></tr><tr><td> BY4742 </td><td></td><td> MATa his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 </td><td> Abrir Biosystems </td></tr><tr><td> YMB7278 </td><td> BY4741 / BY4742 </td><td> MATa his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 HF-SMT3 :: LEU2 </td><td> Este estudo </td></tr><tr><td> YPH1734 </td><td></td><td> MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC10-13Myc :: kanMX6 </td><td> Montpetit et al., 2006 </td></tr><tr><td> YPH1800 </td><td></td><td> MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC80-13Myc :: His3MX6 </td><td> Montpetit et al., 2006 </td></tr><tr><td> YMB7862 </td><td> YMB7278 / YPH1800 </td><td> MATa ura3 Ieu2 his3 ADE2 trp1 HF-SMT3 :: LEU2 NDC80-Myc :: His3MX6 </td><td> Este estudo </td></tr><tr><td> YMB7867 </td><td> YMB7278 / YPH1734 </td><td> MATa ura3 Ieu2 trp1 his3 Iys2 HF-SMT3 :: LEU2 NDC10-Myc :: kanMX6 </td><td> Este estudo </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> * Todas as estirpes de levedura são derivadas a partir de Saccharomyces cerevisiae S288C. </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><pclasse = &quot;jove_content&quot;&gt; Quadro 2: As estirpes de levedura utilizadas neste estudo.

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Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Este manuscrito descreve a detecção de sumoylation e ubiquitinação de proteínas cinetócoro, Ndc10 e Ndc80, na levedura Saccharomyces cerevisiae brotamento.

Técnica de purificação de proteína que permite a detecção de SUMOilação e Ubiquitination de brotamento Yeast kinetochore Proteínas Ndc10 e Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

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Universidad San Sebastian

Research

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Biology

12.0K visualizações.  National Cancer Institute, National Institute of Health.  Este manuscrito descreve a detecção de sumoylation e ubiquitinação de proteínas cinetócoro, Ndc10 e Ndc80, na levedura Saccharomyces cerevisiae brotamento. 

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Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Bioquímica

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. This method utilizes a recombinant modified SUMO-trapping protein fragment, kmUTAG, derived from the Ulp1 SUMO protease of the stress-tolerant budding yeast Kluyveromyces marxianus. We have adapted the properties of the kmUTAG for the purpose of studying sumoylation in a variety of model systems without the use of antibodies. For the study of SUMO, KmUTAG has several advantages when compared to antibody-based approaches. This stress-tolerant SUMO-trapping reagent is produced recombinantly, it recognizes native SUMO isoforms from many species, and unlike commercially available antibodies it shows reduced affinity for free, unconjugated SUMO. Representative results shown here include the localization of SUMO conjugates in mammalian tissue culture cells and nematode oocytes.

SUMO is an essential and highly conserved, small ubiquitin-like modifier protein. In this protocol we are describing the use of a stress-tolerant recombinant SUMO-trapping protein (kmUTAG) to visualize native, untagged SUMO conjugates and their localization in a variety of cell types.

Localização de proteínas SUMO-modificadas usando proteínas de captura de sumo fluorescentes

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

Perfil de Ubiquitin e Ubiquitin-like Modificações pós-translacionais dependentes e identificação de alterações significativas

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

Detecção de Ubiquitinação Protein

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Biologia

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, including cell survival, proliferation, and differentiation. It is a reversible process that consists of a covalent attachment of ubiquitin to the substrate through a cascade reaction of at least three different enzymes, composed of E1 (Ubiquitin-activation enzyme), E2 (Ubiquitin-conjugating enzyme), and E3 (Ubiquitin-ligase enzyme). The E3 complex plays an important role in substrate recognition and ubiquitylation. Here, a protocol is described to evaluate substrate ubiquitylation in mammalian cells using transient co-transfection of a plasmid encoding the selected substrate, an E3 ubiquitin ligase, and a tagged ubiquitin. Before lysis, the transfected cells are treated with the proteasome inhibitor MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) to avoid substrate proteasomal degradation. Furthermore, the cell extract is submitted to small-scale immunoprecipitation (IP) to purify the polyubiquitylated substrate for subsequent detection by western blotting (WB) using specific antibodies for ubiquitin tag. Hence, a consistent and uncomplicated protocol for ubiquitylation assay in mammalian cells is described to assist scientists in addressing ubiquitylation of specific substrates and E3 ubiquitin ligases.

We provide a detailed protocol for a ubiquitylation assay of a specific substrate and an E3 ubiquitin-ligase in mammalian cells. HEK293T cell lines were used for protein overexpression, the polyubiquitylated substrate was purified from cell lysates by immunoprecipitation, and resolved in SDS-PAGE. Immunoblotting was used to visualize this post-translational modification.

Avaliação da Ubiquização substrato por E3 Ubiquitin-ligase em Lysates de Células Mamárias

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate protein. The ubiquitination process occurs intracellularly in eukaryotes and regulates almost all basic cellular biological processes. Purification of ubiquitinated proteins aids the investigation of the role of ubiquitination in controlling the function of substrate proteins. Here, a step-by-step procedure to purify ubiquitinated proteins in mammalian cells is described with the p53 tumor suppressor protein as an example. Ubiquitinated p53 proteins were purified under stringent nondenaturing and denaturing conditions. Total cellular Flag-tagged p53 protein was purified with anti-Flag antibody-conjugated agarose under nondenaturing conditions. Alternatively, total cellular His-tagged ubiquitinated protein was purified using nickel-charged resin under denaturing conditions. Ubiquitinated p53 proteins in the eluates were successfully detected with specific antibodies. Using this procedure, the ubiquitinated forms of a given protein can be efficiently purified from mammalian cells, facilitating studies on the roles of ubiquitination in regulating protein function.

The protocol describes a step-by-step method to purify ubiquitinated proteins from mammalian cells using the p53 tumor suppressor protein as an example. Ubiquitinated p53 proteins were purified from cells under stringent nondenaturing and denaturing conditions.

Purificação de proteínas p53 ubiquitinadas de células de mamíferos

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Medição de ligações cruzadas de DNA-proteína ubiquitiladas, SUMOiladas e ribosiladas com ADP

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

Autor em destaque: Detecção quantitativa de ligações cruzadas de proteínas de DNA e suas modificações pós-traducionais  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

Detecção quantitativa de ligações cruzadas DNA-proteína e suas modificações pós-traducionais

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Brotando Yeast extração e purificação de proteínas para o estudo da função, interações e modificações pós-traducionais

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Técnica de purificação de proteína que permite a detecção de SUMOilação e Ubiquitination de brotamento Yeast kinetochore Proteínas Ndc10 e Ndc80

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Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

Localização de proteínas SUMO-modificadas usando proteínas de captura de sumo fluorescentes

Perfil de Ubiquitin e Ubiquitin-like Modificações pós-translacionais dependentes e identificação de alterações significativas

Detecção de Ubiquitinação Protein

Avaliação da Ubiquização substrato por E3 Ubiquitin-ligase em Lysates de Células Mamárias

Purificação de proteínas p53 ubiquitinadas de células de mamíferos

Detecção quantitativa de ligações cruzadas DNA-proteína e suas modificações pós-traducionais

Detecção quantitativa de ligações cruzadas DNA-proteína e suas modificações pós-traducionais

Detecção quantitativa de ligações cruzadas DNA-proteína e suas modificações pós-traducionais

Brotando Yeast extração e purificação de proteínas para o estudo da função, interações e modificações pós-traducionais