Name: protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins ndc10 and ndc80
Uploaded: 2015-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80 at JoVE.com

We thank Dr. Oliver Kerscher for support and advice and members of the Basrai laboratory for their support and comments on the paper. This work was supported by the National Institutes of Health Intramural Research Program.

1. צמיחה של תאי שמרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן שמרי תאים ב 30 מיליליטר של YPD (טבלה 1) בבקבוק קטן. לדגור על 30 מעלות צלזיוס הלילה עם רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את התאים לצפיפות אופטית של 0.2 ב 600 ננומטר (OD 600 = 0.2) ב -50 מיליליטר של YPD לדגור על 30 מעלות צלזיוס עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול התרבות לצפיפות אופטית של 1.0 ב 600 ננומטר (OD 600 = 1.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגות במשך 5 דקות XG ב 2000 וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה במים סטריליים 40 מיליליטר ו צנטריפוגות במשך 5 דקות XG ב 2000 לשטוף את התאים. בטל supernatant ולאחסן את התא גלולה ב -20 ° C. </li></ol> 2. הפקה של חלבונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Resuspend ב 0.5 מיליליטר של חיץ guanidine קר כקרח (טבלה 1) עבור assay הנפתח באמצעות חרוזים superflow Ni-נת&quot;ע או חיץ (טבלה 1) לimmunoprecipitation. שמור צינורות על קרח בכל העת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 2 מ &#39;צינור כובע בורג l. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את אותו הנפח של חרוזי זכוכית (טבלה של חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים לנצח את התאים במקצף חרוז מיני (טבלה של חומרים) למשך 2 דקות בטמפרטורת חדר, ואז מניח על קרח במשך 2-3 דקות. חזור על זה שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת במהירות גבוהה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30-60 דקות. בדקו את התאים על ידי הדמיה תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח שתאי lysed. הערה: תאי lysed יופיעו רוחות כהות וחסרות גבול או צורה מוגדרת. בצורה אופטימלית לפחות 80% מהתאים יש lysed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקב חור בחלק התחתון של הצינור באמצעות סיכת דחיפה ומקום באוסף צינור חרוטי 15 מיליליטר (כובע בורג צריך להיות משוחרר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 1000 דקות 1 כדי לאסוף את lysate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את lysate לצינור צנטריפוגות מיקרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף את החלבונים שחולצו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הריכוז של החלבונים המופקים באמצעות אסא החלבוןערכת y (טבלה של חומרים) ולנרמל את כל התמציות להכיל את אותה הכמות של חלבון. תביא את הנפח הכולל למ&quot;ל 1 עם חיץ מתאים. הערה: בסביבות 5 מ&quot;ג של חלבון כולל מתקבל 50 OD 600 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסוך 50 μl (חלבון מיקרוגרם 250 אם החלבון הכולל שחולץ מהצעד 2.10 הוא 5 מ&quot;ג) כתמצית כל תא (WCE). הוסף 50 μl של חיץ 2x Laemmli מדגם (טבלת 1) ולדגור על 100 מעלות צלזיוס בגוש חום במשך 3-5 דקות. עומס 10 μl של כל דגימה בג&#39;ל SDS-עמוד לניתוח מערבי כתם (סעיף 5: ניתוח כתם מערבי). </li></ol> 3. טיהור של HF-Smt3 conjugates <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את חרוזים Ni-נת&quot;ע superflow (הטבלה של חומרים) נחוצים לניסויים על ידי צנטריפוגה הנמוכה מהירות (800-1,500 XG) דקות 1 (של חרוזים לדגימה 100 μl). הסר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים 5x עם 1 מיליליטר של PBS (טבלה של חומרים): היפוך העליון יתרתחתון עד חרוזים הם resuspended, לאסוף החרוזים על ידי צנטריפוגה במהירות הנמוכה, ולהסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות חרוזים ב 1 מיליליטר של חיץ guanidine (טבלה 1) וaliquot אותם למספר הצינורות המתאימים לדגימות להיות מעובד. לאסוף החרוזים על ידי צנטריפוגה במהירות הנמוכה, ולהסיר את supernatant. מערבבים את חרוזים גם על ידי היפוך העליון על חלק תחתון. הערה: מערבבים חרוזים גם על ידי היפוך תחתון העליון מעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימה, להוסיף 950 μl של WCE הנותר (משלב 2.11: הפקה של חלבונים) לחרוזי superflow Ni-נת&quot;ע 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על פלטפורמת נדנדה ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות או למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 800-1,500 דקות 1 ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסוך 50 μl כsupernatant (SUP). הוסף 50 μl של חיץ מדגם Laemmli 2x ולדגור על 100 מעלות צלזיוס בגוש חום במשך 3-5 דקות. עומס 10 μl של כל דגימה בג&#39;ל SDS-עמוד לניתוח מערבי כתם (סעיף 5: אנאלי כתם מערבייסיס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים פעם עם 1 מיליליטר של חיץ guanidine למשך 5-10 דקות על פלטפורמת נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים 5x עם 1 מיליליטר של שבירת חיץ (טבלת 1) למשך 5-10 דקות על פלטפורמת נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים Resuspend ב 90 μl של חיץ מדגם Laemmli 2x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של imidazole 1 M. הערה: Imidazole מסייע לנתק את החלבון שלו מתויג מחרוזי Ni-נת&quot;ע בשל אינטראקציה מתחרה בין imidazole והחרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 100 מעלות צלזיוס בגוש חום במשך 3-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס, אז צנטריפוגות ב13,000 XG במשך 30 שניות. מעבירים את supernatant לצינור טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> μl 10-20 העומס של כל דגימה בג&#39;ל SDS-עמוד לניתוח מערבי כתם (סעיף 5: ניתוח כתם מערבי). הערה: 10-20 μl מתאים ל0.5-1.0 מ&quot;ג הקלט, אם 5 מ&quot;ג של WCE משמש. </li></ol> 4. Immunoprecipitation של חלבונים קינטוכור מתויג Myc <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג ג&#39;ל אנטי-ג-Myc זיקת agarosetibody (טבלה של חומרים) נחוץ לניסויים (25 μl של שרף לדגימה) על ידי צנטריפוגה הנמוכה מהירות (800-1,500 XG). הסר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5x השרף לשטוף עם 1 מיליליטר של חיץ: על-תחתון העליונה היפוך עד השרף resuspended, לאסוף שרף על ידי צנטריפוגה במהירות הנמוכה, ולהסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות שרף ב 1 מיליליטר של החיץ וaliquot אותם למספר הצינורות המתאימים לדגימות להיות מעובד. לאסוף שרף על ידי צנטריפוגה במהירות הנמוכה, ולהסיר את supernatant. הערה: מערבבים את השרף גם על ידי היפוך על-תחתון-עליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 950 μl של WCE הנותר (משלב 2.11: הפקה של חלבונים) עד 25 μl של שרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על פלטפורמת נדנדה ב 4 ° C למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 800-1,500 דקות 1 ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסוך 50 μl כsupernatant (SUP). הוסף 50 μl של חיץ מדגם Laemmli 2x ולדגור על 100 מעלות צלזיוס בגוש חום במשך 3-5 דקות. Loמודעה 10 μl של כל דגימה בג&#39;ל SDS-עמוד לניתוח מערבי כתם (סעיף 5: ניתוח כתם מערבי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5x השרף לשטוף עם 1 מיליליטר של חיץ: על-תחתון העליונה היפוך עד השרף resuspended, לאסוף שרף על ידי צנטריפוגה במהירות הנמוכה, ולהסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend השרף במדגם של חיץ SUMEB (טבלת 1) 100 μl. הערה: מאגר מדגם SUMEB מכיל 8 M אוריאה ו -1% SDS (מצב denaturing חזק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 100 מעלות צלזיוס בגוש חום במשך 3-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס, אז צנטריפוגות ב13,000 XG במשך 30 שניות. מעבירים את supernatant לצינור טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> μl 10-20 העומס של כל דגימה בג&#39;ל SDS-עמוד לניתוח מערבי כתם (סעיף 5: ניתוח כתם מערבי). הערה: 10-20 μl מתאים ל0.5-1.0 מ&quot;ג הקלט, אם 5 מ&quot;ג של WCE משמש. </li></ol> 5. ניתוח כתם המערבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את תמציות חלבון על 4-12% Bis-טריס ג&#39;לי (טבלה של חומרים) וPerfאלקטרופורזה ORM ב 120 V 90 דקות (ריצת חיץ: טבלה של חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את החלבונים מג&#39;ל לקרום nitrocellulose (טבלה של חומרים) באמצעות מנגנון העברה ליום 30 בV עבור 90 דק &#39;(העברת חיץ: טבלה של חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום את הקרום ב5% חלב / 1x TBST (טבלת 1) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה עם נוגדן ראשוני (טבלה של חומרים) 5% חלב / C הלילה ב 4 ° 1x TBST. לנוגדנים עיקריים, השתמש דילול של 1: 1,000 (נוגדנים נגד דגל ואנטי-UB) או 1: 5,000 (נוגדן אנטי-Myc). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3x קרום במשך 10 דקות כל אחד עם 1x TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה קרום עם נוגדנים משני (טבלה של חומרים) 5% חלב / 1x TBST עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר. השתמש דילול 1: 5000 של נוגדנים משני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3x קרום במשך 10 דקות כל אחד עם 1x TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה קרום עם worki ECLפתרון ng (טבלה של חומרים) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הקרום לסרט X-Ray הכחול רגיש (טבלה של חומרים) ולפתח באמצעות מפתח אוטומטי (טבלה של חומרים). </li></ol>

<ol>
	<li>Johnson, P. R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-1:+Ubiquitin+gains+weight.">SUMO-1: Ubiquitin gains weight.</a> Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).</li><li>Hewawasam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psh1+is+an+E3+ubiquitin+ligase+that+targets+the+centromeric+histone+variant+Cse4.">Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4.</a> Mol Cell. 40, 444-454 (2010).</li><li>Ranjitkar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E3+ubiquitin+ligase+prevents+ectopic+localization+of+the+centromeric+histone+H3+variant+via+the+centromere+targeting+domain.">An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain.</a> Mol Cell. 40, 455-464 (2010).</li><li>Au, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+of+the+N+terminus+of+budding+yeast+histone+H3+variant+Cse4+in+ubiquitin-mediated+proteolysis.">A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis.</a> Genetics. 194, 513-518 (2013).</li><li>Akiyoshi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mub1/Ubr2+ubiquitin+ligase+complex+regulates+the+conserved+Dsn1+kinetochore+protein.">The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein.</a> PLoS Genet. 9, e1003216 (2013).</li><li>Biggins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conserved+protein+kinase+Ipl1+regulates+microtubule+binding+to+kinetochores+in+budding+yeast.">The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast.</a> Genes Dev. 13, 532-544 (1999).</li><li>Cheeseman, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospho-regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+the+Aurora+kinase+Ipl1p.">Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p.</a> Cell. 111, 163-172 (2002).</li><li>Liu, D., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+Aurora+B+kinase.">Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase.</a> Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).</li><li>Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation+of+the+budding+yeast+kinetochore+protein+Ndc10+is+required+for+Ndc10+spindle+localization+and+regulation+of+anaphase+spindle+elongation.">Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation.</a> J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).</li><li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum/nuclear+envelope.">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase-promoting+complex/cyclosome+controls+HEC1+stability.">Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability.</a> Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).</li><li>Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIZ1/SIZ2+control+of+chromosome+transmission+fidelity+is+mediated+by+the+sumoylation+of+topoisomerase+II.">SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II.</a> Genetics. 172, 783-794 (2006).</li><li>Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+inhibition+in+wild-type+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Biotechniques. 42, 158 (2007).</li><li>Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+microtubule+interaction+during+S+phase+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).</li><li>Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+assembly:+if+you+build+it,+they+will+come.">Kinetochore assembly: if you build it, they will come.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

תגי epitope כגון HA, Myc, דגל, וGST נמצאים בשימוש נרחב לאנליזה ביוכימית של חלבונים. בנייה של זנים עם HF-Smt3 וחלבוני קינטוכור מתויג Myc, כגון Ndc10 וNdc80, מאפשרת זיהוי של PTMs כגון sumoylation וubiquitination. HF-Smt3 ניתץ assay מאפשר זיהוי של חלבוני קינטוכור sumoylated, Ndc10 וNdc80 (איור 1). פרוטוקול טיהור הזיקה וניתוח כתם המערבי באמצעות נוגדן אנטי הדגל להקים את הספציפיות של אינטראקציה בין HF-Smt3 וחלבוני יעד, כמו חלבונים שונה שלא זוהו בזן השליטה ללא HF-Smt3. השימוש בתג Myc על מצעי החלבון מאמת את הנוכחות של Ndc10 sumoylated וNdc80 בconjugates HF-Smt3. יתר על כן, sumoylation של שני Ndc10 וNdc80 הופחת בתאי nocodazole טופלו (איור 1 ג ו1D). ירידת sumoylation של Ndc10 בתגובה לtreatmen nocodazoleלא, אבל לא Ndc80, דווח בעבר על ידי et al Montpetit. 9. זה יכול להיות בגלל הבדלים בפרוטוקול ושימוש בנוגדן אנטי-SUMO מותאם אישית ניסיוניים. התוצאות שלנו לsumoylation של מצעי קינטוכור מצביעות על כך שפרוטוקול דומה יכול לשמש כדי לחקור מצעי SUMO המועמד אחרים. כדי לזהות ubiquitination, חלבוני קינטוכור myc-tagged היו immunoprecipitated הראשון ושברי IP נבדקו עם נוגדן אנטי-UB (איור 2). דפוס laddering של Ndc10 וNdc80 הוגדל כאשר טופלו תאים עם MG132 לעכב פונקצית פרוטאזום (איור 2), המציין כי חלבונים אלה הם מצעים של פרוטאזום. שברי IP לא הצליחו לזהות sumoylation של Ndc10 או Ndc80 בניתוח כתם מערבי עם אנטי-דגל או אנטי-Smt3 נוגדנים (מידע לא מוצג). זה יכול להיות בגלל סיבות טכניות, כגון רמות של מצע sumoylated בשבריר IP או interferencדואר מתגי epitope. אופטימיזציה נוספת של פרוטוקול ה- IP כגון ריכוז מלחים ותנאים מערביים סופג צריכה להקל על זיהוי של PTMs מרובה של כל חלבון של עניין. נכון לעכשיו, sumoylation מזוהה הטוב ביותר על ידי HF-Smt3 ניתץ assay אחרי כתמים מערביים של מצעי SUMO המועמד (איור 1). כמה פרטים להשפיע על היעילות של טיהור חלבון ואת היכולת לזהות PTMs. ראשית, כל הצינורות צריכים להיות כל הזמן על קרח כדי לעכב את פרוטאזות למעט כמפורט. שנית, יחס של 1: 1 של השעיה תא חרוזי זכוכית הוא קריטי כדי לשבש את התאים על ידי מקצף חרוז ו / או vortexer. תמוגה תא צריך להיות במעקב על ידי בדיקה של התאים תחת מיקרוסקופ. שלישית, חשוב מאוד להכין lysate הבהיר לassay למשוך למטה או IP. צנטריפוגה במהירות קצרה או נמוכה יכולה לתרום לזיהום של פסולת תא בlysate וזה משפיע על יכולת DeteCT PTMs. לבסוף, טלטול נמרץ של חרוזים עם נפח גדול של lysate ברור (כ 1 מיליליטר) בצינור צנטריפוגות 1.5 מיליליטר מיקרו מבטיח כי חרוזים מושעים באופן מלא עבור assay או כתובות IP לנתץ. לסיכום, טיהור חלבון וזיהוי טכניקות כגון זה שתואר כאן לספק תובנות מכניסטית חשובות לאיך PTM של חלבוני קינטוכור להשפיע על המבנה וההרכבה שלהם להפרדה כרומוזום נאמן 14, 15.

Ubiquitination וsumoylation לאפשר נטיה של היוביקוויטין ומשתנה כמו-יוביקוויטין הקטן (SUMO; Smt3 בcerevisiae ס 1) לחלבון מטרה, בהתאמה. PTMs של חלבוני קינטוכור להשפיע על הרמות הסלולריות שלהם ואינטראקציות בין חלבונים במהלך שלבי מחזור התא שונים על מנת להבטיח הפרדת כרומוזומים נאמן. לדוגמא, רמות סלולריות של Cse4 / CENP-וחלבון קינטוכור החיצוני Dsn1 מוסדרות על ידי proteolysis בתיווך היוביקוויטין להבטחת יציבות הגנום 2-5. יציבות של קבצים מצורפים קינטוכור-microtubule שגויים דורשת B קינאז Ipl1 / אורורה, שphosphorylates מתחמי Dam1 וNdc80 ישירות אינטראקציה עם microtubules 6-8. למרות זיהוי של למעלה משבעים חלבוני קינטוכור, יש מעט מאוד מחקרים שיבדקו את השינויים של חלבונים אלה עם PTMs, למשל, יוביקוויטין וסומו. מגבלה עיקרית היא היכולת לשמור על PTMים במהלך טיהור והמיעוט של נוגדנים מותאמים אישית עבור זיהוי של PTMs כגון sumoylation, זרחון, מתילציה, ואחרים. אפיון של חלבוני קינטוכור sumoylated Ndc10, Cep3, Bir1, וNdc80 מנוצל נוגדן מותאם אישית 9. בנוסף, Ndc10 היה מעורב כמצע לubiquitination 10. האדם Hec1 (Ndc80 בcerevisiae ס) הוא גם מצע עבור ubiquitination, מוסדר על ידי האנזים APC / C-hCdh1 E3 11. לכן, Ndc10 וNdc80 הם מועמדים טובים לאופטימיזציה של הפרוטוקול לזהות שני sumoylation וubiquitination בס cerevisiae. כדי להקל על זיהוי של sumoylation, בנינו זנים המבטאים HF-Smt3 וNdc10 מתויג Myc או Ndc80. השימוש בתגי epitope (HF: His6-הדגל) ממזער את הרקע בשל תגובה צולבת הנצפה לעתים קרובות בסרום polyclonal הועלה נגד חלבון מועמד. אנחנו המצאנו פרוטוקול לזיקהלטהר conjugates HF-Smt3 ולאחר מכן השתמש באנטי-דגל מסחרי ואנטי-Myc נוגדנים כדי לזהות הנוכחות של Ndc10 sumolyated וNdc80 בהכנת Smt3 מטוהרת. לubiquitination, אנחנו המצאנו פרוטוקול immunoprecipitation שונה המשמר ubiquitination של חלבוני קינטוכור myc-מתויגים וביצעו ניתוח כתם מערבי עם נוגדן אנטי-UB מסחרי כדי לזהות ubiquitination של Ndc10 וNdc80.

<table><tbody><tr><td>Glass beads</td><td>BioSpec Products</td><td>11079105</td><td>0.5 mm diameter</td></tr><tr><td>Mini beadbeater</td><td>BioSpec Products</td><td>#693</td><td>8 cell disrupter</td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8215</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7470</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>Primary antibody, dilution 1:1,000</td></tr><tr><td>c-Myc antibody (A-14)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-789</td><td>Primary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>Purified mouse antibody monoclonal 9E10</td><td>Covance</td><td>MMS-150P</td><td>Primary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody</td><td>Covance</td><td>MMS-258R</td><td>Primary antibody, dilution 1:1,000</td></tr><tr><td>ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA934V</td><td>Secondary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA931V</td><td>Secondary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>DC protein assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane</td><td>Novex</td><td>LC2001</td><td>0.45 mm pore size</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>Novex</td><td>NP0321BOX</td><td>1.0 mm, 10 well</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer</td><td>Novex</td><td>NP0002</td><td>20x</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer</td><td>Novex</td><td>NP0006-1</td><td>20x</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>34078</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS pH7.4</td><td>GIBCO</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Blue sensitive X-Ray film</td><td>Dbio</td><td>DBOF30003</td><td></td></tr><tr><td>Automatic developer</td><td>Kodak</td><td>M35AX-OMAT</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td>50 mg</td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2619</td><td>25 mg</td></tr></tbody></table>

protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins ndc10 and ndc80

לאחר translational שינויים (PTMs), כגון זרחון, מתילציה, acetylation, ubiquitination, וsumoylation, להסדיר את תפקידם של חלבונים רבים. PTMs של חלבוני קינטוכור שמקשרים עם DNA centromeric לתווך הפרדת כרומוזום נאמן לשמור על יציבות הגנום. גישות ביוכימיות כגון ספקטרומטר מסה וניתוח כתם המערבי הנפוצות ביותר לזיהוי PTMs. הנה, שיטת טיהור חלבון מתוארת המאפשרת זיהוי של שני sumoylation וubiquitination של חלבוני קינטוכור, Ndc10 וNdc80, בSaccharomyces cerevisiae. מתח שמבטא Smt3 מתויג polyhistidine-הדגל (HF-Smt3) וmyc-מתויג Ndc10 או Ndc80 נבנה ומשמש למחקרים שלנו. לגילוי של sumoylation, אנחנו המצאנו פרוטוקול לזיקה לטהר מתויגים חלבוני sumoylated באמצעות חרוזים ניקל ושימוש בניתוח כתם מערבי עם אנטי-Myc נוגדנים לזהות Ndc10 sumoylatedND Ndc80. לגילוי של ubiquitination, אנחנו המצאנו פרוטוקול לimmunoprecipitation של חלבוני myc-מתויגים ושימוש בניתוח כתם מערבי עם נוגדן אנטי-UB להראות שNdc10 וNdc80 הם ubiquitinated. התוצאות שלנו מראות כי epitope מתויג חלבון עניין בו-הדגל מתויג מתח Smt3 מאפשר זיהוי של PTMs מרובה. מחקרים עתידיים צריכים לאפשר ניצול של טכניקה זו כדי לזהות ולאפיין אינטראקציות חלבון שתלויות בPTM ספציפי.

כדי לזהות sumoylation של חלבוני קינטוכור Ndc80 וNdc10, זנים עם HF-Smt3 וחלבונים מתוייגים Myc קינטוכור (Ndc80 או Ndc10) נבנו (טבלה 2), כפי שתוארו בעבר 9,12. conjugates HF-Smt3 היו מטוהר זיקה באמצעות חרוזים Ni-נת&quot;ע. ניתוח מערבי כתם של מטוהר HF-Smt3 עם גילוי אפשר נוגדן אנטי הדגל של צורות sumoylated של מצעי SUMO שנעדרו במתח השליטה ללא HF-Smt3 (איור 1 א ו -1 B, פנל משמאל). כצפוי, צורות רבות של מצעי SUMO אותרו במתח HF-Smt3. אנחנו הבאים נקבעו אם Ndc80 וNdc10 נמצאים בהמצומד HF-Smt3 מטוהר על ידי עושה ניתוח כתם מערבי באמצעות נוגדן אנטי-Myc. להקות רבות שהיו של משקל מולקולרי גבוה יותר מזה של Ndc80 או Ndc10 בבירור התגלו (איור 1 א ו -1 B, פנל מימין). יתר על כן, להקות מרובות של שני Ndc80 וNdc10הופחתו בתאי nocodazole טופלו (איור 1 ג ו1D). תוצאות אלו מראות כי טיהור חלבון וניתוח כתם המערבי מתוארות כאן מאפשרות זיהוי של sumoylation של Ndc80 וNdc10, כפי שתוארו בעבר 9. כדי לזהות ubiquitination של Ndc80 וNdc10, myc-מתויג Ndc80 או Ndc10 היה immunoprecipitated (IP) וניתוח כתם המערבי בוצע עם אנטי-Myc ואנטי-UB נוגדנים (איור 2). ניתוח של תמציות כל תא (WCE) וsupernatant (SUP) אישר את הביטוי של Ndc80-Myc וNdc10-Myc (איור 2 א). להקות המשקל מולקולריות נמוכות יותר בWCE עשויות לייצג מוצרים פגומים. דגימות IP מששו עם אנטי-Myc הראו להקות משקל מולקולריות גבוהות מרובות, המצביע על כך Ndc80 וNdc10 מכילים PTMs. דפוס laddering של דגימות ה- IP מששו עם נוגדן אנטי-UB הראה כי Ndc80 וNdc10 הם ubiquitinated (איור 2 א, α-UB). דפוס laddering של Ndc80 וNdc10 היה מוגבר על ידי טיפול במעכבי פרוטאזום (MG132) (איור 2, α-UB), המאשר נוסף שהלהקות האלה מייצגות פולי-ubiqutination. תוצאות הנציג עולות כי שני Ndc80 וNdc10 הם מצעים לsumoylation וubiquitination בס cerevisiae וכי שיטות טיהור החלבון תיארו שימושיות לזיהוי של PTMs כגון sumoylation וubiquitination. על פי מיטב ידיעתנו, זה הדיווח הראשון שNdc80 בס cerevisiae הוא מצע לubiquitination, למרות proteolysis היוביקוויטין תיווך של homolog אדם Hec1 כבר פורסם בעבר 11. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52482/52482fig1.jpg" /> איור 1: טיהור של מצעי sumolyated מאפשרת זיהוי של חלבוני קינטוכור Ndc80 וNdc10 כמו מצעי SUMO Pr.oteins חולצו וconjugates HF-Smt3 הוכן ונותח על ידי ניתוח כתם מערבי לאחר הפרדת SDS-עמוד. (A ו- B) Ndc80 וNdc10 הם sumoylated. חלבונים שהופקו מהתאים גדלו בטור הלוגריתמים בYPD. לוח שמאלי: מצעי SUMO סה&quot;כ אותרו עם נוגדן אנטי דגל. פנל ימני: Sumoylated Ndc80 או Ndc10 זוהה בconjugates HF-Smt3 כאשר חקר עם נוגדן אנטי-Myc. (C ו- D) Sumoylation של Ndc80 וNdc10 מצטמצם בתאים שטופלו nocodazole. בטור לוגריתמים תאים גדלו בYPD טופלו בDMSO (-) או DMSO + 20 מיקרוגרם / מיליליטר nocodazole (+) לשעה 2 ב 30 מעלות צלזיוס. conjugates HF-Smt3 נותח על ידי ניתוח כתם מערבי באמצעות נוגדן אנטי-Myc. זני שמרי Isogenic משמשים הם (A ו- C) YPH1800 (Ndc80-Myc), YMB7862 (-הדגל-SMT3 Ndc80-Myc) ו- (B ו- D) YPH1734 (Ndc10-Myc), YMB7867 (-פלורידהAG-SMT3 Ndc10-Myc). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52482/52482fig2.jpg" /> איור 2:. Ubiquitination של חלבוני קינטוכור Ndc80 וNdc10 הפקת החלבון וimmunoprecipitation בוצע כמתואר בפרוטוקול. () Ndc80 וNdc10 הם ubiquitinated. חלבונים שהופקו מהתאים גדלו בטור הלוגריתמים בYPD. תמצית תא כולו (WCE), supernatant (SUP), ושברי immunoprecipitated (IP) היו נתונים לSDS-עמוד. כתמים מערביים שמשו לזיהוי חלבוני myc-מתויגים וubiquitinated עם אנטי-Myc ונוגדנים-UB אנטי, בהתאמה. (ב) Ubiquitination של Ndc80 וNdc10 מוגבר בתאים שטופלו MG132 מעכבי פרוטאזום. תאים גדלו בטור לוגריתמים בYPD טופלו בDMSO (-) או DMSO + 50 מיקרומטר MG132 (+) בנוכחות 0.003% מSDS ל3 שעות על 30 מעלות צלזיוס, כפי שתואר בעבר 13 </sup&gt;. כתמים מערביים של שבר IP נעשה שימוש באנטי-Myc או אנטי-UB נוגדן. זני שמרי Isogenic משמשים הם YMB7278 (-הדגל-SMT3), YMB7862 (-הדגל-SMT3 Ndc80-Myc) וYMB7867 (-הדגל-SMT3 Ndc10-Myc). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פתרון </td><td> רכיבים </td></tr><tr><td> YPD </td><td> 1% תמצית שמרים, 2% bacto-peptone, גלוקוז 2% </td></tr><tr><td> מאגר guanidine </td><td> 0.1 M טריס- HCl pH 8.0, 6 M כלוריד guanidine, 0.5 M NaCl </td></tr><tr><td> מאגר </td><td> 50 מ&quot;מ טריס-HCl pH 7.5, 50 מ&quot;מ NaCl,, מעכבי 0.2% Triton X-100 1x פרוטאז </td></tr><tr><td> מאגר שבירה </td><td> 0.1 M טריס- HCl pH 8.0, 20% גליצרול, 1 מ&quot;מ PMSF </td></tr><tr><td> מאגר מדגם SUMEB </td><td> 1% SDS, 8 M אוריאה, 10 מ&quot;מ מגבים pH 6.8, 10 מ&quot;מ EDTA, 0.01% bromophenol כחול </td></tr><tr><td> מאגר מדגם 2x Laemmli </td><td> 100 מ&quot;מ טריס-HClpH 6.8, 4% SDS, גליצרול 20%, 0.2% bromophenol כחולים (לפני שימוש: להוסיף ב-mercaptoethanol (BME) לריכוז סופי של 200 מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> 1x TBST </td><td> 137 מ&quot;מ נתרן כלוריד, pH 20 מ&quot;מ טריס-HCL 7.5, 0.1% Tween-20 </td></tr></tbody></table> טבלת 1: פתרונות. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 2. זני שמרי שולחן משמשים ב* מחקר זה. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> זנים </td><td> הורה </td><td> גנוטיפ </td><td> התייחסות </td></tr><tr><td> BY4741 </td><td></td><td> מאטה his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 </td><td> Biosystems הפתוח </td></tr><tr><td> BY4742 </td><td></td><td> מאטה his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 </td><td> Biosystems הפתוח </td></tr><tr><td> YMB7278 </td><td> BY4741 / BY4742 </td><td> מאטה his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 HF-SMT3 :: LEU2 </td><td> מחקר זה </td></tr><tr><td> YPH1734 </td><td></td><td> מאטה ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC10-13Myc :: kanMX6 </td><td> Montpetit et al., 2006 </td></tr><tr><td> YPH1800 </td><td></td><td> מאטה ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC80-13Myc :: His3MX6 </td><td> Montpetit et al., 2006 </td></tr><tr><td> YMB7862 </td><td> YMB7278 / YPH1800 </td><td> His3MX6 מאטה his3 LEU2 URA3 ade2 TRP1 HF-SMT3 :: LEU2 NDC80-Myc :: </td><td> מחקר זה </td></tr><tr><td> YMB7867 </td><td> YMB7278 / YPH1734 </td><td> מאטה his3 LEU2 URA3 TRP1 lys2 HF-SMT3 :: LEU2 NDC10-Myc :: kanMX6 </td><td> מחקר זה </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> * כל שמרי הזנים נגזרים מSaccharomyces cerevisiae S288C. </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; טבלה 2: זני שמרים המשמשים במחקר זה.

Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80 at JoVE.com

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

כתב יד זה מתאר את הגילוי של sumoylation וubiquitination של חלבוני קינטוכור, Ndc10 וNdc80, בcerevisiae Saccharomyces שמרי ניצנים.

טכניקת טיהור חלבון המאפשרת איתור של Sumoylation וUbiquitination של שמרים להנץ החלבונים קינטוכור Ndc10 וNdc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

protein-purification-technique-that-allows-detection-sumoylation

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K Views.  National Cancer Institute, National Institute of Health.  כתב יד זה מתאר את הגילוי של sumoylation וubiquitination של חלבוני קינטוכור, Ndc10 וNdc80, בcerevisiae Saccharomyces שמרי ניצנים. 

Video: Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Biochemistry

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. This method utilizes a recombinant modified SUMO-trapping protein fragment, kmUTAG, derived from the Ulp1 SUMO protease of the stress-tolerant budding yeast Kluyveromyces marxianus. We have adapted the properties of the kmUTAG for the purpose of studying sumoylation in a variety of model systems without the use of antibodies. For the study of SUMO, KmUTAG has several advantages when compared to antibody-based approaches. This stress-tolerant SUMO-trapping reagent is produced recombinantly, it recognizes native SUMO isoforms from many species, and unlike commercially available antibodies it shows reduced affinity for free, unconjugated SUMO. Representative results shown here include the localization of SUMO conjugates in mammalian tissue culture cells and nematode oocytes.

SUMO is an essential and highly conserved, small ubiquitin-like modifier protein. In this protocol we are describing the use of a stress-tolerant recombinant SUMO-trapping protein (kmUTAG) to visualize native, untagged SUMO conjugates and their localization in a variety of cell types.

לוקליזציה של חלבונים ששונו באמצעות סומו פלורסנט-השמנה חלבונים

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

יצירת פרופיל אוביקוויפין ואוביקוויב-שינויים עצמאיים וזיהוי של שינויים משמעותיים

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

זיהוי של חלבון Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, including cell survival, proliferation, and differentiation. It is a reversible process that consists of a covalent attachment of ubiquitin to the substrate through a cascade reaction of at least three different enzymes, composed of E1 (Ubiquitin-activation enzyme), E2 (Ubiquitin-conjugating enzyme), and E3 (Ubiquitin-ligase enzyme). The E3 complex plays an important role in substrate recognition and ubiquitylation. Here, a protocol is described to evaluate substrate ubiquitylation in mammalian cells using transient co-transfection of a plasmid encoding the selected substrate, an E3 ubiquitin ligase, and a tagged ubiquitin. Before lysis, the transfected cells are treated with the proteasome inhibitor MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) to avoid substrate proteasomal degradation. Furthermore, the cell extract is submitted to small-scale immunoprecipitation (IP) to purify the polyubiquitylated substrate for subsequent detection by western blotting (WB) using specific antibodies for ubiquitin tag. Hence, a consistent and uncomplicated protocol for ubiquitylation assay in mammalian cells is described to assist scientists in addressing ubiquitylation of specific substrates and E3 ubiquitin ligases.

We provide a detailed protocol for a ubiquitylation assay of a specific substrate and an E3 ubiquitin-ligase in mammalian cells. HEK293T cell lines were used for protein overexpression, the polyubiquitylated substrate was purified from cell lysates by immunoprecipitation, and resolved in SDS-PAGE. Immunoblotting was used to visualize this post-translational modification.

הערכה של יוביקוויטילציה של מצע על ידי E3 יוביקוויטין-ליגאז בליסאטים של תאי יונקים

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate protein. The ubiquitination process occurs intracellularly in eukaryotes and regulates almost all basic cellular biological processes. Purification of ubiquitinated proteins aids the investigation of the role of ubiquitination in controlling the function of substrate proteins. Here, a step-by-step procedure to purify ubiquitinated proteins in mammalian cells is described with the p53 tumor suppressor protein as an example. Ubiquitinated p53 proteins were purified under stringent nondenaturing and denaturing conditions. Total cellular Flag-tagged p53 protein was purified with anti-Flag antibody-conjugated agarose under nondenaturing conditions. Alternatively, total cellular His-tagged ubiquitinated protein was purified using nickel-charged resin under denaturing conditions. Ubiquitinated p53 proteins in the eluates were successfully detected with specific antibodies. Using this procedure, the ubiquitinated forms of a given protein can be efficiently purified from mammalian cells, facilitating studies on the roles of ubiquitination in regulating protein function.

The protocol describes a step-by-step method to purify ubiquitinated proteins from mammalian cells using the p53 tumor suppressor protein as an example. Ubiquitinated p53 proteins were purified from cells under stringent nondenaturing and denaturing conditions.

טיהור של חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום מתאי יונקים

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

מדידת קישורים מוצלבים של DNA-PROTEIN Ubiquitylated, SUMOylated ו-ADP-Ribosylated

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

Author Spotlight: זיהוי כמותי של הצלבות חלבוני DNA והשינויים שלאחר התרגום  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

זיהוי כמותי של הצלבות DNA-חלבון והשינויים שלאחר התרגום

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

טכניקת טיהור חלבון המאפשרת איתור של Sumoylation וUbiquitination של שמרים להנץ החלבונים קינטוכור Ndc10 וNdc80

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

לוקליזציה של חלבונים ששונו באמצעות סומו פלורסנט-השמנה חלבונים

יצירת פרופיל אוביקוויפין ואוביקוויב-שינויים עצמאיים וזיהוי של שינויים משמעותיים

זיהוי של חלבון Ubiquitination

הערכה של יוביקוויטילציה של מצע על ידי E3 יוביקוויטין-ליגאז בליסאטים של תאי יונקים

טיהור של חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום מתאי יונקים

זיהוי כמותי של הצלבות DNA-חלבון והשינויים שלאחר התרגום

זיהוי כמותי של הצלבות DNA-חלבון והשינויים שלאחר התרגום

זיהוי כמותי של הצלבות DNA-חלבון והשינויים שלאחר התרגום

הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים