Usando este protocolo, as formas ubiquitinadas de uma determinada proteína podem ser eficientemente purificadas a partir de células de mamíferos, facilitando estudos sobre os papéis da ubiquitinação na regulação da função proteica. A purificação de proteínas ubiquitinadas em células de mamíferos em comparação com a purificação in vitro retém o modo de ligação da ubiquitina das proteínas-alvo sob condição mais radiológica. Comece adicionando 1,5 mililitros de meio sérico reduzido em três tubos de centrífuga de 15 mililitros.
Adicione DNA plasmidial pronto para transfecção a cada tubo e adicione 0,2 microgramas de plasmídeo de proteína fluorescente verde para monitorar a eficiência da transfecção. Adicione 78 microlitros de reagente de transfecção de lipossomas a 4,5 mililitros de meio sérico reduzido em outro tubo de centrífuga para diluir os lipossomas. Misture bem mexendo o tubo e, em seguida, deixe-o repousar durante cinco minutos à temperatura ambiente.
Adicionar 1,5 mililitros da solução de lipossoma diluída em cada tubo contendo 1,5 mililitros da solução de ADN diluído. Misture bem e faça a ligação cruzada dos plasmídeos com os lipossomas por pelo menos 20 minutos à temperatura ambiente. Descarte o meio original das placas de Petri e adicione nove mililitros do meio sérico reduzido em cada prato.
Adicione três mililitros da mistura de DNA do lipossomo e misture a solução agitando suavemente a placa para frente e para trás três vezes e, em seguida, para a esquerda e para a direita três vezes para distribuição uniforme da mistura na placa. Cultivar as células na incubadora umidificada a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5%. Substitua o meio após quatro a seis horas e continue a cultivar as células por 24 a 36 horas.
Após 24 a 36 horas, trate as células com MG132 a uma concentração final de 10 micromolares durante quatro a seis horas. Descarte o meio e lave as células duas vezes com PBS gelado. Adicione um mililitro de PBS ao prato.
Remova as células raspando-as com um raspador limpo e transfira a suspensão celular para tubos de microcentrífuga. Centrifugar a 700 G durante cinco minutos para recolher os pellets celulares. Adicione 800 microlitros do tampão de lise FLAG gelado suplementado com coquetel inibidor de protease às células de cada tubo.
Misture as células usando um oscilador de vórtice ou uma pistola de pipeta e, em seguida, incube a mistura em um rotador a quatro graus Celsius por 30 minutos. Ultrasonice a mistura no gelo com cada pulso durando um segundo e submeta a mistura a cinco a 10 pulsos breves. Incubar a mistura num rotador a 40 RPM durante 30 minutos a quatro graus Celsius.
Em seguida, centrifugar as amostras ultra-sonizadas a 8.000 G por 20 a 30 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga. Aliquot 80 microlitros do extrato da célula e misture com 20 microlitros de buffer de carregamento SDS 5X.
Ferva as amostras a 98 graus Celsius por cinco minutos. Esfrie no gelo por dois minutos e armazene a menos 20 graus Celsius até o uso. Use essas amostras como o grupo de entrada para monitorar a expressão de proteínas.
Em seguida, adicione 30 microlitros das esferas conjugadas do anticorpo anti-FLAG M2 aos extratos celulares restantes e incube em um rotador a quatro graus Celsius por pelo menos quatro horas ou durante a noite. Centrífuga a 1.500 G por dois minutos a quatro graus Celsius para coletar as contas. Adicione um mililitro do tampão de lise FLAG gelado às contas e misture invertendo o tubo várias vezes.
Repita este passo quatro a seis vezes e, em seguida, adicione 40 microlitros dos péptidos FLAG a uma concentração final de 200 nanogramas por microlitro às contas. Incubar em um rotador por duas horas, como mostrado anteriormente, e depois centrifugar na mesma temperatura. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga e adicione 10 microlitros de buffer de carga SDS 5X.
Ferva a mistura a 98 graus Celsius por cinco minutos e depois esfrie no gelo por dois minutos. Adicione um mililitro do PBS gelado aos pellets de células e misture uniformemente. Aliquot 100 microlitros da suspensão celular em um tubo de microcentrífuga como a amostra de entrada e centrífuga a 700 G por cinco minutos a quatro graus Celsius para coletar os pellets celulares.
Adicione 80 microlitros de tampão de lise FLAG à amostra de entrada e misture as células usando um oscilador de vórtice, como mostrado anteriormente. Lise as células no gelo por uma hora e depois centrifugar novamente por 20 a 30 minutos. Após a alíquota de centrifusão, coloque 80 microlitros do sobrenadante em um novo tubo de microcentrífuga e adicione 20 microlitros de tampão de carga SDS 5X ao sobrenadante.
Ferva a mistura a 98 graus Celsius por cinco a 10 minutos e depois esfrie no gelo por dois minutos. Centrifugar os 900 microlitros restantes da suspensão celular a 700 G por cinco minutos a quatro graus Celsius para coletar a pastilha celular. Adicione um mililitro de tampão de ubiquitina 1 aos pellets de células e misture pipetando para cima e para baixo várias vezes para distribuir as células uniformemente.
Submeta a célula lisa a 10 a 20 rodadas de ultrassom no gelo até que a solução não seja mais viscosa e, em seguida, centrifugar a solução. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga e adicione 30 microlitros de resina carregada de níquel ao sobrenadante. Incubar num rotador a 15 RPM durante quatro horas ou durante a noite à temperatura ambiente e, em seguida, centrifugar durante dois minutos.
Após a centrifusão, colete as contas e adicione um mililitro de tampão de ubiquitina 1 a ele. Incubar com rotação num agitador durante 10 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, centrifugar novamente a 1 500 G durante dois minutos, como indicado anteriormente. Adicione um mililitro de tampão de ubiquitina 2 às contas e realize a incubação seguida de centrifugação, como mostrado anteriormente, para coletar as contas.
Repita esta etapa uma vez. Em seguida, adicione um mililitro de PBS às contas e siga o mesmo procedimento de incubação e centrifugação para coletar as contas. Repita este passo mais uma vez.
Elute proteínas ligadas por incubação das esferas com 40 microlitros de imidazol a uma concentração final de 0,5 molar por uma hora à temperatura ambiente. Após a incubação, centrifugar novamente a 1.500 G por dois minutos. Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo e adicione 10 microlitros de buffer de carga SDS 5X.
Ferva a solução a 98 graus Celsius por cinco minutos e depois esfrie no gelo por dois minutos. Resolva as amostras por SDS-PAGE e, em seguida, transfira-as para uma membrana de nitrocelulose por western blotting para detectar proteínas-alvo usando os anticorpos correspondentes. Inicie o sistema de imagem de quimioluminescência para detectar sinais de western blotting.
Coloque a membrana de nitrocelulose na câmera obscura virada para cima. Codifique a solução de substrato uniformemente na membrana usando uma pistola de pipeta. Finalmente, selecione o procedimento de exposição automática para capturar os sinais quimioluminescentes e ajuste manualmente o tempo de exposição até que um sinal ideal seja adquirido.
A proteína p53 total, incluindo a p53 ubiquitinada, foi imunoprecipitada com esferas FLAG M2 de células H1299 em condições não desnaturantes. O eluato foi submetido a western blotting com anti p53 e anti hemaglutinina ou com anticorpos anti p53 e monoclonais. Aqui, os extratos de células brutas ou insumos foram submetidos a western blotting com anticorpos monoclonais anti p53 e anti MDM2.
O sinal da proteína p53 ubiquitinada, que aparece como uma banda manchada de baixo a alto peso molecular, foi acentuadamente aumentado quando o MDM2 foi expresso ectopicamente nessas células. Este resultado sugere que a proteína p53 ubiquitinada foi efetivamente purificada a partir das células. Em seguida, as células foram lisadas sob condições de desnaturação.
As proteínas ubiquitinadas celulares totais foram puxadas para baixo com resina carregada de níquel e foram então submetidas a western blotting com anticorpos monoclonais anti p53 e anti-hemaglutinina. A proteína p53 ubiquitinada foi detectada usando um anticorpo anti p53 e um anticorpo anti-hemaglutinina. Aqui no momento em que os extratos de células brutas ou de entrada foram submetidos a western blotting com anticorpos monoclonais anti p53 e anti MDM2.
Os resultados mostraram que o nível total de proteína ubiquitinada permaneceu inalterado, mas o nível de proteína p53 ubiquitinada aumentou drasticamente após o MDM2 ser superexpresso nessas células. Isso indica que as proteínas totais de ubiquitina contendo p53 ubiquitinado foram efetivamente retiradas dos lisados celulares sob condições de desnaturação. Ao tentar este procedimento, lembre-se de tratar as células com MG132 antes da coleta de células e ultra-sonicar as células adequadamente no gelo para a purificação de proteínas ubiquitinadas.
