Name: protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins ndc10 and ndc80
Uploaded: 2015-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80 at JoVE.com

We thank Dr. Oliver Kerscher for support and advice and members of the Basrai laboratory for their support and comments on the paper. This work was supported by the National Institutes of Health Intramural Research Program.

1. La crescita di cellule di lievito <ol><li> Inoculare cellule di lievito in 30 ml di YPD (Tabella 1) in un palloncino. Incubare a 30 ° C per una notte con agitazione. </li><li> Diluire le cellule ad una densità ottica di 0,2 a 600 nm (OD 600 = 0.2) in 50 ml di YPD e incubare a 30 ° C con agitazione. </li><li> Crescere la coltura ad una densità ottica di 1,0 a 600 nm (OD 600 = 1.0). </li><li> Celle di centrifugazione per 5 min a 2000 xg e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 40 ml di acqua sterile e centrifugare per 5 min a 2000 xg per lavare le cellule. Eliminare il surnatante e conservare il pellet cellulare a -20 ° C. </li></ol> 2. Estrazione di proteine <ol><li> Risospendere le cellule in 0,5 ml di ghiacciata buffer di guanidina (Tabella 1) per il dosaggio di pull-down con Ni-NTA perline Superflow o tampone A (Tabella 1) per immunoprecipitazione. Tenere tubi sul ghiaccio in ogni momento. </li><li> Trasferimento a 2 ml tubo tappo a vite. </li><li> Aggiungere lo stesso volume di perline di vetro (Table of Materials). </li><li> Bead-battere le celle di una mini tallone battitore (tabella dei materiali) per 2 minuti a temperatura ambiente, poi posto in ghiaccio per 2-3 minuti. Ripetere questa operazione tre volte. </li><li> Vortex sulla alta velocità a 4 ° C per 30-60 min. Controllare le cellule mediante visualizzazione al microscopio per assicurare che le cellule sono lisate. Nota: cellule lisate appariranno fantasmi scuri e la mancanza di un confine o una forma definita. In modo ottimale almeno l&#39;80% delle cellule dovrebbe essere lisato. </li><li> Perforare un foro nella parte inferiore del tubo con una puntina e posto in una collezione tubo da 15 ml (tappo a vite deve essere sciolto). </li><li> Centrifugare a 1000 xg per 1 minuto per raccogliere il lisato. </li><li> Trasferire il lisato in una provetta da centrifuga micro. </li><li> Centrifugare a 15.000 xg per 30 min a 4 ° C per raccogliere le proteine ​​estratte. </li><li> Misurare la concentrazione delle proteine ​​estratte usando l&#39;assa proteiney Kit (Tabella dei Materiali) e normalizzare tutti gli estratti per contenere la stessa quantità di proteine. Portare il volume totale di 1 ml con tampone appropriato. Nota: Circa 5 mg di proteine ​​totali è ottenuta da 50 OD 600 cellule. </li><li> Risparmia il 50 microlitri (250 ug di proteine ​​se la proteina totale estratto dal punto 2.10 è di 5 mg), come estratto di cellula intera (WCE). Aggiungere 50 ml di tampone campione 2x Laemmli (Tabella 1) e incubare a 100 ° C in un blocco di calore per 3-5 min. Carico 10 ml di ogni campione in un gel SDS-PAGE per Western Blot analisi (Sezione 5: analisi Western Blot). </li></ol> 3. Purificazione di HF-Smt3 Coniugati <ol><li> Ottenere le perline Superflow Ni-NTA (Tabella dei Materiali) necessari per gli esperimenti (100 ml di perline per campione) tramite centrifugazione a bassa velocità (800-1,500 xg) per 1 min. Rimuovere il surnatante. </li><li> Lavare perline 5x con 1 ml di PBS (Table of Materials): Inverti top-overfondo fino a quando le perle sono risospese, raccogliere perle di centrifugazione a bassa velocità, e rimuovere il surnatante. </li><li> Sospendere perline in 1 ml di tampone guanidina (Tabella 1) e un&#39;aliquota nel numero di tubi corrispondenti ai campioni da trattare. Raccogliere perle per centrifugazione a bassa velocità, e rimuovere il surnatante. Mescolare le perline ben invertendo top-over in basso. Nota: Miscelare cordoni ben invertendo bottom top-over. </li><li> Per ciascun campione, aggiungere 950 microlitri della restante WCE (dal punto 2.11: Estrazione di proteine) a 100 ml di Ni-NTA perline Superflow. </li><li> Incubare su una piattaforma oscillante a 4 ° C per almeno 4 ore o tutta la notte. </li><li> Centrifugare a 800-1,500 xg per 1 min a 4 ° C. </li><li> Risparmia il 50 microlitri come surnatante (SUP). Aggiungere 50 ml di tampone campione 2x Laemmli e incubare a 100 ° C in un blocco di calore per 3-5 min. Carico 10 ml di ogni campione in un gel SDS-PAGE per Western Blot analisi (Sezione 5: anal Western BlotYsis). </li><li> Perline Lavare una volta con 1 ml di tampone guanidina per 5-10 minuti su una piattaforma oscillante. </li><li> Lavare perline 5x con 1 ml di tampone di rottura (Tabella 1) per 5-10 minuti su una piattaforma oscillante. </li><li> Perline Risospendere in 90 ml di tampone campione 2x Laemmli. </li><li> Aggiungere 10 ml di 1 M imidazolo. Nota: Imidazolo aiuta a dissociarsi proteina His-tag da perline Ni-NTA dovuta all&#39;interazione competizione tra imidazolo e le perle. </li><li> Incubare a 100 ° C in un blocco di calore per 3-5 min. </li><li> Vortex, quindi centrifugare a 13.000 g per 30 sec. Trasferire il surnatante in una nuova provetta. </li><li> Carico 10-20 ml di ogni campione in un gel SDS-PAGE per Western Blot analisi (Sezione 5: analisi Western Blot). Nota: 10-20 ml corrisponde a 0,5-1,0 mg di ingresso, se viene utilizzato 5 mg di WCE. </li></ol> 4. Immunoprecipitation di Myc-tag cinetocore Proteine <ol><li> Ottenere anti-c-Myc affinità agarosio gel untibody (Tabella dei Materiali) necessari per gli esperimenti (25 microlitri di resina per campione) tramite centrifugazione a bassa velocità (800-1,500 xg). Rimuovere il surnatante. </li><li> 5x resina Lavare con 1 ml di tampone A: Inverti top-over-basso fino la resina viene risospeso, raccolgono resina tramite centrifugazione a bassa velocità, e rimuovere il surnatante. </li><li> Sospendere resina in 1 ml di tampone A e Aliquotare nel numero di tubi corrispondenti ai campioni da trattare. Raccogliere resina mediante centrifugazione a bassa velocità, e rimuovere il surnatante. Nota: Mescolare la resina ben invertendo top-over-bottom. </li><li> Aggiungere 950 microlitri della restante WCE (dal punto 2.11: Estrazione di proteine) a 25 ml di resina. </li><li> Incubare su una piattaforma oscillante a 4 ° C durante la notte. </li><li> Centrifugare a 800-1,500 xg per 1 min a 4 ° C. </li><li> Risparmia il 50 microlitri come surnatante (SUP). Aggiungere 50 ml di tampone campione 2x Laemmli e incubare a 100 ° C in un blocco di calore per 3-5 min. Load 10 ml di ogni campione in un gel SDS-PAGE per l&#39;analisi Western Blot (Sezione 5: analisi Western Blot). </li><li> 5x resina Lavare con 1 ml di tampone A: Inverti top-over-basso fino la resina viene risospeso, raccolgono resina tramite centrifugazione a bassa velocità, e rimuovere il surnatante. </li><li> Risospendere la resina in 100 ml di tampone campione SUMEB (Tabella 1). Nota: tampone campione SUMEB contiene 8 M Urea e 1% SDS (forte condizione di denaturazione). </li><li> Incubare a 100 ° C in un blocco di calore per 3-5 min. </li><li> Vortex, quindi centrifugare a 13.000 g per 30 sec. Trasferire il surnatante in una nuova provetta. </li><li> Carico 10-20 ml di ogni campione in un gel SDS-PAGE per Western Blot analisi (Sezione 5: analisi Western Blot). Nota: 10-20 ml corrisponde a 0,5-1,0 mg di ingresso, se viene utilizzato 5 mg di WCE. </li></ol> 5. Western Blot analisi <ol><li> Caricare i estratti proteici di 4-12% Bis-Tris gels (Tabella dei Materiali) e perfelettroforesi orm a 120 V per 90 min (buffer di Esecuzione: Tabella dei Materiali). </li><li> Trasferire le proteine ​​da gel su una membrana di nitrocellulosa (Table of Materials) usando un dispositivo di trasferimento a 30 V per 90 min (Buffer di trasferimento: Table of Materials). </li><li> Bloccare la membrana in 5% di latte / 1x TBST (Tabella 1) per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Incubare a membrana con anticorpo primario (Table of Materials) a 5% di latte / 1x TBST notte a 4 ° C. Per anticorpi primari, utilizzare una diluizione di 1: 1.000 (anticorpi anti-Flag e anti-Ub) o 1: 5.000 (anticorpo anti-Myc). </li><li> Lavare membrana 3x per 10 minuti ciascuno con 1x TBST. </li><li> Incubare a membrana con anticorpo secondario (Tabella dei Materiali) a 5% di latte / 1x TBST per 1 ora a temperatura ambiente. Usare una diluizione 1: 5.000 del anticorpi secondari. </li><li> Lavare membrana 3x per 10 minuti ciascuno con 1x TBST. </li><li> Incubare a membrana con ECL workisoluzione ng (Table of Materials) per 5 min. </li><li> Esporre la membrana blu X-ray film sensibile (Tabella dei Materiali) e sviluppare utilizzando uno sviluppatore automatica (Table of Materials). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Tag epitopo quali HA, Myc, Bandiera, e GST sono ampiamente utilizzati per l&#39;analisi biochimica delle proteine. Costruzione di ceppi con HF-Smt3 e proteine ​​cinetocore Myc-tag, come Ndc10 e Ndc80, facilita l&#39;individuazione di PTM, come sumoilazione e ubiquitinazione. HF-Smt3 tirare giù test permette la rilevazione di proteine ​​cinetocore sumoylated, Ndc10 e Ndc80 (Figura 1). Il protocollo di purificazione per affinità e western blot utilizzando un anticorpo anti-Flag stabilire la specificità di interazione tra HF-Smt3 e proteine ​​bersaglio, come proteine ​​modificate non sono stati rilevati nel ceppo di controllo senza HF-Smt3. L&#39;uso del tag Myc sui substrati proteici convalida la presenza di sumoylated Ndc10 e Ndc80 nei coniugati HF-Smt3. Inoltre, sumoilazione sia Ndc10 e Ndc80 è stata ridotta nelle cellule trattate nocodazole (Figura 1C e 1D). Diminuzione sumoylation di Ndc10 in risposta a treatmen nocodazolet, ma non Ndc80, è stato precedentemente riportato da Montpetit et al. 9. Ciò può essere dovuto a differenze nel protocollo sperimentale e l&#39;uso di un anticorpo anti-SUMO personalizzata. I nostri risultati per sumoylation di substrati cinetocoro suggeriscono che un protocollo simile può essere usato per studiare altri substrati candidato SUMO. Per rilevare ubiquitinazione, proteine ​​cinetocore Myc-tag sono stati immunoprecipitati e le frazioni IP sono stati sondati con anticorpi anti-Ub (Figura 2). Il modello di laddering Ndc10 e Ndc80 è stata aumentata quando le cellule sono state trattate con MG132 per inibire la funzione del proteasoma (Figura 2B), indicando che queste proteine ​​sono substrati del proteasoma. Le frazioni IP non sono riusciti a rilevare sumoilazione di Ndc10 o Ndc80 in analisi Western Blot con anticorpi anti-Flag o anticorpo anti-Smt3 (dati non mostrati). Ciò può essere dovuto a ragioni tecniche quali i livelli di supporto sumoylated nella frazione IP o il interference dai tag epitopi. Ulteriore ottimizzazione del protocollo IP, come la concentrazione di sali e condizioni blotting occidentali dovrebbe facilitare l&#39;individuazione di molteplici PTM di qualsiasi proteina di interesse. Attualmente, sumoilazione è migliore rilevata dal HF-Smt3 pull down assay seguita da Western blot dei substrati candidato SUMO (Figura 1). Molti dettagli influenzano l&#39;efficienza di purificazione di proteine ​​e la capacità di rilevare la PTMs. In primo luogo, tutti i tubi devono essere tenuti in ghiaccio per inibire le proteasi a eccezione delle indicazioni. In secondo luogo, un rapporto 1: 1 di sospensione cellulare in perline di vetro è fondamentale per distruggere le cellule dal battitore tallone e / o vortex. Lisi delle cellule devono essere monitorati con l&#39;esame delle cellule sotto il microscopio. In terzo luogo, è molto importante preparare un lisato chiarificato per il saggio di pull down o IP. Breve o centrifugazione a bassa velocità può contribuire alla contaminazione di detriti cellulari nel lisato e questo influenza la capacità di detect il PTM. Infine, vigorosa agitazione delle perle con un grande volume di lisato chiaro (circa 1 ml) in una provetta da centrifuga da 1,5 ml micro assicura che le perle sono completamente sospesi per il saggio o IP discesa. In sintesi, purificazione di proteine ​​e tecniche di rivelazione, come quella qui descritta forniscono importanti intuizioni meccanicistici in come PTM delle proteine ​​cinetocore pregiudica la loro struttura e assemblaggio per il cromosoma fedeli separazione 14, 15.

Ubiquitinazione e sumoilazione permettono la coniugazione di ubiquitina e Modifier Piccolo ubiquitina-simile (SUMO, Smt3 in S. cerevisiae 1) ad una proteina bersaglio, rispettivamente. PTM di proteine ​​cinetocore influenzano i livelli cellulari e interazioni proteina-proteina durante le diverse fasi del ciclo cellulare per garantire fedele segregazione dei cromosomi. Ad esempio, i livelli cellulari di Cse4 / CENP-A e proteine ​​cinetocore esterno DSN1 sono regolate da proteolisi ubiquitina-mediata per garantire la stabilità del genoma 2-5. Destabilizzazione degli allegati cinetocore-microtubuli non corretti richiede la B chinasi Ipl1 / Aurora, che fosforila Dam1 e Ndc80 complessi che interagiscono direttamente con i microtubuli 6-8. Nonostante l&#39;identificazione di oltre settanta proteine ​​cinetocore, ci sono molto pochi gli studi che indagano le modifiche di queste proteine ​​con PTM, ad esempio, l&#39;ubiquitina e SUMO. Una limitazione importante è la capacità di conservare la PTMs durante la purificazione e la scarsità di anticorpi personalizzati per la rilevazione di PTM come sumoylation, fosforilazione, metilazione, e altri. Caratterizzazione di proteine ​​cinetocore sumoylated Ndc10, Cep3, Bir1, e Ndc80 utilizzato un anticorpo personalizzato 9. Inoltre, Ndc10 è stata implicata come substrato per 10 ubiquitinazione. Hec1 umana (Ndc80 in S. cerevisiae) è anche substrato per ubiquitinazione, regolato da APC / C-hCdh1 E3 ligasi 11. Pertanto, Ndc10 e Ndc80 sono buoni candidati per l&#39;ottimizzazione del protocollo per rilevare sia sumoilazione e ubiquitinazione in S. cerevisiae. Per facilitare l&#39;individuazione di sumoilazione, abbiamo costruito i ceppi che esprimono HF-Smt3 e Myc-tag Ndc10 o Ndc80. L&#39;uso di tag epitopi (HF: His6-Flag) riduce al minimo il fondo a causa della cross-reattività che è frequente nel siero policlonale sollevata contro una proteina candidato. Abbiamo ideato un protocollo per affinitàpurificare coniugati HF-Smt3 e poi utilizzati commerciale anti-Flag e anticorpi anti-myc per rilevare la presenza di sumolyated Ndc10 e Ndc80 nella preparazione Smt3 purificato. Per ubiquitination, abbiamo ideato un protocollo immunoprecipitazione modificata che conserva ubiquitinazione delle proteine ​​cinetocore Myc-targhette e svolta western blot con l&#39;anticorpo commerciale anti-Ub per rilevare ubiquitinazione di Ndc10 e Ndc80.

<table><tbody><tr><td>Glass beads</td><td>BioSpec Products</td><td>11079105</td><td>0.5 mm diameter</td></tr><tr><td>Mini beadbeater</td><td>BioSpec Products</td><td>#693</td><td>8 cell disrupter</td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8215</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7470</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>Primary antibody, dilution 1:1,000</td></tr><tr><td>c-Myc antibody (A-14)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-789</td><td>Primary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>Purified mouse antibody monoclonal 9E10</td><td>Covance</td><td>MMS-150P</td><td>Primary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody</td><td>Covance</td><td>MMS-258R</td><td>Primary antibody, dilution 1:1,000</td></tr><tr><td>ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA934V</td><td>Secondary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA931V</td><td>Secondary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>DC protein assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane</td><td>Novex</td><td>LC2001</td><td>0.45 mm pore size</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>Novex</td><td>NP0321BOX</td><td>1.0 mm, 10 well</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer</td><td>Novex</td><td>NP0002</td><td>20x</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer</td><td>Novex</td><td>NP0006-1</td><td>20x</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>34078</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS pH7.4</td><td>GIBCO</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Blue sensitive X-Ray film</td><td>Dbio</td><td>DBOF30003</td><td></td></tr><tr><td>Automatic developer</td><td>Kodak</td><td>M35AX-OMAT</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td>50 mg</td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2619</td><td>25 mg</td></tr></tbody></table>

protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins ndc10 and ndc80

Modificazioni post-traduzionali (PTM), come fosforilazione, metilazione, acetilazione, ubiquitinazione e sumoilazione, regolano la funzione cellulare di molte proteine. PTM di proteine ​​cinetocore che associano con il DNA centromerico mediano fedele segregazione dei cromosomi per mantenere la stabilità del genoma. Approcci biochimici come la spettrometria di massa e analisi di western blot sono più comunemente utilizzati per l&#39;identificazione di PTM. Qui, un metodo di purificazione della proteina è descritto che permette il rilevamento di entrambe sumoylation e ubiquitinazione delle proteine ​​cinetocore, Ndc10 e Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. Un ceppo che esprime polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) e Myc-tagged Ndc10 o Ndc80 è stato costruito e utilizzato per i nostri studi. Per il rilevamento di sumoylation, abbiamo ideato un protocollo per affinità purificare proteine ​​sumoylated His-tagged utilizzando perline di nichel e usato western blot con anticorpi anti-Myc per rilevare sumoylated Ndc10 unnd Ndc80. Per il rilevamento di ubiquitinazione, abbiamo ideato un protocollo per immunoprecipitazione di proteine ​​Myc-tag e utilizzato analisi Western Blot con anticorpi anti-Ub per dimostrare che Ndc10 e Ndc80 sono ubiquitinate. I nostri risultati mostrano che epitopi di proteine ​​tag di interesse per il suo-Flag tagged ceppo Smt3 facilita l&#39;individuazione di molteplici PTM. Studi futuri dovrebbero consentire lo sfruttamento di questa tecnica per identificare e caratterizzare le interazioni proteina che dipendono da uno specifico PTM.

Per rilevare sumoylation di proteine ​​cinetocore Ndc80 e Ndc10, ceppi con HF-Smt3 e proteine ​​cinetocore Myc-tag (Ndc80 o Ndc10) sono stati costruiti (Tabella 2), come descritto in precedenza 9,12. Coniugati HF-Smt3 stati affinità purificate utilizzando Ni-NTA perline. Analisi Western blot di purificato HF-Smt3 con un anticorpo anti-Flag permesso rilevamento di forme sumoylated di substrati SUMO che erano assenti nel ceppo di controllo senza HF-Smt3 (Figura 1A e 1B, pannello di sinistra). Come previsto, molteplici forme di substrati SUMO sono stati rilevati nel ceppo HF-Smt3. Abbiamo poi stabilito se Ndc80 e Ndc10 sono presenti nel purificata HF-Smt3 coniugato effettuando analisi western blot utilizzando un anticorpo anti-Myc. Più bande che erano di peso molecolare superiore a quello del Ndc80 o Ndc10 erano chiaramente rilevati (Figura 1A e 1B, pannello di destra). Inoltre, più bande di entrambi Ndc80 e Ndc10sono stati ridotti in cellule trattate nocodazole (Figura 1C e 1D). Questi risultati mostrano che la purificazione di proteine ​​e western blot descritte permettono di rilevare sumoilazione di Ndc80 e Ndc10, come descritto in precedenza 9. Per rilevare ubiquitination di Ndc80 e Ndc10, Myc-tagged Ndc80 o Ndc10 stata immunoprecipitati (IP) e l&#39;analisi Western Blot è stato eseguito con l&#39;anti-Myc e anti-Ub anticorpi (Figura 2). Analisi di estratti cellulari totali (ECO) e surnatante (SUP) ha confermato l&#39;espressione di Ndc80-Myc e Ndc10-Myc (Figura 2A). Le bande con peso molecolare inferiore sul WCE possono rappresentare prodotti di degradazione. Campioni IP sondato con anticorpi anti-Myc mostrato bande multiple ad alto peso molecolare, il che suggerisce che Ndc80 e Ndc10 contengono PTM. Un modello laddering di campioni IP sondati con anticorpi anti-Ub mostrato che Ndc80 e Ndc10 sono ubiquitinate (Figura 2A, α-Ub). Il modello di laddering Ndc80 e Ndc10 sono stati rafforzati dal trattamento con inibitore del proteasoma (MG132) (Figura 2B, α-Ub), ulteriore conferma che queste bande rappresentano poli-ubiqutination. I risultati rappresentativi rivelano che sia Ndc80 e Ndc10 sono substrati sumoilazione e ubiquitinazione in S. cerevisiae e che la proteina metodi di purificazione descritti sono utili per il rilevamento di PTM come sumoilazione e ubiquitinazione. Secondo la nostra conoscenza, questo è il primo rapporto che Ndc80 a S. cerevisiae è un substrato per ubiquitination, sebbene ubiquitina mediata proteolisi l&#39;omologo umano Hec1 è stato pubblicato in precedenza 11. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52482/52482fig1.jpg" /> Figura 1: Purificazione di substrati sumolyated permette l&#39;identificazione di proteine ​​cinetocore Ndc80 e Ndc10 come substrati SUMO Pr.oteins sono stati estratti e coniugati HF-Smt3 sono stati preparati e analizzati mediante western blot dopo la separazione SDS-PAGE. (A e B) e Ndc80 Ndc10 sono sumoylated. Le proteine ​​sono stati estratti dalle cellule logaritmica crescita in YPD. A sinistra: substrati SUMO totali sono stati rilevati con un anticorpo anti-Flag. A destra: Sumoylated Ndc80 o Ndc10 è stato rilevato nei coniugati HF-Smt3 quando sondato con un anticorpo anti-Myc. (C e D) sumoilazione di Ndc80 e Ndc10 è ridotta in cellule trattate nocodazole. Logaritmicamente cellule in crescita in YPD sono stati trattati con DMSO (-) o DMSO + 20 mcg / ml nocodazole (+) per 2 ore a 30 ° C. Coniugati HF-Smt3 sono stati analizzati mediante analisi western blot utilizzando un anticorpo anti-Myc. Lieviti isogenici usate sono (A e C) YPH1800 (Ndc80-Myc), YMB7862 (His-Flag-SMT3 Ndc80-Myc) e (B e D) YPH1734 (Ndc10-Myc), YMB7867 (His-Flag-SMT3 Ndc10-Myc). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52482/52482fig2.jpg" /> Figura 2:. Ubiquitinazione di proteine ​​cinetocore Ndc80 e Ndc10 Estrazione di proteine ​​e immunoprecipitazione sono state eseguite come descritto nel protocollo. (A) Ndc80 e Ndc10 sono ubiquitinate. Le proteine ​​sono stati estratti dalle cellule logaritmica crescita in YPD. Estratto di cellule intere (ECO), surnatante (SUP), e le frazioni (IP) immunoprecipitati sono stati sottoposti a SDS-PAGE. Macchie occidentali sono stati usati per rilevare le proteine ​​Myc-targhette e ubiquitinate con anti-Myc e anticorpi anti-Ub, rispettivamente. (B) Ubiquitinazione di Ndc80 e Ndc10 è aumentata in cellule trattate con l&#39;inibitore del proteasoma MG132. Cellule logaritmicamente crescita in YPD sono stati trattati con DMSO (-) o DMSO + 50 pM MG132 (+) in presenza di 0,003% di SDS per 3 ore a 30 ° C, come precedentemente descritto 13 </sup&gt;. Western blot di frazione IP sono stati fatti usando anti-Myc o anticorpo anti-Ub. Lieviti isogenici utilizzati sono YMB7278 (His-Flag-SMT3), YMB7862 (His-Flag-SMT3 Ndc80-Myc) e YMB7867 (His-Flag-SMT3 Ndc10-Myc). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Soluzione </td><td> Componenti </td></tr><tr><td> YPD </td><td> Estratto di lievito 1%, 2% Bacto-peptone, 2% di glucosio </td></tr><tr><td> Buffer Guanidine </td><td> 0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 6 M cloruro di guanidina, 0,5 M NaCl </td></tr><tr><td> Buffer A </td><td> 50 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl 50 mM, 0,2% Triton, inibitori della proteasi 1x X-100 </td></tr><tr><td> Buffer Rompere </td><td> 0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 20% glicerolo, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> Tampone campione SUMEB </td><td> 1% SDS, 8 M Urea, 10 mM MOPS pH 6,8, EDTA 10 mm, 0,01% di bromofenolo blu </td></tr><tr><td> 2x Laemmli Sample Buffer </td><td> 100 mM Tris-HClpH 6,8, 4% SDS, 20% glicerolo, 0,2% blu di bromofenolo (Prima dell&#39;uso: aggiungere b-mercaptoetanolo (BME) ad una concentrazione finale di 200 mM) </td></tr><tr><td> 1x TBST </td><td> 137 mM cloruro di sodio, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1% Tween-20 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Soluzioni. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Tabella 2. ceppi di lievito usati in questo studio *. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tensioni </td><td> Genitore </td><td> Genotipo </td><td> Riferimento </td></tr><tr><td> BY4741 </td><td></td><td> MATA his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 </td><td> Aperto Biosystems </td></tr><tr><td> BY4742 </td><td></td><td> MATA his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 </td><td> Aperto Biosystems </td></tr><tr><td> YMB7278 </td><td> BY4741 / BY4742 </td><td> MATA his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 HF-SMT3 :: LEU2 </td><td> Questo studio </td></tr><tr><td> YPH1734 </td><td></td><td> MATA ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC10-13Myc :: kanMX6 </td><td> Montpetit et al., 2006 </td></tr><tr><td> YPH1800 </td><td></td><td> MATA ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC80-13Myc :: His3MX6 </td><td> Montpetit et al., 2006 </td></tr><tr><td> YMB7862 </td><td> YMB7278 / YPH1800 </td><td> MATA his3 LEU2 URA3 ADE2 TRP1 HF-SMT3 :: LEU2 Ndc80-Myc :: His3MX6 </td><td> Questo studio </td></tr><tr><td> YMB7867 </td><td> YMB7278 / YPH1734 </td><td> MATA his3 LEU2 URA3 TRP1 lys2 HF-SMT3 :: LEU2 NDC10-Myc :: kanMX6 </td><td> Questo studio </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> * Tutti i ceppi di lievito sono derivati ​​da Saccharomyces cerevisiae S288c. </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Tabella 2: ceppi di lievito utilizzato in questo studio.

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Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Questo manoscritto descrive la rilevazione di sumoilazione e ubiquitinazione delle proteine ​​cinetocore, Ndc10 e Ndc80, nel lievito Saccharomyces cerevisiae erba.

Purificazione delle proteine ​​tecnica che permette la rilevazione di sumoilazione e Ubiquitinazione di lievito in erba cinetocore proteine ​​Ndc10 e Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K Views.  National Cancer Institute, National Institute of Health.  Questo manoscritto descrive la rilevazione di sumoilazione e ubiquitinazione delle proteine ​​cinetocore, Ndc10 e Ndc80, nel lievito Saccharomyces cerevisiae erba. 

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Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Ricerca

Biochimica

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. This method utilizes a recombinant modified SUMO-trapping protein fragment, kmUTAG, derived from the Ulp1 SUMO protease of the stress-tolerant budding yeast Kluyveromyces marxianus. We have adapted the properties of the kmUTAG for the purpose of studying sumoylation in a variety of model systems without the use of antibodies. For the study of SUMO, KmUTAG has several advantages when compared to antibody-based approaches. This stress-tolerant SUMO-trapping reagent is produced recombinantly, it recognizes native SUMO isoforms from many species, and unlike commercially available antibodies it shows reduced affinity for free, unconjugated SUMO. Representative results shown here include the localization of SUMO conjugates in mammalian tissue culture cells and nematode oocytes.

SUMO is an essential and highly conserved, small ubiquitin-like modifier protein. In this protocol we are describing the use of a stress-tolerant recombinant SUMO-trapping protein (kmUTAG) to visualize native, untagged SUMO conjugates and their localization in a variety of cell types.

Localizzazione delle proteine di SUMO-modificate utilizzando proteine di cattura di Sumo fluorescente

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

Profilazione delle modifiche post-traduzionali dipendenti da Ubiquitin e Ubiquitine e identificazione di alterazioni significative

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

Rilevamento di proteine ​​Ubiquitinazione

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Biologia

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, including cell survival, proliferation, and differentiation. It is a reversible process that consists of a covalent attachment of ubiquitin to the substrate through a cascade reaction of at least three different enzymes, composed of E1 (Ubiquitin-activation enzyme), E2 (Ubiquitin-conjugating enzyme), and E3 (Ubiquitin-ligase enzyme). The E3 complex plays an important role in substrate recognition and ubiquitylation. Here, a protocol is described to evaluate substrate ubiquitylation in mammalian cells using transient co-transfection of a plasmid encoding the selected substrate, an E3 ubiquitin ligase, and a tagged ubiquitin. Before lysis, the transfected cells are treated with the proteasome inhibitor MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) to avoid substrate proteasomal degradation. Furthermore, the cell extract is submitted to small-scale immunoprecipitation (IP) to purify the polyubiquitylated substrate for subsequent detection by western blotting (WB) using specific antibodies for ubiquitin tag. Hence, a consistent and uncomplicated protocol for ubiquitylation assay in mammalian cells is described to assist scientists in addressing ubiquitylation of specific substrates and E3 ubiquitin ligases.

We provide a detailed protocol for a ubiquitylation assay of a specific substrate and an E3 ubiquitin-ligase in mammalian cells. HEK293T cell lines were used for protein overexpression, the polyubiquitylated substrate was purified from cell lysates by immunoprecipitation, and resolved in SDS-PAGE. Immunoblotting was used to visualize this post-translational modification.

Valutazione dell'ubiquitilazione del substrato mediante ubiquitina-ligasi E3 nei lisati a cellule di mammifero

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate protein. The ubiquitination process occurs intracellularly in eukaryotes and regulates almost all basic cellular biological processes. Purification of ubiquitinated proteins aids the investigation of the role of ubiquitination in controlling the function of substrate proteins. Here, a step-by-step procedure to purify ubiquitinated proteins in mammalian cells is described with the p53 tumor suppressor protein as an example. Ubiquitinated p53 proteins were purified under stringent nondenaturing and denaturing conditions. Total cellular Flag-tagged p53 protein was purified with anti-Flag antibody-conjugated agarose under nondenaturing conditions. Alternatively, total cellular His-tagged ubiquitinated protein was purified using nickel-charged resin under denaturing conditions. Ubiquitinated p53 proteins in the eluates were successfully detected with specific antibodies. Using this procedure, the ubiquitinated forms of a given protein can be efficiently purified from mammalian cells, facilitating studies on the roles of ubiquitination in regulating protein function.

The protocol describes a step-by-step method to purify ubiquitinated proteins from mammalian cells using the p53 tumor suppressor protein as an example. Ubiquitinated p53 proteins were purified from cells under stringent nondenaturing and denaturing conditions.

Purificazione delle proteine ubiquitinate p53 da cellule di mammifero

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Misurazione dei legami incrociati DNA-proteina ubiquitinati, SUMOilati e ADP-ribosilati

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

Autore in primo piano: Rilevamento quantitativo dei legami incrociati delle proteine del DNA e delle loro modifiche post-traduzionali  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

Rilevazione quantitativa dei legami incrociati DNA-proteina e delle loro modificazioni post-traduzionali

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Germogliamento lievito proteine ​​estrazione e purificazione per lo Studio della funzione, interazioni e modificazioni post-traduzionali

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Purificazione delle proteine tecnica che permette la rilevazione di sumoilazione e Ubiquitinazione di lievito in erba cinetocore proteine Ndc10 e Ndc80

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

Localizzazione delle proteine di SUMO-modificate utilizzando proteine di cattura di Sumo fluorescente

Profilazione delle modifiche post-traduzionali dipendenti da Ubiquitin e Ubiquitine e identificazione di alterazioni significative

Rilevamento di proteine Ubiquitinazione

Valutazione dell'ubiquitilazione del substrato mediante ubiquitina-ligasi E3 nei lisati a cellule di mammifero

Purificazione delle proteine ubiquitinate p53 da cellule di mammifero

Rilevazione quantitativa dei legami incrociati DNA-proteina e delle loro modificazioni post-traduzionali

Rilevazione quantitativa dei legami incrociati DNA-proteina e delle loro modificazioni post-traduzionali

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Germogliamento lievito proteine estrazione e purificazione per lo Studio della funzione, interazioni e modificazioni post-traduzionali

Purificazione delle proteine ​​tecnica che permette la rilevazione di sumoilazione e Ubiquitinazione di lievito in erba cinetocore proteine ​​Ndc10 e Ndc80

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