Name: protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins ndc10 and ndc80
Uploaded: 2015-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
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We thank Dr. Oliver Kerscher for support and advice and members of the Basrai laboratory for their support and comments on the paper. This work was supported by the National Institutes of Health Intramural Research Program.

효모 세포의 성장 (1) <ol><li> 작은 플라스크에 YPD (표 1) 30 ㎖에 효모 세포를 접종한다. 진탕 30 ℃에서 밤새 품어. </li><li> YPD 50ml에 600 나노 미터 (600 OD = 0.2)에서 0.2의 광학 밀도로 세포를 희석하고, 진탕하면서 30 ℃에서 배양한다. </li><li> 600 nm의 (OD 600 = 1.0)에서 1.0의 광학 밀도 문화를 성장. </li><li> 원심 분리기 세포 2,000 XG에 5 분 동안 상층 액을 버린다. </li><li> 세포를 세척 2000 XG에서 5 분 동안 40 ml의 멸균 원심에서 세포 펠렛을 재현 탁. 뜨는을 취소하고 -20 ℃에서 세포 펠렛을 저장합니다. </li></ol> 단백질 2. 추출 <ol><li> 또는 니켈의 superflow NTA 비드를 사용 풀다운 분석 용 빙냉 구아니딘 완충액 (표 1) 0.5 ㎖ 중의 재현 탁 세포 면역에 대한 A (표 1) 버퍼. 항상 얼음에 튜브를 유지합니다. </li><li> 2m로 이동L 스크류 캡 튜브. </li><li> 유리 구슬의 동일한 볼륨 (자료 표)를 추가합니다. </li><li> 다음 2 ~ 3 분 동안 얼음에 배치, 실온에서 2 분 동안 미니 비드 비터의 셀 (자료 표)를 구슬은-이겼다. 이 세 번 반복합니다. </li><li> 30 ~ 60 분 동안 4 ℃에서 고속에 소용돌이. 세포가 용해되어 있는지 확인하기 위해 현미경으로 시각화하여 세포를 확인합니다. 참고 : 용균 세포는 어두운 유령을 표시하고 경계 또는 정의 된 모양이 부족합니다. 최적의 셀의 적어도 80 %를 용해한다. </li><li> 15ml의 원뿔형 튜브 (스크류 캡이 느슨 함) 컬렉션에 푸시 핀과 장소를 이용하여 튜브의 바닥에 구멍을 천공. </li><li> 해물를 수집하기 위해 1 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 마이크로 원심 분리기 튜브에 해물을 전송합니다. </li><li> 4 ℃에서 30 분 동안 15,000 XG에 원심 분리기는 추출 된 단백질을 수집합니다. </li><li> ASSA 단백질을 사용하여 추출 된 단백질의 농도를 측정Y 키트 (자재 표)과 모든 추출물을 정상화는 동일한 양의 단백질을 함유한다. 적절한 버퍼 1 ml의에 총 볼륨을 가져 오십시오. 참고 : 총 단백질의 약 5 mg의 50 OD 600 세포로부터 얻어진다. </li><li> 전체 세포 추출물 (WCE)와 같은 (2.10 단계에서 추출 된 총 단백질은 5 mg의 경우 250 μg의 단백질) 50 μl를 저장합니다. 배 램 믈리 시료 완충액 (표 1) 50 μl를 첨가하고 3-5 분 동안 가열 블록에서 100 ° C에서 배양한다. 로드 웨스턴 블롯 분석 (5 절 : 웨스턴 블롯 분석)에 대한 SDS-PAGE 젤의 각 샘플의 10 μL. </li></ol> HF-Smt3 복합체 3. 정제 <ol><li> 실험 1 분간 저속 원심 분리 (800-1,500 XG)에 의해 (샘플 당 구슬 100 ㎕)에 필요한 니켈 NTA의 superflow 비즈 (재료 표)를 얻습니다. 상층 액을 제거합니다. </li><li> 워시 비즈 PBS (자료 표)의 1 ml의 5 배 : 반전 최고의 오버구슬이 재현 탁 될 때까지 바닥, 저속 원심 분리하여 구슬을 수집하고 뜨는을 제거합니다. </li><li> 구아니딘 완충액 (표 1) 1 ㎖에 비드를 일시 및 처리 대상에 대응하는 샘플 튜브의 개수로 나누어지는. 저속 원심 분리하여 구슬을 수집하고 뜨는을 제거합니다. 상단을 통해 반전 바닥에서 잘 구슬을 섞는다. 참고 : 상단 오버 바닥을 반전 잘 구슬을 섞는다. </li><li> 니켈 NTA의 superflow 구슬 100 μL에 각 샘플의 경우, (단백질의 추출 단계 2.11에서) 나머지 WCE의 950 μl를 추가합니다. </li><li> 적어도 4 시간 또는 밤새 4 ℃에서 흔들 플랫폼에 품어. </li><li> 4 ℃에서 1 분 800-1,500 XG에 원심 분리기. </li><li> 상층 액 (삭제) 50 μl를 저장합니다. 배 램 믈리 시료 완충액 50 μl를 첨가하고 3-5 분 동안 가열 블록에서 100 ° C에서 배양한다. 로드 웨스턴 블롯 분석 (제 5 SDS-PAGE 젤의 각 샘플의 10 μL : 웨스턴 블롯 항문이 Analysis). </li><li> 락을 플랫폼에 한 번 5 ~ 10 분 동안 구아니딘 버퍼 1 ml의 씻을 구슬. </li><li> 워시 비즈 락 플랫폼에서 5 ~ 10 분 동안 버퍼 (표 1)을 깨고 1 ml의 5 배. </li><li> 배 램 믈리 샘플 버퍼의 90 μL에 재현 탁 구슬. </li><li> 1 M 이미 다졸의 10 μl를 추가합니다. 참고 : 이미 다졸 인해 이미 다졸과 구슬 사이의 경쟁의 상호 작용에 니켈 NTA 비즈에서 그의 태그가 단백질을 해리하는 데 도움이됩니다. </li><li> 3-5 분간 가열 블록에서 100 ° C에서 인큐베이션. </li><li> 소용돌이, 다음 30 초 동안 13,000 XG에 원심 분리기. 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. </li><li> (: 웨스턴 블롯 분석 제 5 절) 웨스턴 블롯 분석을위한 SDS-PAGE 젤에서 각 샘플의 부하 10 ~ 20 μL. 주 : WCE 5mg을 사용하는 경우는 10 ~ 20 μL, 0.5-1.0 mg의 입력에 대응한다. </li></ol> Myc와 태그가 동원체 단백질 4. 면역 침전 <ol><li> 반 C-Myc와 아가 로스 친 화성 젤을 구하는tibody (자료 표) 저속 원심 분리 (800-1,500 XG)에 의한 실험 (샘플 당 수지 25 μL)에 필요한. 상층 액을 제거합니다. </li><li> 버퍼 1 ml의 씻을 수지 5 배 : 수지가 재현 탁 될 때까지 반전 최고의 오버 바닥, 저속 원심 분리하여 수지를 수집하고, 상층 액을 제거합니다. </li><li> 완충액 1 ㎖에서 수지를 일시 및 처리 대상에 대응하는 샘플 튜브의 개수로 나누어지는. 저속 원심 분리하여 수지를 수집하고, 상층 액을 제거합니다. 참고 : 위 이상 바닥을 반전 아니라 수지를 섞는다. </li><li> 수지의 25 μL에 : (단백질의 추출 단계 2.11에서) 나머지 WCE의 950 μl를 추가합니다. </li><li> 4 ° C에서 하룻밤 흔들 플랫폼에 품어. </li><li> 4 ℃에서 1 분 800-1,500 XG에 원심 분리기. </li><li> 상층 액 (삭제) 50 μl를 저장합니다. 배 램 믈리 시료 완충액 50 μl를 첨가하고 3-5 분 동안 가열 블록에서 100 ° C에서 배양한다. 소호광고 웨스턴 블롯 분석을위한 SDS-PAGE 젤 (5 절 : 웨스턴 블롯 분석)에서 각 샘플의 10 μL. </li><li> 버퍼 1 ml의 씻을 수지 5 배 : 수지가 재현 탁 될 때까지 반전 최고의 오버 바닥, 저속 원심 분리하여 수지를 수집하고, 상층 액을 제거합니다. </li><li> SUMEB 샘플 완충액 (표 1) 100 ㎕에 재현 탁 수지. 참고 : SUMEB 샘플 버퍼가 8 M 우레아 1 % SDS (강한 변성 조건)가 포함되어 있습니다. </li><li> 3-5 분간 가열 블록에서 100 ° C에서 인큐베이션. </li><li> 소용돌이, 다음 30 초 동안 13,000 XG에 원심 분리기. 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. </li><li> (: 웨스턴 블롯 분석 제 5 절) 웨스턴 블롯 분석을위한 SDS-PAGE 젤에서 각 샘플의 부하 10 ~ 20 μL. 주 : WCE 5mg을 사용하는 경우는 10 ~ 20 μL, 0.5-1.0 mg의 입력에 대응한다. </li></ol> 5. 웨스턴 블롯 분석 <ol><li> 4~12% 비스 - 트리스 젤 (자료 표)와 반환 한의 단백질 추출물을로드ORM 전기는 90 분 동안 120 V에서 (버퍼를 실행 : 자료 표). </li><li> 90 분 (: 자재 표 전송 버퍼)에 대해 30 V로 전송 장치를 이용하여 니트로 셀룰로오스 막 (자재 표)로 겔로부터 단백질을 옮긴다. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 5 % 우유 / 1X TBST (표 1)에서 막을 차단. </li><li> 5 % 우유 / 1X TBST 밤새 4 ° C가 차 항체 (자료 표)와 멤브레인을 품어. 1,000 (안티 - 플래그 및 안티 UB 항체) 또는 1 : 5,000 (안티 - Myc와 항체) 일차 항체를 들어, 1의 희석을 사용합니다. </li><li> 1X TBST 10 분마다 막 배를 씻으십시오. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 5 % 우유 / 1X TBST에서 이차 항체 (자재 도표)와 함께 막을 인큐베이션. 이차 항체의 5,000 희석 : 1을 사용합니다. </li><li> 1X TBST 10 분마다 막 배를 씻으십시오. </li><li> ECL 가공용으로 멤브레인을 품어NG 용액 (자료 표) 5 분. </li><li> 블루 민감한 X 선 필름 막 (자료 표)를 노출 및 자동 개발자 (자료 표)를 사용하여 개발할 수 있습니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

이러한 HA, Myc와, 플래그 및 GST와 같은 에피토프 태그 널리 단백질의 생화학 적 분석을 위해 사용된다. HF-Smt3 및 Ndc10 Ndc80과 같은 나 Myc 태그가 동원체 단백질과 균주의 구성은 이러한 sumoylation 유비퀴틴과 같은 PTMS의 검출을 용이하게한다. HF-Smt3 분석를 풀다운는 sumoylated 동원체 단백질, Ndc10 및 Ndc80 (그림 1)의 검출을 할 수 있습니다. 안티 - 플래그 항체를 이용하여 친 화성 정화 프로토콜과 웨스턴 블롯 분석 HF-Smt3 및 표적 단백질 사이의 상호 작용의 특이성을 설정, 수정 된 단백질은 HF-Smt3없이 제어 변형에 검출되지 않았다있다. 단백질 기질에 Myc와 태그의 사용은 HF-Smt3 접합체에 sumoylated Ndc10 및 Ndc80의 존재를 검증한다. 또한, Ndc10과 Ndc80 모두의 sumoylation는 nocodazole 처리 된 세포 (그림 1C 및 1D) 감소했다. nocodazole treatmen에 대한 응답으로 Ndc10의 sumoylation 감소t 아니지만 Ndc80는 이전 Montpetit 등. (9)에 의해보고되었다. 이는 실험 프로토콜과 사용자 정의 앤티 스모 항체의 사용의 차이 일 수있다. 동원체 기판 sumoylation 대​​한 우리의 결과는 유사한 프로토콜이 다른 후보 SUMO 기판을 조사하는데 사용될 수 있다는 것을 시사한다. 유비퀴틴을 검출하도록, 나 Myc 태그가 동원체 단백질은 먼저 면역 침강시키고, IP 분획 항 UB 항체 (도 2)으로 프로빙 하였다. 세포는 프로 테아 좀의 기능 (그림 2B)를 억제하는 MG132로 처리했을 때 Ndc10과 Ndc80의 분절 패턴은이 단백질이 프로 테아 좀의 기질이 있음을 나타냅니다 증가 하였다. IP 분획 방지 플래그 또는 항 Smt3 항체와 함께 웨스턴 블랏에 Ndc10 또는 Ndc80 sumoylation의 검출에 실패 (데이터는 보이지 않음). 이는 IP 분획 또는 interferenc에 sumoylated 기판의 수준으로 기술적 인 이유 때문일 수 있습니다에피토프 태그로부터 E. 이러한 염 및 웨스턴 블롯 조건 농도 IP 프로토콜의 추가의 최적화는 관심있는 단백질의 여러 PTMS의 검출을 용이하게한다. 현재, sumoylation는 최고의 후보 스모 기판의 서쪽 오 점 (그림 1) 다음에 분석을 풀다운 HF-Smt3에 의해 검출된다. 몇몇 사항 단백질 정제 효율 PTMS를 검출하는 능력에 영향을 미친다. 첫째, 모든 튜브가 지정 제외하고 단백질 분해 효소를 억제하는 얼음에 보관해야합니다. 둘째, 1 : 유리 비드로 세포 현탁액 1 비율 비드 비터 및 / 또는 vortexer를하여 세포를 파괴하는 것이 중요하다. 세포 용해는 현미경으로 세포 검사에 의해 모니터링해야한다. 셋째, 풀다운 분석 또는 IP에 대해 명확히 분해물을 제조하는 것이 매우 중요하다. 짧거나 저속 원심 파쇄물에서 세포 파편의 오염에 기여할 수 있고, 이것은 DETE하는 능력에 영향을 미친다PTMS CT. 마지막으로, 1.5 ml의 마이크로 원심 분리기 튜브 분명 해물 (약 1 ml)을 대량으로 구슬의 격렬한 흔들림이 구슬이 완전히 풀다운 분석 또는 IP를 위해 중단되도록합니다. 요약하면, 이러한 여기에 설명 된 것과 같은 단백질 정제 및 탐지 기술은 동원체 단백질의 PTM 충실 염색체 분리 (14), (15)에 대한 자신의 구조 및 조립에 어떻게 영향을 미치는지에 중요한 기계적인 통찰력을 제공합니다.

각각 표적 단백질에 (S. cerevisiae의 1 Smt3 SUMO) 유비퀴틴과 sumoylation는 유비퀴틴과 작은 유비퀴틴 같은 수정의 활용을 할 수 있습니다. 동원체 단백질 PTMS 충실한 염색체 분리를 보장하기 위해 상이한 세포주기 단계에서 자신의 세포 수준 및 단백질 - 단백질 상호 작용에 영향을 미친다. 예를 들어, Cse4 / CENP-A 및 외부 동원체 단백질 Dsn1의 세포 수준 게놈 안정성 2-5을 보장하기위한 유비퀴틴 매개 단백질 분해에 의해 조절된다. 잘못된 동원체 - 미세 소관 첨부 불안정 직접 미세 소관 6-8과 상호 작용 Dam1과 Ndc80 단지를 인산화 Ipl1 / 오로라 B 키나제가 필요합니다. 일흔을 통해 동원체 단백질의 확인에도 불구하고, PTMS, 예를 들어, 유비퀴틴과 SUMO 이러한 단백질의 변형을 조사 거의 연구가있다. 주요한 제한은 PTM을 보존하는 능력이다정화 및 sumoylation, 인산화, 메틸화, 등과 같은 PTMS의 검출을위한 사용자 정의 항체의 소수 중의. sumoylated 동원체 단백질의 특성은 Ndc10, Cep3는 Bir1 및 Ndc80 사용자 정의 항체 (9)를 이용했다. 또한 Ndc10 유비퀴틴은 10 기재로서 연루되어왔다. 인간 Hec1 (S. cerevisiae의에서 Ndc80)도 APC / C-hCdh1 E3 리가 아제 (11)에 의해 규제, 유비퀴틴 화를 위해 기판이다. 따라서, Ndc10 및 Ndc80는 S.에서 sumoylation 및 유비퀴틴을 모두 감지 할 수있는 프로토콜의 최적화를위한 좋은 후보입니다 cerevisiae의. sumoylation의 식별을 용이하게하기 위해, 우리는 HF-Smt3 및 Myc와 태그가 Ndc10 또는 Ndc80을 표현 균주를 건설했다. 에피토프 태그 (HF :을 His6-FLAG)의 사용으로 인해 자주 후보 단백질에 대해 발생하는 폴리 클로 날 혈청에서 관찰되고 교차 반응의 배경을 최소화한다. 우리는 선호도와 프로토콜을 고안HF-Smt3 접합체를 정제 한 다음 정제 Smt3 제제 sumolyated Ndc10 및 Ndc80의 존재를 검출하기 위해 상업적 방지 플래그 및 안티 나 Myc 항체를 사용 하였다. 유비퀴틴을 위해, 우리는 Myc와 태그가 동원체 단백질의 유비퀴틴 화를 보존하는 변형 된 면역 프로토콜을 고안 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지하는 상업 항 UB 항체로 웨스턴 블롯 분석을 수행 하였다.

<table><tbody><tr><td>Glass beads</td><td>BioSpec Products</td><td>11079105</td><td>0.5 mm diameter</td></tr><tr><td>Mini beadbeater</td><td>BioSpec Products</td><td>#693</td><td>8 cell disrupter</td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8215</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7470</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>Primary antibody, dilution 1:1,000</td></tr><tr><td>c-Myc antibody (A-14)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-789</td><td>Primary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>Purified mouse antibody monoclonal 9E10</td><td>Covance</td><td>MMS-150P</td><td>Primary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody</td><td>Covance</td><td>MMS-258R</td><td>Primary antibody, dilution 1:1,000</td></tr><tr><td>ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA934V</td><td>Secondary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA931V</td><td>Secondary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>DC protein assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane</td><td>Novex</td><td>LC2001</td><td>0.45 mm pore size</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>Novex</td><td>NP0321BOX</td><td>1.0 mm, 10 well</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer</td><td>Novex</td><td>NP0002</td><td>20x</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer</td><td>Novex</td><td>NP0006-1</td><td>20x</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>34078</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS pH7.4</td><td>GIBCO</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Blue sensitive X-Ray film</td><td>Dbio</td><td>DBOF30003</td><td></td></tr><tr><td>Automatic developer</td><td>Kodak</td><td>M35AX-OMAT</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td>50 mg</td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2619</td><td>25 mg</td></tr></tbody></table>

protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins ndc10 and ndc80

이러한 인산화, 메틸화, 아세틸 화, 유비퀴틴 및 sumoylation 같은 번역 후 변형 (PTMS)는, 많은 단백질의 세포 기능을 조절한다. 센트로 DNA와 연관 동원체 단백질의 PTMS는 유전체의 안정성을 유지하기 위해 충실한 염색체 분리를 중재. 같은 질량 분석 및 웨스턴 블롯 분석과 같은 생화학 적 접근 방법이 가장 일반적으로 PTMS의 식별을 위해 사용된다. 여기서, 단백질의 정제 방법은, 사카로 마이 세스 세레 비지에 동원체 단백질 Ndc10 및 Ndc80의 sumoylation 및 유비퀴틴 양쪽의 검출을 허용하는 기술된다. Ndc10 Myc와 - 태그 또는 Ndc80가 건설하고 우리의 연구에 사용 된 표현 폴리 히스티딘 플래그 태그가 Smt3 (HF-Smt3) 및 변형. sumoylation의 검출을 위해, 우리는 니켈 비드를 사용하여 자신 태깅 sumoylated 단백질을 정제 친화력 프로토콜을 고안 sumoylated Ndc10 A를 검출하기 위해 항 - 나 Myc 항체로 웨스턴 블롯 분석을 이용ND Ndc80. 유비퀴틴의 검출을 위해, 우리는 Myc와 태그가 단백질의 면역을위한 프로토콜을 고안 Ndc10과 Ndc80이가 도처 것을 보여 방지 UB 항체와 웨스턴 블롯 분석을 사용했다. 우리의 결과는 그의 플래그에 대한 관심의 에피토프 태그 단백질이 Smt3 변형 여러 PTMS의 검출을 용이하게 태그를 보여줍니다. 앞으로의 연구는이 기술의 개발은 특정 PTM에 의존 단백질 상호 작용을 식별하고 특성화 할 수 있도록해야한다.

이전에 설명 된대로 9,12- 동원체 단백질과 Ndc80 Ndc10의 sumoylation을 검출하도록, HF-Myc와 Smt3 및 태깅 동원체 단백질 (또는 Ndc80 Ndc10)와 균주 (표 2)를 구성 하였다. HF-Smt3 접합체 친화력의 Ni-NTA 비드를 사용하여 정제 하였다. HF-Smt3 (그림 1A와 1B, 왼쪽 패널)없이 제어 변형에 결석했다 스모 기판의 sumoylated 형태의 안티 - 플래그 항체 허용 감지와 정제 HF-Smt3의 웨스턴 블롯 분석. 예상대로, 스모 기판의 여러 형태는 HF-Smt3 변형 검출되었다. Ndc80과 Ndc10이 방지 Myc와 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 정제 HF-Smt3 복합체에 존재하는 경우에 우리는 다음 결정. Ndc80 Ndc10 또는보다 높은 분자량이었다 다중 대역 명확 (도 1A 및 1B, 우측 판넬)을 검출 하였다. 또한, Ndc80과 Ndc10 모두의 다중 대역nocodazole 처리 된 세포 (도 1C 및 1D)가 감소 하였다. 이러한 결과는 이전에 9 바와 같이 단백질 정제 및 웨스턴 블롯 분석, 여기에 설명 Ndc80과 Ndc10의 sumoylation의 검출을 할 수 있음을 보여줍니다. Ndc80과 Ndc10의 유비퀴틴 검색하려면 Ndc80 또는 Ndc10가 (IP)을 면역했다 Myc와를-태그 및 웨스턴 블롯 분석을 방지 Myc와 안티 UB 항체 (그림 2)를 수행 하였다. 전체 세포 추출물 (WCE) 상층 액 (SUP) 분석 및 Ndc80-Myc와 Ndc10-Myc와 (도 2a)의 발현을 확인 하였다. WCE에 저 분자량 밴드는 분해 산물을 나타낼 수있다. 항 Myc와 함께 프로브 IP 샘플 Ndc80 및 Ndc10 PTMS가 포함될 것을 시사 여러 고 분자량 밴드를 보여 주었다. 안티 UB 항체로 프로빙 IP 샘플 분절 패턴과 Ndc80 Ndc10가 도처이되는 것으로 나타났다 (도 2A, α-UB). Ndc80 및 Ndc10의 분절 패턴은 더이 밴드는 폴리 ubiqutination을 나타내는 것을 확인, 프로 테아 좀 억제제 (MG132) (그림 2B, α-UB)와 치료에 의해 ​​강화되었다. 대표 결과 Ndc80과 Ndc10 모두 S.에서 sumoylation 및 유비퀴틴 용 기판이라는 것을 공개 cerevisiae의 및 설명 단백질 정제 방법은 sumoylation과 유비퀴틴 같은 PTMS의 검출에 유용 것을. 우리의 지식에 따르면,이 미의 Ndc80 그 첫 번째 보고서입니다 인간 상동 Hec1의 유비퀴틴 매개 단백질 분해 이전에 11을 발표했지만 cerevisiae의는 유비퀴틴 화를위한 기판이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52482/52482fig1.jpg" /> 그림 1 : sumolyated 기판의 정제 스모 기판 등의 동원체 단백질 Ndc80과 Ndc10의 식별을 할 수 있습니다 잠을.oteins는 추출 및 HF-Smt3 복합체는 SDS-PAGE 분리 후 준비 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석 하였다. (A와 B) Ndc80 및 Ndc10는 sumoylated된다. 단백질은 YPD에서 대수적으로 성장 세포로부터 추출 하였다. 왼쪽 패널 : 총 스모 기판을 방지 플래그 항체 검출되었다. 오른쪽 패널 : 안티 - Myc와 항체 탐색 할 때 Sumoylated Ndc80 또는 Ndc10은 HF-Smt3 접합체에서 검출되었다. Ndc80과 Ndc10의 (C와 D) Sumoylation는 nocodazole 처리 한 세포에서 감소한다. (-) 대수 YPD에서 성장하는 세포가 DMSO로 처리 또는 DMSO + / ㎖ nocodazole (+) 30 ℃에서 2 시간 동안 20 μg의. HF-Smt3 접합체 방지 나 Myc 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석 하였다. 사용 동종 효모 균주 (A와 C) YPH1800 (Ndc80-Myc와), YMB7862 (그의-FLAG-SMT3 Ndc80-Myc와)와 (B와 D) YPH1734 (Ndc10-Myc와), YMB7867 (그의-플로리다 있습니다AG-SMT3 Ndc10-Myc와). <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52482/52482fig2.jpg" /> 그림 2 :. 프로토콜에 설명 된대로 동원체 단백질 Ndc80 및 단백질과 면역의 Ndc10 추출의 유비퀴틴을 실시 하였다. () Ndc80 및 Ndc10이가 도처에있다. 단백질은 YPD에서 대수적으로 성장 세포로부터 추출 하였다. 전체 세포 추출물 (WCE), 상청 (SUP)과 면역 침전 (IP) 분획을 SDS-PAGE를 실시 하였다. 웨스턴 블롯을 각각 항 및 항 Myc와 항체와 UB-Myc와 태그가 도처 및 단백질을 검출하기 위해 사용 하였다. Ndc80과 Ndc10의 (B) 유비퀴틴이 프로 테아 좀 억제제 MG132로 처리 한 세포에서 강화된다. (-) YPD에서 대수적으로 성장하는 세포는 DMSO로 처리 또는 DMSO (13)는 이전에 설명을 30 ° C에서 3 시간 동안 0.003 % SDS의 존재 하에서 50 μM + MG132 (+)로 </sup&gt;. IP 분획의 웨스턴 블롯을 항 또는 항 Myc와 UB 항체를 사용하여 수행 하였다. 사용 동종 효모 균주 YMB7278 (그의-FLAG-SMT3), YMB7862 (그의-FLAG-SMT3 Ndc80-Myc와)과 YMB7867 (그의-FLAG-SMT3 Ndc10-Myc와)입니다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 해결책 </td><td> 구성 요소들 </td></tr><tr><td> YPD </td><td> 1 % 효모 추출물, 2 % 박토 - 펩톤, 2 % 글루코스 </td></tr><tr><td> 구아니딘 버퍼 </td><td> 0.1 M 트리스 -HCl pH가 8.0, 6 M 구아니딘 클로라이드, 0.5 M의 NaCl </td></tr><tr><td> 버퍼 </td><td> 50mM 트리스 - 염산 pH를 7.5의 50 mM의 NaCl, 0.2 % 트리톤 X-100, 1X 프로테아제 억제제 </td></tr><tr><td> 속보 버퍼 </td><td> pH가 8.0, 0.1 M 트리스 -HCl, 20 % 글리세롤, 1mM의 PMSF </td></tr><tr><td> SUMEB 샘플 버퍼 </td><td> 1 % SDS, 8 M 우레아, 10 mM의 MOPS의 pH 6.8, 10 mM의 EDTA, 0.01 % 브로 모 페놀 블루 </td></tr><tr><td> 배 램 믈리 샘플 버퍼 </td><td> 100 mM의 트리스 -HClpH가 6.8, 4 % SDS, 20 % 글리세롤, 0.2 % 브로 모 페놀 블루 (사용 전 : 200 mM의 최종 농도 (B) 머 캅토 에탄올 (BME)을 추가) </td></tr><tr><td> 1X TBST </td><td> 137 mM의 염화나트륨, 20 mM 트리스 - 염산 pH를 7.5, 0.1 % 트윈 -20 </td></tr></tbody></table> 표 1 : 솔루션. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 이 연구 *에 사용되는 표 2. 효모 균주. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 균주 </td><td> 부모 </td><td> 유전자형 </td><td> 참고 </td></tr><tr><td> BY4741 </td><td></td><td> 마타 his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 </td><td> 열기 생물계 </td></tr><tr><td> BY4742 </td><td></td><td> 마타 his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 </td><td> 열기 생물계 </td></tr><tr><td> YMB7278 </td><td> BY4741 / BY4742 </td><td> 마타 his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 URa3Δ0 HF-SMT3 ::는 Leu2 </td><td> 이 연구 </td></tr><tr><td> YPH1734 </td><td></td><td> 마타 ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC10-13Myc :: kanMX6 </td><td> Montpetit 등., 2006 </td></tr><tr><td> YPH1800 </td><td></td><td> 마타 ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC80-13Myc :: His3MX6 </td><td> Montpetit 등., 2006 </td></tr><tr><td> YMB7862 </td><td> YMB7278 / YPH1800 </td><td> 마타 HIS3는 Leu2 URA3 ade2 TRP1 HF-SMT3 ::는 Leu2 NDC80-Myc와 :: His3MX6 </td><td> 이 연구 </td></tr><tr><td> YMB7867 </td><td> YMB7278 / YPH1734 </td><td> 마타 HIS3는 Leu2 URA3 TRP1 lys2 HF-SMT3 ::는 Leu2 NDC10-Myc와 :: kanMX6 </td><td> 이 연구 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> * 모든 효모 균주는 사카로 마이 세스 세레 비지에 S288C에서 파​​생됩니다. </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 표 2 : 본 연구에 사용 된 효모 균주.

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Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

이 원고는 신진 효모 사카로 마이 세스 세레 비지에, sumoylation 및 동원체 단백질, Ndc10 및 Ndc80의 유비퀴틴의 검출에 대해 설명합니다.

Sumoylation과 신진 효모 동원체 단백질 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지 할 수 있습니다 단백질 정제 기술

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K 조회수.  National Cancer Institute, National Institute of Health.  이 원고는 신진 효모 사카로 마이 세스 세레 비지에, sumoylation 및 동원체 단백질, Ndc10 및 Ndc80의 유비퀴틴의 검출에 대해 설명합니다. 

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Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

연구

생화학

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. This method utilizes a recombinant modified SUMO-trapping protein fragment, kmUTAG, derived from the Ulp1 SUMO protease of the stress-tolerant budding yeast Kluyveromyces marxianus. We have adapted the properties of the kmUTAG for the purpose of studying sumoylation in a variety of model systems without the use of antibodies. For the study of SUMO, KmUTAG has several advantages when compared to antibody-based approaches. This stress-tolerant SUMO-trapping reagent is produced recombinantly, it recognizes native SUMO isoforms from many species, and unlike commercially available antibodies it shows reduced affinity for free, unconjugated SUMO. Representative results shown here include the localization of SUMO conjugates in mammalian tissue culture cells and nematode oocytes.

SUMO is an essential and highly conserved, small ubiquitin-like modifier protein. In this protocol we are describing the use of a stress-tolerant recombinant SUMO-trapping protein (kmUTAG) to visualize native, untagged SUMO conjugates and their localization in a variety of cell types.

스모를 이용한 스모 변성 단백질의 국 소화-단백질 포착

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

단백질 Ubiquitination의 감지

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

생물학

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, including cell survival, proliferation, and differentiation. It is a reversible process that consists of a covalent attachment of ubiquitin to the substrate through a cascade reaction of at least three different enzymes, composed of E1 (Ubiquitin-activation enzyme), E2 (Ubiquitin-conjugating enzyme), and E3 (Ubiquitin-ligase enzyme). The E3 complex plays an important role in substrate recognition and ubiquitylation. Here, a protocol is described to evaluate substrate ubiquitylation in mammalian cells using transient co-transfection of a plasmid encoding the selected substrate, an E3 ubiquitin ligase, and a tagged ubiquitin. Before lysis, the transfected cells are treated with the proteasome inhibitor MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) to avoid substrate proteasomal degradation. Furthermore, the cell extract is submitted to small-scale immunoprecipitation (IP) to purify the polyubiquitylated substrate for subsequent detection by western blotting (WB) using specific antibodies for ubiquitin tag. Hence, a consistent and uncomplicated protocol for ubiquitylation assay in mammalian cells is described to assist scientists in addressing ubiquitylation of specific substrates and E3 ubiquitin ligases.

We provide a detailed protocol for a ubiquitylation assay of a specific substrate and an E3 ubiquitin-ligase in mammalian cells. HEK293T cell lines were used for protein overexpression, the polyubiquitylated substrate was purified from cell lysates by immunoprecipitation, and resolved in SDS-PAGE. Immunoblotting was used to visualize this post-translational modification.

포유동물 세포 용해물에서 E3 유비퀴틴-리가아제에 의한 기질 유비퀴틸화의 평가

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate protein. The ubiquitination process occurs intracellularly in eukaryotes and regulates almost all basic cellular biological processes. Purification of ubiquitinated proteins aids the investigation of the role of ubiquitination in controlling the function of substrate proteins. Here, a step-by-step procedure to purify ubiquitinated proteins in mammalian cells is described with the p53 tumor suppressor protein as an example. Ubiquitinated p53 proteins were purified under stringent nondenaturing and denaturing conditions. Total cellular Flag-tagged p53 protein was purified with anti-Flag antibody-conjugated agarose under nondenaturing conditions. Alternatively, total cellular His-tagged ubiquitinated protein was purified using nickel-charged resin under denaturing conditions. Ubiquitinated p53 proteins in the eluates were successfully detected with specific antibodies. Using this procedure, the ubiquitinated forms of a given protein can be efficiently purified from mammalian cells, facilitating studies on the roles of ubiquitination in regulating protein function.

The protocol describes a step-by-step method to purify ubiquitinated proteins from mammalian cells using the p53 tumor suppressor protein as an example. Ubiquitinated p53 proteins were purified from cells under stringent nondenaturing and denaturing conditions.

포유류 세포에서 유비퀴틴화된 p53 단백질의 정제

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Ubiquitylated, SUMOylated 및 ADP-Ribosylated DNA-Protein Crosslinks 측정

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

저자 스포트라이트: DNA 단백질 교차결합의 정량적 검출 및 번역 후 변형(Post-Translational Modifications)  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

함수의 연구, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정을위한 신진 효모 단백질 추출 및 정제

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Sumoylation과 신진 효모 동원체 단백질 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지 할 수 있습니다 단백질 정제 기술

요약

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단백질 Ubiquitination의 감지

포유동물 세포 용해물에서 E3 유비퀴틴-리가아제에 의한 기질 유비퀴틸화의 평가

포유류 세포에서 유비퀴틴화된 p53 단백질의 정제

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

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함수의 연구, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정을위한 신진 효모 단백질 추출 및 정제