Este trabalho foi apoiado pela Coligação Cancer Georgia conceder-R9028.

Fundamentação Explorando o uso da Thermo Scientific Dharmacon oligos, 50 a 80-mers, aqui apresentamos um procedimento, baseado em um ensaio de gene de correção, pelo qual oligos podem transferir informações genéticas de DNA genômico de células de levedura, seguindo annealing para o DNA-alvo cromossômicas. Bem sucedida segmentação por oligos é marcado pelo aparecimento de colônias de leveduras exibir o fenótipo esperado. Se a modificação genética desejada é realizada dentro de um ou mais ribonucleotídeos incorporadas na seqüência oligo, a informação genética flui diretamente do trato RNA para o DNA-alvo cromossômicas, assim, uma forma de RNA / DNA híbrido em nível cromossômico durante o processo de segmentação. O ribonucleotídeo / s de um Thermo Scientific Dharmacon RNA contendo oligo pode servir como modelo para gene targeting via síntese de reparação do DNA, ou podem ser incorporados ao DNA e servir como modelo durante a replicação do DNA. Nestes experimentos utilizamos o fermento / Saccharomyces cerevisiae / eucariótica sistema modelo, no entanto, uma abordagem semelhante também pode ser aplicado em outros organismos ou tipos de células. Neste vídeo, nós usamos um Thermo Scientific Dharmacon oligo projetado com homologia a um gene-alvo genômico de levedura e contendo um ribonucleotídeo no meio para corrigir uma mutação no gene alvo. Depois de transformação com o oligo-RNA contendo, observa-se a correção do site orientado para uma determinada freqüência, o que indica que o trato RNA do oligo poderia ser incorporada no DNA cromossômico e servir como modelo para a síntese de DNA durante a replicação do DNA. A informação genética realizada no trato RNA é estável transmitida às gerações seguintes celular. Aqui, descrevemos as etapas de transformação de células de levedura pela Thermo Scientific Dharmacon RNA contendo oligo ea abordagem para detectar as informações RNA transferência no DNA cromossômico. A. Estrutura da RNA Oligo contendo utilizadas neste experimento Nós projetamos um oligo-RNA contendo para corrigir um defeito genético na levedura S. DNA cromossômico cerevisiae no locus trp5. A cepa de levedura utilizada no protocolo contém um gene mutante trp5 com uma deleção de dois de base e uma mutação nonsense (Figura 1A). Cepa de levedura como é um mutante auxotróficas triptofano e não formam colônias na mídia sem triptofano. A seqüência de DNA do gene TRP5 está disponível no Banco de Dados do Genoma cerevisiae (http://www.yeastgenome.org/). A Thermo Scientific Dharmacon oligo-RNA contendo utilizado neste protocolo é um 65-mer com uma inserção de DNA 2-base, concebidos para corrigir a mutação exclusão e um ribonucleotídeo concebidos para corrigir a mutação nonsense do alelo trp5 (Figura 1A). A seqüência dos oligo é concebido como segue: 5&#39;-AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG-CG-GATCCCACATTCTG-rG GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT. Este oligo é sintetizada pela Thermo Scientific Dharmacon (Lafayette, CO), 200 nM escala, e é dessalinizada, deprotected e usados ​​sem purificação PAGE. B. Preparação do RNA Oligo contendo fermento para a Transformação (modificado de Storici et al., 2007 1) <ol><li> Limpe os materiais que serão utilizados para o experimento, incluindo tubos de oligo, pipetas, vortex, racks, área experimental e as luvas usadas pelo investigador com RNase solução de descontaminação para remover a contaminação RNase potencial antes do início de tudo. Use RNase água, reagentes químicos, tubos e ponteiras em todas as etapas. Cada passo neste experimento deve ser RNase-free. </li><li> Ressuspender o Thermo Scientific Dharmacon RNA contendo oligo recebeu da empresa a 250 pmoles / mL solução estoque com RNase água e vortex vigorosamente para dissolver o sedimento. Armazenar a -80 ° C. </li><li> Imediatamente antes da transformação, descongelar o oligo-RNA contendo no gelo e diluir para 50 pmoles / mL com RNase água livre de RNase em tubos. Cada transformação exige uma nmole dos oligos RNA contendo. </li><li> Desnaturar uma quantidade escolhida do oligos RNA contendo no bloco de aquecimento 100 ° C por 2 min para eliminar as estruturas secundárias do oligos. </li><li> Imediatamente após a desnaturação colocar o tubo no gelo. Manter em gelo até a transformação. </li><li> Como controle no experimento um DNA somente correspondente oligo é usado. Este oligo é descongelado de -20 ° C e preparados para a transformação como a oligo-RNA que contenham, como descrito acima. </li></ol> C. Transformação de células de levedura usando o RNA Oligo contendo <ol><li> Inocular 5 ml de meio líquido rico YPD com o trp5 células de levedura mutante e crescer a 30 ° C durante a noite (veja Materiais). </li><li> Transferência de 1,5 ml da cultura durante a noite em 50 ml de meio líquido YPD. </li><li> Incubar as células em um shaker 30 ° C (225 rpm) por 4h. </li><li> Preparar a solução de umSolução 2 e imediatamente antes da transformação em RNase tubos (veja Materiais). </li><li> Transferir a cultura de células em um tubo de 50 ml RNase-free e girar a 3000 rpm, correspondente a 1.562 g, durante 2 min. O pellet de células a precipitação é de aprox. 0,3 cm 3. </li><li> Remover as células sobrenadante e lavar com 50 ml de RNase água e giram a 3000 rpm por 2 min. </li><li> Repita o passo 6 para 5 vezes para se livrar do meio de cultura e RNases que podem estar presentes no meio, tanto quanto possível. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 5 ml de solução 1 e girar a 3000 rpm por 2 min. </li><li> Remover as células sobrenadante e ressuspender em 250 ml de solução 1. Esta quantidade de células é suficiente para 7-8 transformações. </li><li> Alíquota de 50 mL da suspensão de células em tubos de microcentrífuga RNase-free, adicionar 20 mL de RNA contendo oligo solução de trabalho (1 nmole), ou 20 l de DNA somente oligo solução de trabalho (1 nmole), ou 20 l de água estéril sem oligo para o controle negativo. Em seguida, adicione 300 ml de solução 2 para cada reação de transformação. Não há necessidade de acrescentar DNA de esperma de salmão no processo de transformação, como o ato oligos como portador si. </li><li> Vortex vigorosamente para misturar os componentes de forma homogênea. </li><li> Incubar reações de transformação a 30 ° C por 30 min em um agitador. </li><li> Choque térmico a 42 ° C por 15 min. </li><li> Spin down células a 5000 rpm, correspondente a 2.236 g, durante 4 min. </li><li> Remover as células sobrenadante e ressuspender em 100 ul de água estéril. </li><li> Tomar uma alíquota desta suspensão de células e dilui-lo com água estéril por 100.000 vezes e as células da placa em uma placa YPD usando aprox. 15 contas de vidro estéril e incubar a 30 ° C por 2 dias. </li><li> Placa de todas as células ressuspendidas de cada reação de transformação em uma placa de Petri de meio completo sintética sólida sem triptofano (Trp-SC), usando aprox. 15 contas de vidro estéril e incubar a 30 ° C por 4-5 dias (Figura 2). </li></ol> D. Análise de Correção Gene pela RNA Oligo contendo <ol><li> Contar o número de colônias crescidas no meio seletivo (Figura 2), bem como em meio YPD para calcular a freqüência de correção gene para o RNA-oligo contendo, o DNA oligo-only e para o controle não-oligo. Compare o número obtido. Taxa de reversão espontânea do trp5 alelos com as exclusões dois-base ea mutação nonsense é inferior a 09/10 na cepa de levedura utilizada, portanto, esperamos que nenhuma formação colónias no meio seletivo quando não oligos são adicionadas às células. </li><li> Expelido vários escolhido aleatoriamente colônias transformantes em meio YPD obter isolados única colônia. Esperar dois dias para o crescimento da colônia, em seguida, tomar várias (pelo menos 5) colônias única e fazer correções em YPD e em meio seletivo. </li><li> Projetar um par de primers para amplificar a região (250-1,000 pb) alvo do oligo-RNA, contendo, em colônia PCR (Figura 1B). O procedimento para a colônia PCR é a seguinte (modificado de Storici e Resnick, 2006 2). <ol><li> Ressuspender as células (aproximadamente 1 mm3) retirado os patches individuais em 50 ul de água e adicionar uma unidade de lyticase. Incubar a temperatura ambiente por 10 min seguido de incubação em um bloco de aquecimento a 100 ° C por 5 min para quebrar as células e DNA genômico de liberação em solução., </li><li> Condições de PCR: A reação de PCR inclui 10 ml da solução de ressuspensão de células, 50 pmoles cada um dos primers frente e verso, 1 ml de 10 mM dNTPs, 1 unidade de Taq polimerase, 5 mL de tampão 10x e é ajustado com água estéril a um volume final de 50 l. O programa de PCR é de 3 min a 95 ° C, 30 ciclos de 30 s em 95 ° C, 30 s, a 55 ° C e 1 min a 72 ° C; um tempo de extensão final de 7 min a 72 ° C, em seguida, amostras são mantidos a 4 ° C. Uma extensão de tempo de 1 min / kb é assumida por esta reação. </li><li> Após PCR, as amostras são executados em um gel de agarose 1% ou 2% (dependendo do tamanho esperado do produto da PCR) para a observação do produto da PCR (Figura 3). </li></ol></li><li> Se a informação genética transferidos pelo oligo-RNA contendo um sítio de restrição gera novos na região-alvo do genoma de leveduras (Figura 1B), é possível verificar a correta transferência de informação através da digestão do produto da PCR com a enzima de restrição apropriada. Se nenhum sítio de restrição é gerada pelo oligo-RNA contendo, vá para a etapa 6. Produtos Digest PCR usando uma enzima de restrição específica. A reação de digestão inclui 6 mL de PCR produto, buffer, BSA (pode não ser necessário para algumas enzimas, ver instruções para a enzima usada), 0,5 l da enzima de restrição, e água estéril a 15 mL. As amostras são incubadas por 1 h na temperatura específica para a enzima utilizada. </li><li> Executar uma amostra não digerida juntamente com as amostras digeridas na mesma linha de um gel de agarose 2% aobservar a modificação genética transferidos pelo trato RNA do oligo-RNA que contém (Figura 3). </li><li> Purificar produtos de PCR usando um kit de purificação de PCR e prepará-los para o seqüenciamento de DNA. Enviar amostras para seqüenciamento com a mesma primers utilizados para amplificar o produto. </li><li> Analisar os resultados de seqüenciamento de DNA usando um software que permite o alinhamento de várias seqüências com uma seqüência de referência escolhido (Figura 4). </li></ol> E. Tratamento Alkali do oligo-RNA contendo (Figura 5) <ol><li> Para cada reação, adicionar 1 nmole (4 mL de 250 pmoles / solução estoque mL) do oligo-RNA que contenham ou DNA-oligo em um tubo de 1,5 ml. </li><li> Adicionar 4 mL de NaOH 1 M de hidrólise, ou, alternativamente, adicionar 4 mL H 2 O como controle negativo, e incubar a 65 ° C em banho-maria por 1 h. Então mover-se do banho de água em gelo. </li><li> Neutralize com 2 mL de 1,2 M HCl, 4 mL de 1 ml M Tris-HCl, e 4 de H 2 O, ou, alternativamente, 6 mL de H 2 O e 4 mL de 1 M Tris-HCl para o controle negativo. Manter em gelo até a transformação. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Diagrama esquemático do gene defeituoso e trp5 do alelo TRP5 corrigido pelo oligo-RNA que contém. A) O gene mutante trp5 contém uma deleção 2-base (triângulos pretos) e 1-base mutação nonsense (asterisco). A única fita de RNA contendo oligo com 2 base de inserção (azul loop) e 1-RNA substituição de base (retângulo vermelho) gerando um Van91 Eu site da enzima de restrição (indicado por um suporte) é transformado em células de levedura para corrigir os defeitos genéticos do gene trp5. B) Após o gene TRP5 é reparado pela oligo-RNA contendo (bases corrigidas são indicados como retângulos azuis), o Van91 site que é gerado no gene TRP5. Um fragmento de 278 pb, incluindo apenas um sítio de restrição Van91 I em TRP5 gene é amplificado PCR por um par de primers (P1 e P2). O bp 177 e bp 101 fragmentos gerados após a digestão da P1 e P2 produto PCR por Van91 eu também são mostrados. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Resultado de transformação com o oligo-RNA que contém. A) As células de levedura transformada sem oligo não fazem qualquer colônia no meio SC-Trp, ver placas ab. B) Placas cg colônias de leveduras mostram que crescem em SC-Trp depois que as células são transformadas com um nmole do oligo-RNA que contém. C) Placas hl colônias de leveduras mostram que crescem em SC-Trp depois que as células são transformadas com um nmole do DNA somente correspondente oligo controle. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Detecção de transferência de informação genética do RNA contendo oligo de DNA cromossômico de leveduras por digestão de restrição do produto da PCR de amplificação da região genômica alvo. Eletroforese em gel de agarose 2% das amostras de PCR amplificados por P1 e P2 e digerido com enzima de restrição Van91 I. Raias 1, 8 e 15, escada de DNA com tamanhos de 100, 200, 300, 400 e 500 bp indicado à esquerda; pista 2, produto de PCR amplificado a partir de trp5 lócus do DNA genômico da cepa mutante trp5; pista 3, PCR produto amplificado do DNA genômico derivado de uma colônia + Trp alvo do DNA oligo-only; lane 4-7, produtos de PCR amplificados a partir de DNA genômico derivado de Trp + colônias alvo do oligo-RNA contendo; lane 9-14, Van91 eu digestão de restrição dos produtos de PCR de faixas 2-7. A presença do uncut bandas produto de PCR em pistas 10-14 pode ser explicado pela digestão parcial por Van91 eu no locus TRP5 (CCACATTCTGG). Considerando que o local de corte para Van91 I (CCANNNN NTGG) pode ter várias seqüências, o site gerada em TRP5 pode não ser o alvo mais ideal para a enzima. De fato, o DNA seguinte seqüência de todos os produtos acima PCR não detectamos nenhuma alteração adicional além daquelas realizadas pela oligos (ver Figura 4). O 278 bp banda PCR amplificado por P1 e P2 primers e as bandas produto da digestão por Van91 I de 177 bp e 101 bp são mostrados pelas setas à direita. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/2152/2152fig4.jpg"><img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig4tmb.jpg" border="0" alt="Figura 4Thumb" /></a> Figura 4. Resultados de seqüenciamento de DNA mostrando correção gene pela RNA-oligo contendo. Electrofograma A DNA) da região genômica alvo do oligo-RNA que contém. O G na seqüência do DNA (azul caixa) deriva do rG na oligo-RNA que contém. Também em caixa é a inserção das bases CG. Resultados de sequenciamento de todos os outros produtos da PCR são também como clear como este, com sinais fluorescentes bem acima do fundo. B) Seqüências da região TRP5 do + Trp transformantes alvo do oligo DNA-only (T1) e os oligo RNA contendo (T2-T5) correspondem na seqüência consenso no topo e são comparados com o do trp5 células mutantes antes de segmentação pela oligos (DNA genômico, vermelho sombreado). A reparação RNA contendo oligo no fundo tem dois-base de inserção de DNA e uma base (G) RNA substituição marcados em vermelho. As regiões em caixa no azul com sombra amarela mostram que o RNA que contêm oligo, bem como os oligo DNA somente precisamente corrigido a mutação deleção e mutação nonsense em todas as amostras testadas. As linhas tracejadas marcar a posição da seqüência de RNA contendo oligo. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Tratamento alcalino impede a correção gene pela RNA-oligo contendo. A freqüência de transformação pelo oligo-RNA contendo (R) é mostrado na barra vermelha e que pelo DNA oligo-only (D) é mostrado nas barras azuis. As barras de erro representam o erro padrão da média para três transformações independentes para cada oligo. O DNA somente oligo exibe freqüência transformação semelhante sem e com tratamento NaOH. Diferentemente, a freqüência de transformação pela oligo-RNA contendo cai para 0 após o tratamento com NaOH. Portanto, a preparação, com o oligo-RNA contendo não está contaminado com DNA somente oligo, assim, a freqüência de transformação observada é específica para o oligo-RNA que contém.

<ol>
	<li>Storici, F., Bebenek, K., Kunkel, T. A., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-templated+DNA+repair.">RNA-templated DNA repair.</a> Nature. 447, 338-3341 (2007).</li><li>Storici, F., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delitto+perfetto+approach+to+in+vivo+site-directed+mutagenesis+and+chromosome+rearrangements+with+synthetic+oligonucleotides+in+yeast.">The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast.</a> Methods Enzymol. 409, 329-345 (2006).</li><li>Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-mediated+DNA+modifications+and+RNA-templated+DNA+repair.">RNA-mediated DNA modifications and RNA-templated DNA repair.</a> Curr Opin Mol Ther. 10, 224-230 (2008).</li><li>Cerritelli, S. M., Crouch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonuclease+H:+the+enzymes+in+eukaryotes.">Ribonuclease H: the enzymes in eukaryotes.</a> FEBS J. 276, 1494-1505 (2009).</li></ol>

A produção de vídeo para este artigo foi patrocinado pela Thermo Fisher Scientific, que produz reagentes e instrumentos utilizados nesta publicação.

O fato de que RNA pode transferir informações genéticas diretamente ao DNA genômico em células foi descoberto explorando o uso de RNA sintético contendo oligos (oligos Dharmacon sintetizado) 1. Foi a prova do princípio de que as células podem usar RNA contendo moléculas de RNA ou somente seqüências como modelos para a síntese de DNA. O uso de RNA contendo oligos não só levou à demonstração de que a informação genética pode ser transferida diretamente de RNA para DNA genômico sem a necessidade de um reverso transcrito DNA cópia intermediária, mas também para a prova de que RNA pode ser usado como modelo no homólogo a reparação de um dano ao DNA 1,3. Os oligos podem ser feitas de RNA-only ou conter apenas uma única ribonucleotídeo incorporado em uma seqüência de DNA, como no exemplo que apresentamos aqui. Os oligo-RNA tem um ribonucleotídeo que contém embutidos projetados para corrigir a mutação nonsense no genômica trp5 alelo defeituoso. A transferência de informação genética da ribonucleotídeo para o DNA genômico é revelado por uma mudança no fenótipo (células que crescem em meio falta de triptofano) das células-alvo. A freqüência de correção gene obtido com o oligo-RNA contendo é medido e comparado com a de um DNA-somente o controle oligo. Ao realizar este ensaio correção gene em fundos de células diferentes, onde mutar genes de levedura vários, podemos detectar qual o fator / s afectam especificamente dirigida pelo oligos RNA contendo. Assim, podemos revelar os mecanismos de como as células regulam a estabilidade de RNA / DNA híbridos. Simplesmente projetar diferentes variantes do oligos RNA contendo podemos determinar a probabilidade de um trato especial RNA para servir como modelo na modificação do ADN e podemos determinar a estabilidade de seqüências específicas de RNA incorporadas ao DNA. Além disso, podemos identificar quais são os preferidos em substratos vivo para fatores de interação com RNA / DNA híbridos. Apesar de vários estudos in vitro, principalmente utilizando curtas de RNA contendo oligos, têm sido realizados para caracterizar a função de fatores que podem reconhecer RNA em um híbrido com o DNA, tais como as enzimas RNase H 4, a vivo em funções de RNases H bem como a identidade de outras proteínas que podem afetar RNA / DNA estabilidade híbrido permanecem quase desconhecidas. A possibilidade de utilizar RNA contendo oligos de um período significativo (50 a 80-mers) e ótima qualidade (como oligos RNA contendo Thermo Scientific Dharmacon) tem aberto o caminho para examinar uma ampla variedade de processos moleculares in vivo diretamente na células de interesse. Como mostra este vídeo de transformação, usando RNA contendo oligos exige, essencialmente, apenas alguns passos adicionais em relação à transformação usando moléculas de DNA, para prevenir a degradação de RNases. Assim, a transformação usando RNA contendo oligos não é limitado ao sistema de levedura, mas pode ser aplicado a qualquer tipo de célula ou organismo onde a transformação pelo DNA oligos é proficiente. Em conclusão, tendo como alvo as células de RNA contendo oligos fornece a oportunidade de gerar RNA / DNA híbridos e ribonucleotídeos embutido no DNA in vivo nas células. A estabilidade da função, e as conseqüências desses in vivo gerado RNA / DNA híbridos podem ser analisadas e caracterizadas, potencialmente descobrir mecanismos desconhecidos de reparo do DNA e revelando novas estratégias para o gene alvo.

Transformação A. reagentes e meios de comunicação (modificado de Storici e Resnick, 2006 <ol><li> YPD (Yeast peptonada Dextrose): Para 1 L, 10 g de extrato de levedura, peptona de soja 20 g, 20 g de dextrose. Adicionar 15 g de ágar para fazer YPD meios sólidos. Autoclave antes de usar. Conservar à temperatura ambiente. </li><li> Solução 1: 0,1 M de acetato de lítio. Preparar imediatamente antes da transformação. Solução 1 é uma solução de trabalho, portanto, é preparado diretamente a partir do pó. Sem solução é feita. Manter a temperatura ambiente. LiAc aumenta a permeabilidade da parede celular de levedura de DNA. </li><li> Solução 2: 0,1 M de acetato de lítio e 50% de polietileno glicol 4000. Também a solução 2 é uma solução de trabalho e é feita diretamente a partir do pó. Nenhuma solução estoque é preparada. Manter a temperatura ambiente. Depósitos PEG oligos em células de levedura. </li><li> RNA contendo oligos (Thermo Scientific Dharmacon), 50-80-mers, dessalinizada, deprotected e não purificada. Ressuspender a 250 pmoles / mL. Armazenar a -80 ° C. </li><li> DNA somente oligos, 50-80-mers, já dessalgado e não purificada. Ressuspender a 50 pmoles / mL. Armazenar a -20 ° C. </li><li> SC-Trp (Synthetic mídia completa falta de triptofano) meios sólidos. </li><li> 0,5 centímetros de diâmetro contas de vidro, esterilizados em autoclave. </li><li> RNase-off: RNase solução de descontaminação. </li><li> DNase / RNase-free, tubos de centrífuga estéreis. </li><li> DNase / RNase-free, tubos cônicos estéreis. </li><li> DNase / RNase-free, dicas aerosol estéril pipeta com ZAP: 100-200 ml, 100-1000 ml. </li></ol> Colony B. materiais PCR. <ol><li> Primers DNA, já dessalgado e não purificada. Dissolver em água estéril a 50 pmoles / mL. Armazenar a -20 ° C. </li><li> Taq DNA polimerase, tampão, dNTPs. </li><li> Tubos PCR. </li></ol> C. purificação PCR. <ol><li> PCR kit de purificação. </li></ol> D. eletroforese em gel. <ol><li> Agarose. </li><li> 1 x TBE execução (45 mM Tris-borato e um tetraacetate etilenodiamina mM) diluída a partir de TBE 10x. </li><li> Marcador de peso molecular Prestained. </li><li> DNA corante carregamento. </li></ol> E. digestão Restrição. <ol><li> Enzimas de restrição, buffers de 10x, BSA. </li></ol> F. tratamento alcalino para o oligo-RNA que contém. <ol><li> 1 M de NaOH. </li><li> 1,2 M de solução de HCl. </li><li> 1 M de Tris-HCl, solução de pH 7.4. </li></ol>

generation of rna/dna hybrids in genomic dna by transformation using rna-containing oligonucleotides

Sintéticos curto polímeros de ácido nucléico, oligonucleotides (oligos), são as ferramentas mais funcional e generalizada da biologia molecular. Oligos podem ser produzidos para conter qualquer DNA ou RNA desejada seqüência e pode ser preparado para incluir uma ampla variedade de base e modificações açúcar. Além disso, oligos podem ser projetados para imitar alterações específicas de ácidos nucléicos e, portanto, podem servir como importantes ferramentas para investigar os efeitos de danos no DNA e mecanismos de reparação. Descobrimos que Thermo Scientific Dharmacon RNA contendo oligos com um comprimento entre 50 e 80 nucleotídeos pode ser particularmente adequado para estudar, in vivo, as funções e conseqüências de RNA cromossômicas / híbridos de DNA e de ribonucleotídeos incorporadas ao DNA. RNA / DNA híbridos podem facilmente se formam durante o reparo do DNA, replicação e transcrição, no entanto, muito pouco se sabe sobre a estabilidade do RNA / DNA híbrido em células e em que medida estes híbridos podem afetar a integridade genética das células. RNA contendo oligos, portanto, representam um vetor perfeito para apresentar em ribonucleotídeos DNA cromossômico e gerar RNA / DNA híbridos de comprimento escolhido e composição base. Aqui apresentamos o protocolo para a incorporação de ribonucleotídeos no genoma da levedura eucariótica modelo de sistema / Saccharomyces cerevisiae /. No entanto, nosso laboratório utilizou Thermo Scientific Dharmacon RNA contendo oligos para gerar RNA / DNA híbridos ao nível cromossômico em sistemas de células diferentes, de bactérias a células humanas.

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Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Este trabalho mostra como formar um híbrido RNA / DNA no nível cromossômico e revelar transferência de informação genética do RNA para DNA genômico em células de levedura.

Geração de RNA / DNA híbrido em DNA genômico por transformação por meio de RNA contendo Oligonucleotídeos

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

generation-rnadna-hybrids-genomic-dna-transformation-using-rna

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26.8K visualizações.  Georgia Institute of Technology. Este trabalho mostra como formar um híbrido RNA / DNA no nível cromossômico e revelar transferência de informação genética do RNA para DNA genômico em células de levedura.

Vídeo: Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Genética

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering (si)RNAs to inhibit the expression of complementary RNA transcripts is being exploited as a new class of therapeutics for a variety of diseases including HIV. Many previous reports have shown that novel RNAi-based anti-HIV/AIDS therapeutic strategies have considerable promise; however, a key obstacle to the successful therapeutic application and clinical translation of siRNAs is efficient delivery. Particularly, considering the safety and efficacy of RNAi-based therapeutics, it is highly desirable to develop a targeted intracellular siRNA delivery approach to specific cell populations or tissues. The HIV-1 gp120 protein, a glycoprotein envelope on the surface of HIV-1, plays an important role in viral entry into CD4 cells. The interaction of gp120 and CD4 that triggers HIV-1 entry and initiates cell fusion has been validated as a clinically relevant anti-viral strategy for drug discovery. 
Herein, we firstly discuss the selection and identification of 2'-F modified anti-HIV gp120 RNA aptamers. Using a conventional nitrocellulose filter SELEX method, several new aptamers with nanomolar affinity were isolated from a 50 random nt RNA library. In order to successfully obtain bound species with higher affinity, the selection stringency is carefully controlled by adjusting the conditions. The selected aptamers can specifically bind and be rapidly internalized into cells expressing the HIV-1 envelope protein. Additionally, the aptamers alone can neutralize HIV-1 infectivity. Based upon the best aptamer A-1, we also create a novel dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera in which both the aptamer and the siRNA portions have potent anti-HIV activities. Further, we utilize the gp120 aptamer-siRNA chimeras for cell-type specific delivery of the siRNA into HIV-1 infected cells. This dual function chimera shows considerable potential for combining various nucleic acid therapeutic agents (aptamer and siRNA) in suppressing HIV-1 infection, making the aptamer-siRNA chimeras attractive therapeutic candidates for patients failing highly active antiretroviral therapy (HAART).

Several 2&#x2019;-Fluoro RNA aptamers against HIV-1Ba-L gp120 with nanomole affinity are isolated from a RNA library by in vitro SELEX procedure. A new dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera is created and shows considerable promise for systemic anti-HIV therapy.

Desenvolvimento de células de tipo específico anti-HIV gp120 aptâmeros para entrega siRNA

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Imunologia e Infecção

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA (siRNA) in gene silencing1, RNAi has become a powerful research tool in gene function studies. Compared to genetic deletion, RNAi-mediated gene silencing possesses many advantages, such as the ease with which it is carried out and its suitability to most cell lines. Multiple studies have demonstrated the applications of RNAi technology in cancer research. In particular, the development of the DNA vector-based technology to produce small hairpin RNA (shRNA) driven by the U6 or H1 promoter has made long term and inducible gene silencing possible2,3. Its use in combination with genetically engineered viral vectors, such as lentivirus, facilitates high efficiencies of shRNA delivery and/or integration into genomic DNA for stable shRNA expression. 
We describe a detailed procedure using the DNA vector-based RNAi technology to determine gene function, including construction of lentiviral vectors expressing shRNA, lentivirus production and cell infection, and functional studies using a mouse xenograft model. 
Various strategies have been reported in generating shRNA constructs. The protocol described here employing PCR amplification and a 3-fragment ligation can be used to directly and efficiently generate shRNA-containing lentiviral constructs without leaving any extra nucleotide adjacent to a shRNA coding sequence. Since the shRNA-expression cassettes created by this strategy can be cut out by restriction enzymes, they can be easily moved to other vectors with different fluorescent or antibiotic markers. Most commercial transfection reagents can be used in lentivirus production. However, in this report, we provide an economic method using calcium phosphate precipitation that can achieve over 90% transfection efficiency in 293T cells. Compared to constitutive shRNA expression vectors, an inducible shRNA system is particularly suitable to knocking down a gene essential to cell proliferation. We demonstrate the gene silencing of Yin Yang 1 (YY1), a potential oncogene in breast cancer4,5, by a Tet-On inducible shRNA system and its effects on tumor formation. Research using lentivirus requires review and approval of a biosafety protocol by the Biosafety Committee of a researcher's institution. Research using animal models requires review and approval of an animal protocol by the Animal Care and Use Committee (ACUC) of a researcher's institution.

RNA interference (RNAi) possesses many advantages over gene knockout and has been broadly used as a tool in gene functional studies. The invention of DNA vector-based RNAi technology has made long term and inducible gene knockdown possible, and also increased the feasibility of gene silencing in vivo.

DNA Vector baseado em RNA de interferência para estudar a função Gênica em Câncer

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

Medicina

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite coupling reactions with the precision and density of UV light reflected from micrometer-sized mirrors. Photolithography yields microarrays that can accommodate from hundreds of thousands up to several million different DNA sequences, 100-nt or longer, in only a few hours. With this very large sequence space, microarrays are ideal platforms for exploring the mechanisms of nucleic acid&#183;ligand interactions, which are particularly relevant in the case of RNA. We recently reported on the preparation of a new set of RNA phosphoramidites compatible with in situ photolithography and which were subsequently used to grow RNA oligonucleotides, homopolymers as well as mixed-base sequences. Here, we illustrate in detail the process of RNA microarray fabrication, from the experimental design, to instrumental setup, array synthesis, deprotection and final hybridization assay using a template 25mer sequence containing all four bases as an example. In parallel, we go beyond hybridization-based experiments and exploit microarray photolithography as an inexpensive gateway to complex nucleic acid libraries. To do so, high-density DNA microarrays are fabricated on a base-sensitive monomer that allows the DNA to be conveniently cleaved and retrieved after synthesis and deprotection. The fabrication protocol is optimized so as to limit the number of synthetic errors and to that effect, a layer of &#946;-carotene solution is introduced to absorb UV photons that may otherwise reflect back onto the synthesis substrates. We describe in a step-by-step manner the complete process of library preparation, from design to cleavage and quantification.

In this article, we present and discuss new developments in the synthesis and applications of nucleic acid microarrays fabricated in situ. Specifically, we show how the protocols for DNA synthesis can be extended to RNA and how microarrays can be used to create retrievable nucleic acid libraries.

Microarrays de DNA e RNA de alta densidade-síntese fotolitográfica, hibridação e preparação de grandes bibliotecas de ácidos nucleicos

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

Geração de ratos geneticamente modificados através da microinjecção de oócitos

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Biologia do Desenvolvimento

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular methodology for applications in various fields and for different research purposes. The procedure described herein focuses on the synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA 5&#39;-[CUA CGG AAU CAU]-3&#39; containing zero, one, or two modifications located at the C2&#39;-O-position. The probes are based on 2-thiophenylmethyl groups, incorporated into RNA nucleotides via standard organic synthesis and introduced into the corresponding oligonucleotides via their respective phosphoramidites. This report makes use of phosphoramidite chemistry via the four canonical nucleobases (Uridine (U), Cytosine (C), Guanosine (G), Adenosine (A)), as well as 2-thiophenylmethyl functionalized nucleotides modified at the 2&#39;-O-position; however, the methodology is amenable for a large variety of modifications that have been developed over the years. The oligonucleotides were synthesized on a controlled-pore glass (CPG) support followed by cleavage from the resin and deprotection under standard conditions, i.e., a mixture of ammonia and methylamine (AMA) followed by hydrogen fluoride/triethylamine/N-methylpyrrolidinone. The corresponding oligonucleotides were purified via polyacrylamide electrophoresis (20% denaturing) followed by elution, desalting, and isolation via reversed-phase chromatography (Sep-pak, C18-column). Quantification and structural parameters were assessed via ultraviolet-visible (UV-vis) and circular dichroism (CD) photometric analysis, respectively. This report aims to serve as a resource and guide for beginner and expert researchers interested in embarking in this field. It is expected to serve as a work-in-progress as new technologies and methodologies are developed. The description of the methodologies and techniques within this document correspond to a DNA/RNA synthesizer (refurbished and purchased in 2013) that uses phosphoramidite chemistry.

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

This article provides a detailed procedure on the solid-phase synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA modified at the C2&#39;-O-position. UV-vis and circular dichroism photometric analyses are used to quantify and characterize structural aspects, i.e., single-strands or double-strands.

Protocolo para síntese de fase sólida de oligómeros de ARN contendo um 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -tiofenilmetilo Modificação e Caracterização através do Dicroísmo Circular

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

Química

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an upstream 3&#39; splice site within a pre-mRNA, a process called back-splicing. This circularization is likely aided by secondary structures in the pre-mRNA that bring the splice sites into close proximity. In human genes, Alu elements are thought to promote these secondary RNA structures, as Alu elements are abundant and exhibit base complementarities with each other when present in opposite directions in the pre-mRNA. Here, we describe the generation and analysis of large, Alu element containing reporter genes that form circular RNAs. Through optimization of cloning protocols, reporter genes with up to 20 kb insert length can be generated. Their analysis in co-transfection experiments allows the identification of regulatory factors. Thus, this method can identify RNA sequences and cellular components involved in circular RNA formation.

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

We clone and analyze reporter genes generating circular RNAs. These reporter genes are larger than constructs to analyze linear splicing and contain Alu elements. To investigate the circular RNAs, the constructs are transfected into cells and resulting RNA is analyzed using RT-PCR after removal of linear RNA.

Uso do elemento Alu contendo Minigenes para analisar RNAs circulares

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Bioquímica

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is applicable to a wide variety of organisms and is highly efficient in the species-rich order Coleoptera (beetles). Here, we summarize the necessary steps for developing this technique in a novel organism and illustrate its application to the different developmental stages of the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus. Target gene sequences can be obtained cost-effectively through the assembly of transcriptomes against a close relative with known genomics or de novo. Candidate gene cloning utilizes a specific cloning vector (the pCR4-TOPO plasmid), which allows the synthesis of double-stranded RNA (dsRNA) for any gene with the use of a single common primer. The synthesized dsRNA can be injected into either embryos for early developmental processes or larvae for later developmental processes. We then illustrate how RNAi can be injected into aquatic larvae using immobilization in agarose. To demonstrate the technique, we provide several examples of RNAi experiments, generating specific knockdowns with predicted phenotypes. Specifically, RNAi for the tanning gene laccase2 leads to cuticle lightening in both larvae and adults, and RNAi for the eye pigmentation gene white produces a lightening/lack of pigmentation in eye tubes. In addition, the knockdown of a key lens protein leads to larvae with optical deficiencies and a reduced ability to hunt prey. Combined, these results exemplify the power of RNAi as a tool for investigating both morphological patterning and behavioral traits in organisms with only transcriptomic databases.

RNA interference is a widely applicable, powerful technique for manipulating gene expression at specific developmental stages. Here, we describe the necessary steps for implementing this technique in the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus, from the acquisition of gene sequences to the knockdown of genes that affect structure or behavior.

Interferência de RNA em besouros aquáticos como uma poderosa ferramenta para manipular a expressão genética em pontos de tempo específicos de desenvolvimento

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

Ambiente

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work demonstrates that concepts from DNA nanotechnology can be used to program the enzymatic activity of the phage-derived T7 RNA polymerase (RNAP) and build scalable synthetic gene regulatory networks. First, an oligonucleotide-tethered T7 RNAP is engineered via expression of an N-terminally SNAP-tagged RNAP and subsequent chemical coupling of the SNAP-tag with a benzylguanine (BG)-modified oligonucleotide. Next, nucleic-acid strand displacement is used to program polymerase transcription on-demand. In addition, auxiliary nucleic acid assemblies can be used as &#34;artificial transcription factors&#34; to regulate the interactions between the DNA-programmed T7 RNAP with its DNA templates. This in vitro transcription regulatory mechanism can implement a variety of circuit behaviors such as digital logic, feedback, cascading, and multiplexing. The composability of this gene regulatory architecture facilitates design abstraction, standardization, and scaling. These features will enable the rapid prototyping of in vitro&#160;genetic devices for applications such as bio-sensing, disease detection, and data storage.

We describe the engineering of a novel DNA-tethered T7 RNA polymerase to regulate in vitro transcription reactions. We discuss the steps for protein synthesis and characterization, validate proof-of-concept transcriptional regulation, and discuss its applications in molecular computing, diagnostics, and molecular information processing.

Dna-Tethered RNA Polymerase para Transcrição In vitro Programável e Computação Molecular

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

Bioengenharia

Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of oligonucleotides in biotechnology and synthetic biology. Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates have historically been prepared in vitro by enzymatic methods. However, these methods are limited to natural RNA oligonucleotides, have strong sequence preferences, and tend to produce heterogeneous products. New methods of chemical triphosphorylation complement both the reduced cost of automated oligonucleotide synthesis by phosphoramidite chemistry and the diverse range of nucleotide modifications now available. Thus, the synthesis of oligonucleotide triphosphates of arbitrary sequence and length, and optionally containing various nonnatural modifications, is now accessible.
This paper presents the appropriate methods and techniques for chemical triphosphorylation of oligonucleotides using salicyl phosphorochloridite and pyrophosphate. This method uses commercially available reagents, is compatible with most oligonucleotides prepared by standard solid-phase synthesis methods, and can be completed in 2 h following oligonucleotide synthesis, before deprotection and purification. Two uses of chemically triphosphorylated oligonucleotides as substrates for catalytic RNA enzymes are demonstrated, including the synthesis of a mirror-image version of the hammerhead ribozyme from nonbiological L-RNA triphosphates.

Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates are ubiquitous components in essential biological pathways and have seen increasing use in biotechnology applications. Here, we describe techniques for the routine synthesis and purification of oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates, starting from oligonucleotides prepared by standard automated synthesis techniques.

Triphosforilação química de Oligonucleotídeos

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of ...