Name: generation of genetically modified mice through the microinjection of oocytes
Uploaded: 2017-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
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Os autores agradecem a equipe da instalação animal (BRC) por seu apoio contínuo. Este trabalho foi financiado pelo National Health and Medical Research Council e pelo Australian Research Council.

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética e Cuidados Animais da Universidade de Nova Gales do Sul. 1. Preparação do Transgene (Integração Aleatória) <ol><li> Eletroforese analítica em gel de agarose. <ol><li> Digite o plasmídeo para acelerar o transgene usando enzimas apropriadas (incubação de 1 hora) ou enzimas de rápida digestão (15 a 30 min de incubação) em um termociclador seguindo as recomendações do fabricante (veja a Figura 2A e sua legenda). </li><li> Juntar um gel de agarose de ácido tris-acetato-etilenodiaminotetraacetico a 1% (TEA), corado com 0,5-1,0 μg / mL de brometo de etidio (EtBr). NOTA: Tenha cuidado ao usar EtBr; É um mutagênico potente. Use o equipamento de proteção pessoal apropriado (consulte a folha de dados de segurança do material). </li><li> Carregar um marcador de peso molecular de 1 kb. </li><li> Carregue os fragmentos linearizados ( ie, transgene e espinha dorsal). </lI&gt; <li> Execute a eletroforese a 100 V por 45 min. </li><li> Visualize o gel em um transiluminador ultravioleta (UV) para verificar se a digestão está completa e para confirmar o tamanho correto do transgene ( ou seja, 7,338 pb, veja a Figura 2A ). </li></ol></li><li> Electroforese preparada em gel de agarose. <ol><li> Elimine um gel de agarose TAE a 1% corado com uma mancha de gel de baixa toxicidade. Carregar 8 alíquotas (1 μg cada) de transgene linearizado sem marcador de peso molecular e executar a eletroforese a 100 V durante 45 min. Use um bisturi para excluir todas as 8 bandas correspondentes ao transgene linearizado. </li><li> Extraia o DNA usando um kit de extração de gel seguindo as recomendações do fabricante (veja a Tabela de Materiais ). <ol><li> Derreta os fragmentos de gel a 50 ° C em tubos de 1,5 mL durante pelo menos 15 min. Precipitar com isopropanol e depois adicionar o tampão de ligação. </li><li> Combine todo o DNA, pipetando tudo em uma coluna. Eluir em tampão de microinjecção livre de nuclease (8 mM Tris-HCl e 0,15 mM EDTA). Filtrar através de um filtro de microcentrífuga de 0,22 μm e centrifugação por 60 s a 12 000 x g. </li></ol></li><li> Medir a concentração e a qualidade do DNA usando um espectrofotômetro. Verifique se a relação A260 / A280 é de cerca de 1,8 ( ou seja, nenhuma contaminação por proteínas) e a relação A260 / A230 é pelo menos 2,0 ( ou seja, não há contaminação por solventes orgânicos). Diluir até 3 ng / μL em tampão de microinjecção livre de nuclease, alíquota (20-50 μL) e congelar a -20 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Síntese de Componentes CRISPR (Gene Targeting) <ol><li> Cas9 mRNA. <ol><li> Diluir o ARNm Cas9 (obtido a partir de uma fonte comercial, ver a Tabela de Materiais ) a uma concentração de 1 μg / μL em tampão de microinjeção livre de nucleases. </li><li> Alíquota em 2 μL e livre<html> Ze a -80 ° C. </li></ol></li><li> RNA de guia único (SgRNA). <ol><li> Identifique as seqüências genômicas desejadas de dois lados (guias) utilizando uma ferramenta de projeto computacional que permita o potencial mínimo de atividade fora do alvo 17 . <ol><li> Para o knockout de genes, selecione sistematicamente duas guias localizadas a poucas centenas de pares de bases (pb) separadas, em direções opostas, e incluem o codão de início do gene de interesse. Para reparo direto de homologia, selecione duas guias sobrepostas (sempre que possível), em direções opostas. NOTA: Como exemplo, os seguintes guias foram recentemente co-injetados com sucesso para interromper o primeiro exão do gene TPM4.2 : Guia 1: 5 &#39;CGCCATCCAGTTCGCGCTGC 3&#39;; Guia 2: 5 &#39;CAGAACGATTGAGCTATGGC 3&#39; </li></ol></li><li> Peça um conjunto de iniciadores conforme descrito na Tabela 1 . </li><li> Sintetizar um modelo de DNA linear. <ol><li> Diluir px330Ref &quot;&gt; 12 plasmídeo a 10 ng / μL em água livre de nucleases. </li><li> Prepare a mistura principal conforme indicado na Tabela 1 . Adicione a polimerase no final e mantenha a mistura principal no gelo. </li><li> Misture e divida isso em 8 tubos de PCR (19 μL / tubo). Adicione 1 μL de px330 por tubo e execute o PCR nas seguintes condições: 1 min a 98 ° C; 40 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 64 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 15 s; E um alongamento final a 72 ° C durante 5 min. Segure a 4 ° C. </li><li> Purifique os produtos de PCR usando um kit de purificação por PCR (veja a Tabela de Materiais ), um colector e uma fonte de vácuo (para um processamento mais rápido). Aplique a força máxima no vácuo ( ou seja, 8 mbar). <ol><li> Adicione 5 volumes (100 μL) de tampão de ligação a 1 volume da amostra de PCR e misture. </li><li> Coloque uma coluna de rotação de membrana de sílica (fornecida) em um tubo de coleta (fornecido) de 2 mL para centrifugação ou no colector para processo de vácuoIng. Para ligar o DNA, aplique sucessivamente todas as 8 amostras à coluna e vácuo ou centrifugadora por 60 s a 12.000 xg por cada carga. </li><li> Para lavar, adicione 0,75 mL de tampão de lavagem (PE tampão) à coluna e vácuo ou centrífuga por 60 s a 12.000 x g. Centrifugue a coluna por 60 s a 12.000 xg para eliminar o etanol residual. </li><li> Coloque a coluna em um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mL. Para eluir o DNA, adicione 30 μL de água livre de nuclease ao centro da membrana, deixe a coluna repousar durante 1 min e centrifugue por 60 s a 12 000 g. </li></ol></li><li> Medir a concentração usando um espectrofotômetro; Tipicamente, a concentração deve ser 100 ng / μL ou superior. Verifique se a relação A260 / A280 é de cerca de 1,8 ( ou seja, nenhuma contaminação por proteínas) e a relação A260 / A230 é pelo menos 2,0 ( ou seja, não há contaminação por solventes orgânicos). </li></ol></li><li> Transcrição in vitro usando um kit de síntese de RNA T7. <ol><li> Prepare tEle mestre mistura, como indicado na Tabela 1 , e incuba durante 3 h a 37 ° C num termociclador. Adicione 28 μL de água livre de nuclease e 2 μL de DNase I e incube durante mais 15 min a 37 ° C num termociclador. </li></ol></li><li> Purificação de ARN usando colunas de rotação. <ol><li> Dissolver o pó contido na coluna de rotação fornecida em 650 μL de tampão de microinjeção livre de nuclease, removendo cuidadosamente todas as bolhas de ar. Capte o tubo e hidrata durante 5 a 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Remova a tampa azul na parte inferior e coloque a coluna em um tubo de 2 mL. Centrifugar durante 2 min a 750 xg e temperatura ambiente. Coloque a coluna em um tubo fresco de 1,5 mL e aplique gota a gota 50 μL da solução de ARN no centro, sem tocar na parede da coluna. Gire a coluna durante 2 min a 750 x g. </li><li> Medir a concentração de ARN usando um espectrofotômetro (o rendimento típico de uma reação é de 30 a 50 μg). Verifique se a relação A260 / A280 é umaA ronda 2.0 ( ou seja, nenhuma contaminação por proteínas) ea relação A260 / A230 é de pelo menos 2,0 ( ou seja, não há contaminação por solventes orgânicos). Armazene os sgRNAs em -80 ° C até o uso. </li><li> Avalie a qualidade do RNA usando os géis de TAE de 1% rotineiramente utilizados para a eletroforese de DNA. Execute 200-400 ng do modelo de DNA e o sgRNA correspondente em paralelo. A banda de RNA (≈ 100 pb) deve ser ligeiramente maior que a banda de DNA (ver Figura 3A ). </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Modelo do doador <ol><li> Peça oligonucleótidos de cadeia simples sintetizados comercialmente (ssOligos, veja a Tabela de Materiais ) para mutações pontuais ou para a integração de pequenas sequências até 50 pb; Os braços de homologia são normalmente de 60 a 90 pb de comprimento. </li><li> Para inserções maiores, use um plasmídeo doador como modelo. Gerar um plasmídeo adequado usando o método clássico de clonagem ou síntese de novo a partir de umFonte comercial. NOTA: Recomenda-se um mínimo de 800 pb por braço de homologia. O tamanho da espinha dorsal não tem influência na eficiência do reparo direto de homologia (HDR). </li></ol> 4. Mistura por injeção <ol><li> Diluir o ARNm de Cas9 a 50 ng / μL e os sgRNAs para 12,5 ng / μL (25 ng / μL no total) usando tampão de microinjeção livre de nucleases para experiências de nocaute de genes. Adicione o modelo de doador (ssOligo ou plasmídeo) a uma concentração de 200 ng / μL para experiências de edição de genoma com base em reparo direto de homologia. NOTA: Os volumes de diluição podem ser facilmente determinados usando ferramentas on-line, como uma calculadora de ressuspensão 18 . </li><li> Mantenha cada alíquota no gelo durante a sessão de microinjeção e descarte depois (não re-congelar a mistura de injeção). </li></ol> 5. Vasectomia Scrotal NOTA: Dois tipos de vasectomia são comumente realizados em camundongos: abdominal e escrotal. O últimoÉ menos invasivo e já foi descrito anteriormente 15 . <ol><li> Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos de aço inoxidável. </li><li> Determine o peso do mouse usando uma escala de pesagem e anestesize os machos por injeção intraperitoneal (ip) com anestésicos injetáveis ​​(ketamina 100 mg / kg, xilazina 10 mg / kg). </li><li> Monitore a perda do reflexo de pitada do dedo do pé e, uma vez que o mouse é sedado, coloque-o sobre uma almofada de aquecimento. </li><li> Desinfecte a pele em torno dos testículos com toalhetes alternados de um anti-séptico tópico, como a clorhexidina e 70% de etanol. </li><li> Empurre os testículos no saco escrotal e faça uma incisão da pele com um bisturi. </li><li> Visualize o testículo, a cauda epidídima e o canal deferente. </li><li> Pegue o canal deferente com fórceps, segure-o e cauterize em cada lado da pinça para remover 3 mm do canal deferente. </li><li> Execute o mesmo procedimento no segundo testículo. </li><li> Feche as incisões da pele com clipes de ferida e monitore aMouse de perto até recuperação completa. </li></ol> 6. Superovulação (Doadores de Oócitos) e Time-Mating (Fêmeas Pseudo-grávidas) NOTA: A técnica para gerar um número adequado de oócitos fertilizados e fêmeas adotivas obstruídas para reimplante foi descrita em outro lugar 15 . <ol><li> Injectar 10 fêmeas ip com 5 UI de gonadotrofina sérica da égua grávida (PMSG em 100 μL) em torno de 12 horas no dia 1. </li><li> Injete as fêmeas ip com 5 UI de gonadotrofina coriônica humana (hCG em 100 μL) 46-48 h depois (cerca de 11 horas no dia 3). </li><li> Imediatamente mate as fêmeas com machos solteiros durante a noite. </li></ol> 7. Injeções Pronucleares (de integração aleatória) e citoplasmáticas (Gene-targeting) <ol><li> Retire os camundongos superovulados por deslocamento cervical, exponha o abdômen e acesse os ovários e ovidutos, conforme descrito anteriormente 15 . Dissecte o oViducos e colhe os complexos cumulus-oócitos (COCs) sob um estereomicorscópio 15 . Coloque-os em uma gota de meio de otimização de potássio simplex suplementado com aminoácidos (KSOMaa) seguindo o método tradicional 15 . </li><li> Purifique os oócitos adicionando aproximadamente 1 μL de hialuronidase (10 mg / mL) à gota do meio de KSOMaa usando uma bocal de aspirador e coloque o prato em uma incubadora de CO 2 de 37 ° C / 5% durante 30 s a 1 min. </li><li> Lave os oócitos com 4 gotas frescas de meio KSOMaa usando a boca da aspiradora e transfira-as para uma gota final de meio KSOMaa sobreposta com óleo mineral (cerca de 2 mL). Coloque o prato na incubadora de CO 2 de 37 ° C / 5% até que os oócitos estejam prontos para injeção. </li><li> Injeção pronuclear (integração aleatória). <ol><li> Visualize os ovos sob o microscópio estereoscópico e transfira aproximadamente 50 ovos para a câmara de injeção (uma droP de meio M2 coberto com óleo mineral) usando a peça de boca do aspirador. </li><li> Transfira a câmara de injeção para o microscópio invertido e injete os oócitos fertilizados (dois pronúcleos visíveis) com alguns picolitros da mistura de injeção, visando um pronúcleo (qualquer dos pronúcleos pode ser direcionado). Visualize uma injeção bem sucedida observando o inchaço do pronúcleo. </li></ol></li><li> Injeção citoplasmática (segmentação gênica). <ol><li> Transfira aproximadamente 50 ovos para uma gota de KSOMaa contendo 5 μg / mL de Citotinase B utilizando a peça bucal e incubar durante 5 min na incubadora a 37 ° C / 5% de CO 2 . </li><li> Transfira os ovos para a câmara de injeção usando a peça da boca. </li><li> Injetar poucos picolitros da mistura de injeção no citoplasma a uma pressão muito baixa (50-100 hPa), usando a pressão de compensação do microinjetor automatizado sempre que possível. </li><li> Após a injeção, transfira os oócitos de volta para uma gota de KSOMaa (usando a peça de boca) e mantê-los na incubadora de CO 2 de 37 ° C / 5%, até serem carregados para reimplante no oviduto de fêmeas pseudo-grávidas. </li></ol></li></ol> 8. Reimplante <ol><li> Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos de aço inoxidável. </li><li> Determine o peso do mouse usando a escala de pesagem e anestesize as fêmeas por injeção intraperitoneal (ip) com anestésicos injetáveis ​​(ketamina 100 mg / kg, xilazina 10 mg / kg). </li><li> Monitore a perda do reflexo de pitada do dedo do pé e, uma vez que o mouse é sedado, coloque-o sobre uma almofada de aquecimento. </li><li> Inclua uma grande área da pele ao redor da linha média dorsal do mouse feminino. </li><li> Desinfecte a pele exposta com toalhetes alternados de um anti-séptico tópico, como a clorhexidina e 70% de etanol. </li><li> Exponha o trato reprodutivo seguindo o método tradicional 15 . Faça uma incisão de pele de 1 cm de comprimento paralela à linha média dorsal, corte o músculo e pegue a almofada de gordura.Uma pinça, depois puxe suavemente o ovário até que o seu oviducto e o útero sejam claramente visíveis. </li><li> Corrija a almofada gorda com um grampo de vaso. Visualize o oviduto sob o microscópio estereoscópico e usando um par de micro-tesouras faça uma incisão na parede do oviducto alguns milímetros a montante da ampola. </li><li> Sob o microscópio estereoscópico, carregue 25 ovos microinjetados no capilar de vidro conectado à boca (o diâmetro interno do capilar deve ter cerca de 120 um de largura). Introduza o capilar de vidro no tubo de ovidação e expulse até que uma bolha de ar seja visível dentro da ampola. </li><li> Remova cuidadosamente o capilar de vidro e coloque o trato reprodutivo no abdômen. Suturar a incisão com suturas cirúrgicas não absorvíveis 3-0, depois fechar com clipes de ferida. Monitore o mouse de perto até recuperar completamente. </li></ol> 9. Estratégias de Genotipagem / Seqüenciamento NOTA: Isolar o genômicoDNA de biópsias de cauda ou orelha de 2 mm, seguindo os regulamentos relevantes de ética animal. <ol><li> Extração rápida de DNA genômico (integração aleatória). <ol><li> Leve as amostras de tecido (~ 2 mm) a 95 ° C durante 1 h em 100 μL de reagente de lise alcalino (hidróxido de sódio 25 mM e EDTA 0,2 mM, pH = 12). </li><li> Adicionar 100 μL de reagente neutralizante (Tris-HCl 40 mM, pH = 5). </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 12.000 g e 4 ° C. </li></ol></li><li> Extração de DNA genômico de alta qualidade (segmentação de genes). <ol><li> Adicionar 500 μL de tampão de cauda (Tris 50 mM, pH = 8, EDTA 100 mM, pH = 8; NaCl 100 mM, SDS a 1% e 0,5% de proteinasa K, adicionada recentemente). </li><li> Incubar durante a noite a 55 ° C. </li><li> Misture por 5 minutos com a inversão (não vortex). </li><li> Adicione 250 μL de NaCl saturado (6 M) e misture durante 5 minutos invadindo (não vortex). </li><li> Girar por 5-10 min a 12.000 xg e 4 ° C e despeje o sobrenadante para o novo tubo. </lI&gt; <li> Adicione 500 μL de isopropanol e misture por 5 minutos com inversão (não vortex). </li><li> Gire durante 10 minutos a 12.000 xg e temperatura ambiente. </li><li> Decantar o sobrenadante (o pellet é invisível e fica com o tubo). </li><li> Lavar com 1 mL de etanol a 70%. </li><li> Rotação por 5-10 min a 12.000 xg e temperatura ambiente. Remova o sobrenadante com cuidado, já que o sedimento branco não é mais pegajoso e pode ser perdido. </li><li> Seque o ar por ~ 1 h. </li><li> Adicionar 400 μL de tampão TE (Tris 10 mM e EDTA 1 mM, pH = 8). </li><li> Dissolver o DNA a 55-60 ° C durante 2 h. </li></ol></li><li> Desenho inicial. <ol><li> Desenhe primers com um mínimo de 20 pb de comprimento usando uma ferramenta computacional 19 . NOTA: Para a integração aleatória, os primers devem se hibridizar com o transgene, gerando um fragmento distinto de 200-800 pb. Para a segmentação por genes, crie os primers para que eles hibridem com o DNA genômico, gerando um f distintoAumentando algumas centenas de bp em torno dos locais cortados. Para inserções grandes, os iniciadores podem se sentar no transgene, mas a confirmação da integração direcionada deve ser realizada subsequentemente usando uma caminhada de iniciador ou uma técnica similar. </li></ol></li><li> Genotipagem por PCR. <ol><li> Para cada modificação genômica, crie um novo protocolo de PCR e teste-o empiricamente. Considere o comprimento do fragmento gerado e a temperatura de fusão (Tm) de cada par de primers. </li></ol></li><li> Seqüenciamento. <ol><li> Para a segmentação por genes, envie produtos de PCR para um provedor de serviços de seqüestro Sanger. </li></ol></li></ol>

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Os autores fornecem serviços de transgênese acadêmica em camundongos através do Centro Analítico Mark Wainwright da Universidade de Nova Gales do Sul.

Passos críticos dentro do protocolo A geração de camundongos geneticamente modificados é conhecida por ser tecnicamente desafiadora. No entanto, o protocolo apresentado aqui é um método otimizado e simplificado que permite dominar e solucionar a técnica em tempo recorde. Há duas etapas necessárias para a conclusão bem-sucedida da técnica. Primeiro, a síntese de modelos de DNA linear (para a síntese de sgRNAs) pode ser conseguida sem cloreto de magnésio (MgCl2). No entanto, é alta...

Os modelos animais, tanto em vertebrados quanto em invertebrados, têm sido fundamentais para examinar a fisiopatologia das condições humanas, como a doença de Alzheimer 1 , 2 . Eles também são ferramentas inestimáveis ​​para procurar modificadores de doenças e, em última instância, desenvolver novas estratégias de tratamento na esperança de uma cura. Embora cada modelo tenha limitações intrínsecas, o uso de animais como modelos sistêmicos inteiros é vital para a pesquisa biomédica. Isso ocorre porque o ambiente fisiológico metabólico e complexo não pode ser totalmente simulado na cultura de tecidos. Até à data, o rato continua a ser a espécie de mamífero mais comum usada para manipulação genética porque apresenta várias vantagens. Os processos fisiológicos e os genes associados a doenças são altamente conservados entre camundongos e seres humanos. O mouse foi o primeiro mamífero a ter seu genoma completo seqüenciado (2002), um ano antes do geno humanoEu (2003). Além dessa riqueza de informações genéticas, o mouse possui boas capacidades de criação, um ciclo de desenvolvimento rápido (6 semanas desde a fertilização até o desmame) e um tamanho razoável. Todas essas vantagens, juntamente com indicadores fisiológicos, como cores de revestimento distintas (necessárias para estratégias de cruzamento), fizeram do mouse um modelo atraente para manipulação genética. Notavelmente, na era mais precoce da genética moderna, Gregor Mendel começou a trabalhar em camundongos antes de se mudar para as plantas 3 . As técnicas de transferência de genes resultaram na geração do primeiro rato transgênico há mais de três décadas 4 , inicialmente criado usando a entrega viral. No entanto, os pesquisadores logo perceberam que um dos principais desafios da transgênese do mouse era a incapacidade de controlar o destino do DNA exógeno. Como a distribuição viral de transgenes em oócitos de ratos resultou em cópias múltiplas integradas aleatoriamente no genoma, o possibilitO estabelecimento de linhas transgênicas subsequentes foi limitado. Uma dessas limitações foi superada quando Gordon et al. Gerou a primeira linha de mouse transgênica por microinjeção 5 , 6 . Isso começou a era da tecnologia de DNA recombinante, e os parâmetros que influenciam o resultado de uma sessão de microinjeção foram amplamente estudados 7 . Embora a microinjeção não permita o controle sobre o site de integração do transgene (que eventualmente resulta em níveis de expressão específicos para cada mouse fundador), a principal vantagem da microinjeção pronuclear continua sendo a formação de concatemers ( ou seja, matrizes de múltiplas cópias do transgene, Ligado em série) antes da integração genômica 5 . Esta característica tem sido utilizada ao longo dos anos para estabelecer milhares de linhas de mouse transgênicas que sobre-expressam um gene de interesse. Desde então, a transgênese, aModificação artificial do genoma de um organismo, tem sido amplamente utilizada para identificar o papel de genes únicos na ocorrência de doenças. Uma outra conquista chave na manipulação do genoma do mouse foi alcançada quando o Mario Capecchi interrompeu com sucesso um único gene no mouse, abrindo a era da segmentação gênica 8 . No entanto, as principais desvantagens emergiram rapidamente da segmentação por células baseadas em células ES, incluindo os desafios de cultivar células ES, o grau de quimerismo um tanto variável e o comprimento do processo ( ou seja, 12-18 meses, mínimo, para obter o mouse) . Recentemente, os avanços nas novas tecnologias, tais como endonucleases de engenharia ( por exemplo, nucleases de zinco (ZFN), efetoras nucleas efectoras de transcrição (TALEN), e repetições palindrômicas curtas (CRISPR / Cas9) agrupadas regularmente foram emergentes como métodos alternativos para Acelerar o processo de segmentação de genes no microfoneE 9 , 10 . Estas endonucleases podem ser facilmente injetadas em oócitos de ratinho por microinjeção, permitindo a geração de camundongos alvo de genes em apenas 6 semanas. Desde o primeiro relatório sobre o uso do CRISPR para a edição do genoma 11 , este sistema imunológico adaptativo bacteriano substituiu ZFN e TALEN por suas muitas vantagens, incluindo a facilidade de síntese e a capacidade de segmentar múltiplos loci de uma vez (referido como &quot;multiplexação &quot;). O CRISPR foi utilizado pela primeira vez para segmentação gênica em camundongos 12 e desde então foi aplicado a inúmeras espécies, de plantas a seres humanos 13 , 14 . Até à data, não há relatório de uma única espécie resistente à edição do genoma CRISPR. Os dois principais passos limitantes da geração de camundongos transgênicos são a injeção de oócitos eo reimplanteDesses oócitos em fêmeas pseudo-grávidas. Embora esta técnica tenha sido descrita por nós 15 e outros 16 , as melhorias técnicas recentes em embriologia de ratos e técnicas de transferência de genes revolucionaram o processo de geração de camundongos geneticamente modificados. Essas melhorias serão descritas aqui.

<table><tbody><tr><td>Micropipette 0.1-2.5 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000016</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 2 - 20 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000040</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 20 - 200 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000067</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 100 - 1,000 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000083</td><td></td></tr><tr><td>Molecular weight marker&amp;nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-33025</td><td>HyperLadder 1 kb</td></tr><tr><td>Molecular weight marker&amp;nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-33056</td><td>HyperLadder 100 bp</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td></td></tr><tr><td>EDTA buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93296</td><td>10x - Dilute to 1x</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe gel stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Gel extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>PCR purification kit (Qiaquick)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum system (Manifold)</td><td>Promega</td><td>A7231</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free microinjection buffer&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>MR-095-10F</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree-MC microcentrifuge filter&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 mRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS9MRNA</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR expressing plasmid (px330)</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Phusion polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>T7 Quick High Yield RNA kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2050S</td><td></td></tr><tr><td>RNA purification spin columns (NucAway)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM10070</td><td></td></tr><tr><td>ssOligos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>OLIGO STANDARD</td><td></td></tr><tr><td>Donor plasmid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>GeneArt</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884</td><td></td></tr><tr><td>KSOMaa embryo culture medium</td><td>Zenith Biotech&amp;nbsp;</td><td>ZEKS-100</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Zenith Biotech&amp;nbsp;</td><td>ZSCO-100</td><td></td></tr><tr><td>M2 Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>Mouthpiece</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Glass microcapillaries</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-78-10</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Applichem</td><td>A3830.0100</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Iris scissors</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Vessel clamp</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>18374-43</td><td></td></tr><tr><td>Wound clips&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>12040-01</td><td></td></tr><tr><td>Clips applier&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>12018-12</td><td></td></tr><tr><td>Micro-scissors&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Cauterizer</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0)</td><td>Ethicon</td><td>1691H</td><td></td></tr><tr><td>5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>MG Scientific</td><td>Galaxy 14S</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nanodrop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>6321 000.515</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis set up</td><td>BioRad</td><td>1640300</td><td></td></tr><tr><td>UV Transilluminator</td><td>BioRad</td><td>1708110EDU</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>6334000069</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscopic microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>2x Micromanipulators</td><td>Eppendorf</td><td>5188000.012</td><td></td></tr><tr><td>Oocytes manipulator</td><td>Eppendorf</td><td>5176000.025</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector (Femtojet)</td><td>Eppendorf</td><td>5247000.013</td><td></td></tr><tr><td>Mice C57BL/6J strain</td><td>Australian BioResources</td><td>C57BL/6JAusb&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of genetically modified mice through the microinjection of oocytes

O uso de camundongos geneticamente modificados tem contribuído significativamente para estudos em processos fisiológicos e patológicos in vivo . A injeção pronuclear de construções de expressão de DNA em oócitos fertilizados continua a ser a técnica mais utilizada para gerar camundongos transgênicos para superexpressão. Com a introdução da tecnologia CRISPR para segmentação gênica, a injeção pronuclear em oócitos fertilizados foi estendida à geração de camundongos knockout e knockin. Este trabalho descreve a preparação de DNA para injeção e a geração de guias CRISPR para segmentação gênica, com especial ênfase no controle de qualidade. Os procedimentos de genotipagem necessários para a identificação de potenciais fundadores são críticos. Estratégias inovadoras de genotipagem que aproveitam as capacidades de &quot;multiplexação&quot; do CRISPR são aqui apresentadas. Os procedimentos cirúrgicos também são delineados. Juntos, as etapas do protocolo permitirão a geração de genCamundongos eticamente modificados e para o estabelecimento subseqüente de colônias de ratos para uma infinidade de campos de pesquisa, incluindo imunologia, neurociência, câncer, fisiologia, desenvolvimento e outros.

Abaixo, descrevem-se os fluxos de trabalho para microinjecção no caso de integração aleatória e orientação de genes mediada por CRISPR ( Figura 1 ). <img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55765/55765fig1v2.jpg" /> Figura 1: Fluxo de trabalho típico para a geração de ratos modificados genéticamente. Para a integração aleatória, o transgene pur...

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Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

A microinjecção de oócitos de rato é comumente utilizada tanto para a transgênese clássica ( ou seja, a integração aleatória de transgenes) e a segmentação de genes mediada por CRISPR. Este protocolo analisa os últimos desenvolvimentos em microinjeção, com ênfase particular no controle de qualidade e estratégias de genotipagem.

Geração de ratos geneticamente modificados através da microinjecção de oócitos

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

generation-genetically-modified-mice-through-microinjection

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

20.5K visualizações.  University of New South Wales.  A microinjecção de oócitos de rato é comumente utilizada tanto para a transgênese clássica ( ou seja, a integração aleatória de transgenes) e a segmentação de genes mediada por CRISPR. Este protocolo analisa os últimos desenvolvimentos em microinjeção, com ênfase particular no controle de qualidade e estratégias de genotipagem. 

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Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Deficitária e Abordagem de ganho de função para Investigar celular precoce Destino Determinantes na pré-implantação embriões de camundongos

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Biologia do Desenvolvimento

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Genética

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a routine procedure is widely utilized throughout the world and its main limitation resides in the poor efficacy of transgene integration, resulting in a low yield of founder animals. Only few percent of animals born after implantation of injected fertilized oocytes have integrated the transgene. In contrast, lentiviral vectors are powerful tools for integrative gene transfer and their use to transduce fertilized oocytes allows highly efficient production of founder transgenic mice with an average yield above 70%. Furthermore, any mouse strain can be used to produce transgenic animal and the penetrance of transgene expression is extremely high, above 80% with lentiviral mediated transgenesis compared to DNA microinjection. The size of the DNA fragment that can be cargo by the lentiviral vector is restricted to 10 kb and represents the major limitation of this method. Using a simple and easy to perform injection procedure beneath the zona pellucida of fertilized oocytes, more than 50 founder animals can be produced in a single session of microinjection. Such a method is highly adapted to perform, directly in founder animals, rapid gain and loss of function studies or to screen genomic DNA regions for their ability to control and regulate gene expression in vivo.

Here, we present a protocol to promote transgene integration and production of founder transgenic mice with high efficacy by a simple injection of a lentiviral vector in the perivitelline space of a fertilized oocyte.

Particulas de Lentivirus mediada produção de camundongos transgênicos: um método simples e altamente eficiente para estudo direto dos fundadores

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. The CRISPR/Cas9 system allows researchers to modify the genome with unprecedented efficiency, fidelity, and simplicity. Harnessing this technology, researchers are seeking a rapid, efficient, and easy protocol for generating GM mice. Here we introduce an improved method for cryopreservation of one-cell embryos that leads to a higher developmental rate of the freeze-thawed embryos. By combining it with optimized electroporation conditions, this protocol allows for the generation of knockout and knock-in mice with high efficiency and low mosaic rates within a short time. Furthermore, we show a step-by-step explanation of our optimized protocol, covering CRISPR reagent preparation, in vitro fertilization, cryopreservation and thawing of one-cell embryos, electroporation of CRISPR reagents, mouse generation, and genotyping of the founders. Using this protocol, researchers should be able to prepare GM mice with unparalleled ease, speed, and efficiency.

Here, we present a modified method for cryopreservation of one-cell embryos as well as a protocol that couples the use of freeze-thawed embryos and electroporation for the efficient generation of genetically modified mice.

Uso de embriões congelados para produção de ratos geneticamente modificados

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

Somatic Genome-Engineered Mouse Models Using In Vivo Microinjection and Electroporation

Germline genetically engineered mouse models (G-GEMMs) have provided valuable insight into in vivo gene function in development, homeostasis, and disease. However, the time and cost associated with colony creation and maintenance are high. Recent advances in CRISPR-mediated genome editing have allowed the generation of somatic GEMMs (S-GEMMs) by directly targeting the cell/tissue/organ of interest.
The oviduct, or fallopian tube in humans, is considered the tissue-of-origin of the most common ovarian cancer, high-grade serous ovarian carcinomas (HGSCs). HGSCs initiate in the region of the fallopian tube distal to the uterus, located adjacent to the ovary, but not the proximal fallopian tube. However, traditional mouse models of HGSC target the entire oviduct, and thus do not recapitulate the human condition. We present a method of DNA, RNA, or ribonucleoprotein (RNP) solution microinjection into the oviduct lumen and in vivo electroporation to target mucosal epithelial cells in restricted regions along the oviduct. There are several advantages of this method for cancer modeling, such as 1) high adaptability in targeting the area/tissue/organ and region of electroporation, 2) high flexibility in targeted cell types (cellular pliancy) when used in combination with specific promoters for Cas9 expression, 3) high flexibility in the number of electroporated cells (relatively low frequency), 4) no specific mouse line is required (immunocompetent disease modeling), 5) high flexibility in gene mutation combination, and 6) possibility of tracking electroporated cells when used in combination with a Cre reporter line. Thus, this cost-effective method recapitulates human cancer initiation.

Somatic Genome-Engineered Mouse Models Using In Vivo Microinjection and Electroporation

This protocol describes microinjection and in vivo electroporation for regionally restricted CRISPR-mediated genome editing in the mouse oviduct.

Modelos de camundongos com engenharia genômica somática usando microinjeção e eletroporação in vivo

Germline genetically engineered mouse models (G-GEMMs) have provided valuable insight into in vivo gene function in development, homeostasis, and disease. ...

Pesquisa do câncer

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Microinjeção de zigoto para criação de alelos knock-in e flox de gênico em camundongos

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

<meta charset="utf8"></head><body>Procedimento de injeção de espermátides redondas murinas para estudar o desenvolvimento embrionário

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Injeção de espermátide redonda em camundongo

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

Injeção de espermátide redonda em camundongo

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

Avaliação do mouse microinjeção de oócitos, maturação e ploidia

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Geração de ratos geneticamente modificados através da microinjecção de oócitos

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Deficitária e Abordagem de ganho de função para Investigar celular precoce Destino Determinantes na pré-implantação embriões de camundongos

Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I

Particulas de Lentivirus mediada produção de camundongos transgênicos: um método simples e altamente eficiente para estudo direto dos fundadores

Uso de embriões congelados para produção de ratos geneticamente modificados

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Microinjeção de zigoto para criação de alelos knock-in e flox de gênico em camundongos

Injeção de espermátide redonda em camundongo

Injeção de espermátide redonda em camundongo

Injeção de espermátide redonda em camundongo

Avaliação do mouse microinjeção de oócitos, maturação e ploidia