Name: generation of rna/dna hybrids in genomic dna by transformation using rna-containing oligonucleotides
Uploaded: 2010-11-24T18:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der Georgia Cancer Coalition grant-R9028 unterstützt.

Gründe Ausnutzung der Verwendung von Thermo Scientific Dharmacon Oligos, 50 bis 80-mers, hier präsentieren wir ein Verfahren, basierend auf einem Gen-Korrektur-Assay, durch die Oligos genetischen Information, um genomische DNA von Hefezellen übertragen kann, folgende Glühen, das Ziel chromosomalen DNA. Erfolgreiche Ausrichtung von Oligos ist durch das Auftreten von Hefe-Kolonien in dem die voraussichtliche Phänotyp erzielt. Wenn die gewünschte genetische Veränderung innerhalb eines oder mehrerer Ribonukleotiden in der Oligo-Sequenz eingebaut durchgeführt wird, fließt die genetische Information direkt aus der RNA-Darm-Trakt der chromosomalen Ziel-DNA, also ein RNA / DNA-Hybrid bildet bei der chromosomalen Ebene während der Targeting-Prozess. Die Ribonukleotid / s aus einem Thermo Scientific Dharmacon RNA-haltigen Oligo kann als Vorlage für Gen-Targeting über DNA-Reparatur-Synthese dienen oder in die DNA integriert werden und dienen als Vorlage bei der DNA-Replikation. In diesen Experimenten verwenden wir die Hefe / Saccharomyces cerevisiae / eukaryotischen Modellsystem, aber einen ähnlichen Ansatz auch in anderen Organismen oder Zellen angewendet werden. In diesem Video, verwenden wir ein Thermo Scientific Dharmacon Oligo mit Homologie konzipiert, um ein Ziel Hefe genomischen Lokus und die einen Ribonukleotid in der Mitte, um eine Mutation im Zielgen zu korrigieren. Nach der Transformation mit dem RNA-haltigen Oligo beobachten wir die Korrektur der Ziel-Website bei einer bestimmten Frequenz, was bedeutet, dass die RNA-Darm-Trakt der Oligo in die chromosomale DNA konnten integriert werden und dienen als Vorlage für die DNA-Synthese während der DNA-Replikation gibt. Die genetische Information in der RNA-Darm-Trakt getragen wird stabil an die folgenden Generationen Zelle übertragen. Hier beschreiben wir die Schritte der Hefezelle Umbildung durch den Thermo Scientific Dharmacon RNA-haltigen Oligo-und die Annäherung an die RNA Informationen übertragen in die chromosomale DNA zu erkennen. A. Aufbau der RNA-haltigen Oligo in diesem Experiment verwendet Wir haben ein RNA-haltigen Oligo um einen genetischen Defekt in der Hefe zu korrigieren konzipiert S. cerevisiae chromosomale DNA an der trp5 Locus. Der Hefestamm in das verwendete Protokoll enthält eine Mutante trp5 Gens mit einer Zwei-Basendeletion und eine Nonsense-Mutation (Abbildung 1A). Solche Hefestamm ist ein Tryptophan auxotrophen Mutante und bildet keine Kolonien auf Medien ohne Tryptophan. Die DNA-Sequenz des Gens TRP5 finden Sie auf der Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/). Die Thermo Scientific Dharmacon RNA-haltigen Oligo im Sinne dieses Protokolls ist ein 65-mer mit einem 2-base DNA-Insertion, entwickelt, um die Deletionsmutation und ein Ribonukleotid entwickelt, um die Nonsense-Mutation des trp5 Allel (Abbildung 1A) richtig zu korrigieren. Die Sequenz des Oligo ist wie folgt aufgebaut: 5&#39;-AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG-CG-GATCCCACATTCTG-RG-GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT. Diese Oligo wird von Thermo Scientific Dharmacon (Lafayette, CO) bei 200 nm-Maßstab und wird entsalzt, entschützt und ohne PAGE Reinigung. B. Herstellung der RNA-haltigen Oligo für Hefe-Transformation (modifiziert nach Storici et al., 2007 1) <ol><li> Wischen Sie Materialien, die für das Experiment mit Oligo Röhren, Pipetten, Wirbel, Racks, experimentellen Bereich und Handschuhe von den Prüfern mit RNase Dekontaminationslösung mögliche RNase Kontamination vor alles beginnt zu entfernen getragen verwendet werden. Verwenden RNase-freies Wasser, chemische Reagenzien, Reaktionsgefäße und Pipettenspitzen in allen Schritten. Jeder Schritt in diesem Experiment sollte RNase-frei sein. </li><li> Resuspendieren Thermo Scientific Dharmacon RNA-haltigen Oligo erhielt von der Firma zu 250 pMol / ul Stammlösung mit RNase-freiem Wasser und kräftig vortexen, um das Pellet zu lösen. Lagerung bei -80 ° C. </li><li> Unmittelbar vor der Transformation, tauen die RNA-haltigen Oligo auf Eis und verdünnter zu 50 pMol / ul mit RNase-freiem Wasser in RNase-freie Rohre. Jeder Wandel erfordert 1 nmol der RNA-haltigen Oligos. </li><li> Denaturieren eine gewählte Höhe der RNA-haltigen Oligos auf dem 100 ° C Hitze-Block für 2 min zur sekundären Strukturen des Oligos zu beseitigen. </li><li> Unmittelbar nach Denaturierung statt der Röhre auf dem Eis. Keep on ice bis Transformation. </li><li> Als Kontrolle in dem Experiment eine entsprechende DNA-Oligo nur verwendet wird. Diese Oligo ist von -20 ° C aufgetaut und zubereitet für die Transformation als RNA-haltigen Oligo, wie oben beschrieben. </li></ol> C. Transformation von Hefezellen mit Hilfe der RNA-haltigen Oligo <ol><li> Impfen 5 ml reichen YPD-Flüssigmedium mit der trp5 mutierten Hefezellen wachsen und bei 30 ° C über Nacht (siehe Materialien). </li><li> Übertragen 1,5 ml der Übernacht-Kultur in 50 ml YPD flüssigen Medium. </li><li> Inkubieren von Zellen in einer 30 ° C Schüttler (225 rpm) für 4h. </li><li> Bereiten Sie Lösung 1und Lösung 2 unmittelbar vor der Transformation in RNase-freie Röhrchen (siehe Materialien). </li><li> Übertragen Sie die Zellkultur zu einer 50 ml RNase-freies Röhrchen und drehen sich mit 3000 rpm, das entspricht bis 1562 g, für 2 min. Das Pellet aus der Zelle Niederschlag liegt bei ca.. 0,3 cm 3. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen mit 50 ml RNase-freies Wasser und drehen sich mit 3000 rpm für 2 min. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 6 für 5 mal loswerden das Kulturmedium und RNasen, die vorhanden sein in dem Medium so weit wie möglich könnte. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und die Zellen in 5 ml der Lösung 1 und Spin bei 3000 rpm für 2 min. </li><li> Überstand entfernen und die Zellen in 250 ul Lösung 1. Diese Menge an Zellen reicht für 7-8 Transformationen. </li><li> Aliquot 50 pl der Zellsuspension in RNase-freien Reaktionsgefäßen, fügen Sie 20 ul RNA-haltigen Oligo funktionierende Lösung (1 nmol) oder 20 ul DNA-Oligo nur funktionierende Lösung (1 nmol) oder 20 ul sterilem Wasser ohne Oligo für die negative Kontrolle. Dann fügen Sie 300 ul Lösung 2 für jede Transformation Reaktion. Es gibt keine Notwendigkeit, Lachs-Sperma-DNA in den Prozess der Transformation hinzu, wie die Oligos fungieren als Träger selber. </li><li> Vortex kräftig zu mischen Komponenten homogen. </li><li> Inkubieren Transformation Reaktionen bei 30 ° C für 30 min in einem Shaker. </li><li> Hitzeschock bei 42 ° C für 15 min. </li><li> Spin down Zellen bei 5000 rpm, das entspricht 2236 g, für 4 min. </li><li> Überstand entfernen und die Zellen in 100 ul sterilem Wasser. </li><li> Nehmen Sie ein Aliquot dieser Zellsuspension und verdünnen Sie es mit sterilem Wasser von 100.000-fache und Platte-Zellen auf einer YPD Platte mit ca.. 15 sterile Glasperlen und Inkubieren bei 30 ° C für 2 Tage. </li><li> Platte aller resuspendierten Zellen aus jeder Transformation Reaktion auf eine Petrischale aus Kunststoff komplette festen Medium ohne Tryptophan (SC-Trp) mit ca.. 15 sterile Glasperlen und Inkubieren bei 30 ° C für 4-5 Tage (Abbildung 2). </li></ol> D. Analyse von Gen-Korrektur durch die RNA-haltigen Oligo <ol><li> Zählt die Anzahl der Kolonien auf der selektiven Medium (Abbildung 2) sowie auf YPD-Medium, das Gen-Korrektur-Frequenz für den RNA-haltigen Oligo berechnen, die DNA-only Oligo-und für die no-Oligo-Steuerung. Vergleichen Sie die Nummer erhalten. Spontane Rückkehr von der trp5 Allele mit dem Zwei-Basendeletionen und die Nonsense-Mutation ist weniger als 10-9 in den verwendeten Hefestamm, so erwarten wir keine Kolonien Bildung auf der selektiven Medium, wenn keine Oligos zu den Zellen hinzu. </li><li> Streak aus mehreren zufällig ausgewählten Transformante Kolonien auf YPD-Medium, um einzelne Kolonie isoliert zu erhalten. Warten Sie zwei Tage für Koloniewachstum, dann nehmen Sie mehrere (mindestens 5) einzelne Kolonien und machen Flecken auf YPD und auf selektivem Medium. </li><li> Entwerfen Sie ein Paar von Primern für die Region (250-1.000 bp) durch die RNA-haltigen Oligo durch Kolonie-PCR (Abbildung 1B) gezielt zu verstärken. Das Verfahren für die Kolonie-PCR ist wie folgt (modifiziert nach Storici und Resnick, 2006 2). <ol><li> Die Zellen (ca. 1 mm3) aus den einzelnen Patches in 50 ul Wasser aufgenommen und fügen Sie 1 Einheit des Lyticase. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min, durch Inkubation in einem Heizblock folgte bei 100 ° C für 5 min zu den Zellen und Freisetzung genomische DNA in Lösung zu brechen. </li><li> PCR-Bedingungen: Die PCR-Reaktion umfasst 10 ul der Zelle Resuspension, 50 pmol jedes von Vorwärts-und Rückwärts-Primer, 1 ul 10 mM dNTPs, 1 Einheit Taq-Polymerase, 5 ul 10x Puffer und mit sterilem Wasser bis zu einer eingestellten Endvolumen von 50 ul durchgeführt. Das PCR-Programm wird 3 min bei 95 ° C, 30 Zyklen von 30 s bei 95 ° C, 30 s bei 55 ° C und 1 min bei 72 ° C, eine letzte Verlängerung der Zeit von 7 Minuten bei 72 ° C, dann Proben werden bei 4 ° C gehalten Eine Verlängerung der Zeit von 1 min / kb ist für diese Reaktion angenommen. </li><li> Nach PCR werden die Proben auf einem 1% oder 2% (in Abhängigkeit von der erwarteten Größe des PCR-Produkts) Agarosegel für die Beobachtung des PCR-Produkts (Abbildung 3) ausgeführt werden. </li></ol></li><li> Wenn die genetische Information von der RNA-haltigen Oligo übertragen erzeugt eine neue Restriktionsschnittstelle in der Hefe genomischen Zielregion (Abbildung 1B), ist es möglich, die korrekte Übermittlung von Informationen durch Verdau des PCR-Produkts mit dem entsprechenden Restriktionsenzym zu überprüfen. Wenn keine Restriktionsschnittstelle durch die RNA-haltigen Oligo erzeugt wird, gehen Sie zu Schritt 6 weiter. Digest PCR-Produkte mit einem bestimmten Restriktionsenzym. Die Abbaureaktion umfasst 6 ul PCR-Produkt, Puffer, BSA (nicht benötigt für einige Enzyme, siehe Anleitung für das Enzym verwendet werden), 0,5 ul Restriktionsenzym und sterilem Wasser auf 15 ul. Die Proben werden für 1 h bei der Temperatur spezifisch für das verwendete Enzym inkubiert. </li><li> Führen Sie eine unverdaute Probe zusammen mit dem verdauten Proben auf der gleichen Zeile einer 2% igen Agarosegel zubeobachten die genetische Veränderung durch die RNA-Darm-Trakt des RNA-haltigen Oligo (Abbildung 3) übertragen. </li><li> Purify PCR-Produkte durch Verwendung eines PCR-Purification Kit und bereiten sie für die DNA-Sequenzierung. Submit Proben für die Sequenzierung mit dem gleichen Primer verwendet, um ein Produkt zu verstärken. </li><li> Analysieren Sie die DNA-Sequenzierung Ergebnisse mit Software, die Ausrichtung von mehreren Sequenzen mit einer ausgewählten Referenz-Sequenz (Abbildung 4) ermöglicht. </li></ol> E. Alkalibehandlung der RNA-haltigen Oligo (Abbildung 5) <ol><li> Für jede Reaktion add 1 nmol (4 ul von 250 pMol / ul Stammlösung) der RNA-haltigen Oligo-oder DNA-Oligo in ein 1,5 ml-Tube. </li><li> Add 4 ul 1 M NaOH für die Hydrolyse, oder alternativ add 4 ul H 2 O als negative Kontrolle, und inkubieren Sie bei 65 ° C im Wasserbad für 1 h Dann aus dem Wasserbad, um Eis zu bewegen. </li><li> Neutralisieren mit 2 ul von 1,2 M HCl, 4 ul 1 M Tris-HCl und 4 ul H 2 O, oder alternativ 6 ul H 2 O und 4 ul 1 M Tris-HCl für negative Kontrolle. Keep on ice bis Transformation. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des defekten trp5 Gens und des TRP5 Allel durch die RNA-haltigen Oligo korrigiert. A) Die trp5 mutierte Gen enthält einen 2-base-Deletion (schwarze Dreiecke) und 1-Basis Nonsense-Mutation (Stern). Die einsträngige RNA-haltigen Oligo mit 2-base Insertion (blaue Schleife) und 1-RNA Basenaustausch (rotes Rechteck) Erzeugen eines Van91 ich Restriktionsenzymstelle (dargestellt durch die Klammer) wird in Hefezellen transformiert, um die genetische Defekte zu korrigieren der trp5 Gen. B) Nach dem TRP5 Gen durch die RNA-haltigen Oligo (korrigiert Basen sind als blaue Rechtecke gekennzeichnet) repariert wird, ist die Van91 I-Stelle in die TRP5 Gen erzeugt. A 278 bp-Fragment mit nur einem Van91 I Restriktionsschnittstelle in TRP5 Gen PCR durch ein Paar von Primern (P1 und P2) verstärkt. Die 177 bp und 101 bp Fragmente nach Aufschluss der P1-und P2-PCR-Produkt von Van91 generiert I sind ebenfalls dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Transformation Ergebnis mit der RNA-haltigen Oligo. A) Hefezellen ohne Oligo verwandelt bilden keine Kolonie auf dem SC-Trp Medium, siehe Platten ab. B) Die Platten cg zeigen Hefekolonien wachsen auf SC-Trp nach Zellen mit 1 nmol der RNA-haltigen Oligo umgewandelt. C) Platten hl zeigen Hefekolonien wachsen auf SC-Trp nach Zellen mit 1 nmol der entsprechenden DNA-only Kontrolle Oligo umgewandelt. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Detektion von genetischen Information Transfer vom RNA-haltigen Oligo Hefe chromosomale DNA durch Restriktionsverdau des PCR-Produktes verstärkt die gezielte genomischen Region. 2% Agarosegelelektrophorese von PCR-Proben, die durch P1 und P2 verstärkt und verdaut mit Van91 I Restriktionsenzym. Spuren 1, 8 und 15, DNA-Leiter mit Größen von 100, 200, 300, 400 und 500 bp angegeben auf der linken Seite; Spur 2, PCR-Produkt von trp5 locus von der genomischen DNA des trp5 Mutante verstärkt; Spur 3, PCR Produkt aus genomischer DNA aus einer Trp + Kolonie durch die DNA-Oligo nur gezielt abgeleitet verstärkt, Spur 9 bis 14, Van91 I Restriktionsverdau, Spur 4-7, PCR-Produkte von genomischer DNA aus Trp +-Kolonien durch die RNA-haltigen Oligo gezielt abgeleitet verstärkt der PCR-Produkte von Bahnen 2 bis 7. Die Präsenz der uncut-PCR-Produkt-Bands in den Bahnen 10 bis 14 können durch partielle Verdauung durch Van91 ich am TRP5 Locus (CCACATTCTGG) erläutert. In Anbetracht, dass die Schneiden Website für Van91 I (CCANNNN NTGG) können mehrere Sequenzen haben, kann die Seite in TRP5 erzeugt nicht die optimale Ziel für das Enzym. In der Tat, nach DNA-Sequenzierung aller oben genannten PCR Produkte, die wir erkennen keine weiteren Änderungen über die von der Oligos durchgeführt (siehe Abbildung 4). Die 278 bp PCR-Bande von P1 und P2-Primer und die Verdauung Produkt-Banden durch Van91 verstärkt I von 177 bp und 101 bp sind durch die Pfeile auf der rechten Seite angezeigt. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/2152/2152fig4.jpg"><img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig4tmb.jpg" border="0" alt="Abbildung 4Thumb" /></a> Abbildung 4. DNA-Sequenzierung Ergebnisse zeigen Gen-Korrektur durch die RNA-haltigen Oligo. A) DNA Elektropherogramm der genomischen Region des RNA-haltigen Oligo ausgerichtet. Das G in der DNA-Sequenz (blau boxed) leitet sich von der RG auf der RNA-haltigen Oligo. Auch boxed ist das Einsetzen der CG Basen. Sequencing Ergebnisse aus allen anderen PCR-Produkte werden auch als clear wie dieses, mit fluoreszierenden Signale weit über dem Hintergrund. B) Sequenzen der TRP5 Region des Trp + Transformanten durch die DNA-only Oligo (T1) und der RNA-haltigen Oligo (T2-T5) entsprechen in der Konsensus-Sequenz auf dem Gipfel zielgerichtet und sind mit denen der trp5 mutierten Zellen im Vergleich vor Targeting durch die Oligos (Genomic DNA, rot schattiert). Die Reparatur-RNA-haltigen Oligo auf der Unterseite hat zwei-base DNA-Insertion und einer-base (G) RNA-Substitution in rot markiert. Die Regionen boxed in blau mit gelben Farbton zeigen, dass die RNA-haltigen Oligo sowie die DNA-Oligo nur präzise korrigiert die Deletionsmutation und Nonsense-Mutation in allen getesteten Proben. Die gestrichelten Linien markieren die Position des RNA-haltigen Oligo-Sequenz. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Alkalibehandlung verhindert Gen Korrektur durch den RNA-haltigen Oligo. Die Transformation Frequenz durch die RNA-haltigen Oligo (R) in den roten Balken, und dass durch die DNA-only Oligo (D) ist in den blauen Balken angezeigt wird angezeigt. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwertes für 3 unabhängige Transformationen für jedes Oligo. Die DNA-only Oligo zeigt ähnliche Transformation Frequenz ohne und mit NaOH-Behandlung. Anders fällt Transformation Frequenz durch die RNA-haltigen Oligo auf 0 nach der Behandlung mit NaOH. Daher ist die Vorbereitung mit der RNA-haltigen Oligo nicht mit DNA-Oligo nur verunreinigt, so ist die beobachtete Umwandlung Frequenz spezifisch für den RNA-haltigen Oligo.

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	<li>Storici, F., Bebenek, K., Kunkel, T. A., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-templated+DNA+repair.">RNA-templated DNA repair.</a> Nature. 447, 338-3341 (2007).</li><li>Storici, F., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delitto+perfetto+approach+to+in+vivo+site-directed+mutagenesis+and+chromosome+rearrangements+with+synthetic+oligonucleotides+in+yeast.">The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast.</a> Methods Enzymol. 409, 329-345 (2006).</li><li>Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-mediated+DNA+modifications+and+RNA-templated+DNA+repair.">RNA-mediated DNA modifications and RNA-templated DNA repair.</a> Curr Opin Mol Ther. 10, 224-230 (2008).</li><li>Cerritelli, S. M., Crouch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonuclease+H:+the+enzymes+in+eukaryotes.">Ribonuclease H: the enzymes in eukaryotes.</a> FEBS J. 276, 1494-1505 (2009).</li></ol>

Die Videoproduktion für diesen Artikel wurde von Thermo Fisher Scientific, die Reagenzien und Instrumenten in dieser Publikation verwendeten produziert gesponsert.

Die Tatsache, dass RNA kann genetische Information direkt zu übertragen, um genomische DNA in Zellen entdeckt wurde Ausnutzung der Verwendung von synthetischen RNA-haltigen Oligos (Dharmacon synthetisiert Oligos) 1. Es war der proof of principle, dass die Zellen RNA-Moleküle oder RNA-Sequenzen nur als Vorlagen für die DNA-Synthese verwendet werden kann. Die Verwendung von RNA-haltigen Oligos nicht nur um die Demonstration führte, dass genetische Informationen direkt aus RNA übertragen werden, um genomische DNA, ohne die Notwendigkeit eines Reverse Transkription DNA-Kopie Zwischen-, sondern auch der Beweis, dass RNA als homologe Vorlage kann in eingesetzt werden die Reparatur eines DNA-Schäden 1,3. Die Oligos kann der RNA-only gemacht werden oder enthalten nur eine einzige Ribonukleotid in eine DNA-Sequenz eingebettet, wie in dem Beispiel haben wir hier vorgestellt. Die RNA-haltigen Oligo hat einen eingebetteten Ribonukleotid entwickelt, um die Nonsense-Mutation in der genomischen defekte trp5 Allel zu korrigieren. Die Übertragung der genetischen Information von der Ribonucleotid der genomischen DNA wird durch eine Änderung im Phänotyp (Zelle wächst auf dem Medium ohne Tryptophan) der Zielzellen enthüllt. Die Frequenz von Gen-Korrektur mit der RNA-haltigen Oligo wird gemessen und verglichen mit einer Kontroll-DNA-only-Oligo. Mit der Durchführung dieses Gen-Korrektur-Assay in verschiedenen Zell-Hintergründe, wo wir zu mutieren verschiedenen Hefe-Gene, können wir erkennen, welcher Faktor / s speziell beeinflussen gezielt durch die RNA-haltige Oligos. So können wir zeigen, Mechanismen, wie Zellen die Stabilität der RNA / DNA-Hybride zu regulieren. Durch einfaches Design verschiedene Varianten der RNA-haltigen Oligos können wir die Wahrscheinlichkeit für eine bestimmte RNA-Darm-Trakt als Vorlage in DNA-Modifikation dienen festzustellen, und wir können die Stabilität der RNA-Sequenzen in DNA eingebettet zu bestimmen. Darüber hinaus können wir erkennen, was sind die bevorzugten in vivo Substrate für Faktoren der Interaktion mit RNA / DNA-Hybride. Während einige in-vitro-Studien, vor allem unter Verwendung von kurzen RNA-haltigen Oligos, wurden durchgeführt, um die Funktion von Faktoren, die RNA in eine hybride erkennen kann, mit DNA, wie die RNase H Enzyme 4, die in vivo Funktionen von RNasen H sowie Charakterisierung wie die Identität von anderen Proteinen, die Auswirkungen auf RNA / DNA-Hybrid Stabilität bleiben meist unbekannt könnten. Die Möglichkeit zu nutzen RNA-haltigen Oligos, die eine beträchtliche Länge (50 bis 80-mere) und optimale Qualität (z. B. Thermo Scientific Dharmacon RNA-haltigen Oligos) hat die Art und Weise zu untersuchen, ein breites Spektrum an molekularen Prozesse direkt in vivo in der offenen Zellen von Interesse. Wie in diesem Video, Transformation gezeigt mit RNA-haltigen Oligos erfordert im wesentlichen nur ein paar zusätzliche Schritte im Vergleich zu Transformation mit DNA-Molekülen, den Abbau durch RNasen zu verhindern. So kann die Transformation unter Verwendung von RNA-haltigen Oligos ist nicht auf die Hefe-System beschränkt, sondern auf jeden Organismus oder Zelltyp, wo Transformation von DNA Oligos beherrscht angewendet werden. Abschließend gezielt Zellen durch RNA-haltigen Oligos bietet die Möglichkeit, RNA / DNA-Hybride und Ribonukleotiden in DNA in vivo in Zellen eingebettet zu generieren. Die Stabilität, Funktion und Folgen dieser in vivo generierten RNA / DNA-Hybride können analysiert und charakterisiert werden, die möglicherweise die Aufdeckung unbekannter Mechanismen der DNA-Reparatur und aufschlussreiche neue Strategien für die Gen-Targeting.

A. Transformation Reagenzien und Medien (modifiziert nach Storici und Resnick, 2006 <ol><li> YPD (Yeast Peptone Dextrose): Für 1 L, 10 g Hefeextrakt, 20 g Soja-Pepton, 20 g Dextrose. Fügen Sie 15 g Agar auf YPD festen Medien zu machen. Autoclave vor dem Gebrauch. Lagerung bei Raumtemperatur. </li><li> Lösung 1: 0,1 M Lithium-Acetat. Bereiten Sie unmittelbar vor dem Wandel. Lösung 1 ist eine funktionierende Lösung, so ist es direkt aus dem Pulver hergestellt. Keine Stammlösung hergestellt wird. Halten Sie bei Raumtemperatur. LiAc erhöht die Hefezellwand Permeabilität für DNA. </li><li> Lösung 2: 0,1 M Lithium-Acetat und 50% Polyethylenglykol 4000. Auch die Lösung 2 ist eine funktionierende Lösung, und es ist direkt aus dem Pulver hergestellt. Keine Stammlösung angesetzt. Halten Sie bei Raumtemperatur. PEG Ablagerungen Oligos auf Hefezellen. </li><li> RNA-haltige Oligos (Thermo Scientific Dharmacon), 50 bis 80-mers, entsalzt, entschützt und nicht gereinigt. Resuspendieren und 250 pMol / ul. Lagerung bei -80 ° C. </li><li> DNA-Oligos nur, 5-80-mers, entsalzt und nicht gereinigt. Resuspendieren und 50 pMol / ul. Lagerung bei -20 ° C. </li><li> SC-Trp (Synthetic komplette Medien fehlt Tryptophan) festen Medien. </li><li> 0,5 cm Durchmesser Glasperlen, durch Autoklavieren sterilisiert. </li><li> RNase-off: RNase-Dekontamination Lösung. </li><li> DNase / RNase-frei, sterile Zentrifugenröhrchen. </li><li> DNase / RNase-frei, sterile konische Rohre. </li><li> DNase / RNase-frei, steril Aerosol Pipettenspitzen mit ZAP: 1-200 ml, 100-1000 ml. </li></ol> B. Colony PCR Materialien. <ol><li> DNA-Primer, entsalzt und nicht gereinigt. Man löst in sterilem Wasser auf 50 pMol / ul. Lagerung bei -20 ° C. </li><li> Taq DNA Polymerase, Puffer, dNTPs. </li><li> PCR-Röhrchen. </li></ol> C. PCR-Aufreinigung. <ol><li> PCR Purification Kit. </li></ol> D. Gel-Elektrophorese. <ol><li> Agarose. </li><li> 1 x TBE-Laufpuffer (45 mM Tris-Borat und 1 mM Ethylendiamintetraacetat) ab 10x TBE verdünnt. </li><li> Prestained Molekulargewichtsmarker. </li><li> DNA Loading Dye. </li></ol> E. Restriktionsverdau. <ol><li> Restriktionsenzyme, 10x Puffer, BSA. </li></ol> F. Alkalibehandlung für die RNA-haltigen Oligo. <ol><li> 1 M NaOH-Lösung. </li><li> 1,2 M HCl-Lösung. </li><li> 1 M Tris-HCl, pH 7,4 Lösung. </li></ol>

generation of rna/dna hybrids in genomic dna by transformation using rna-containing oligonucleotides

Synthetische kurzen Nukleinsäure-Polymere, Oligonukleotide (Oligos), sind die funktionellen und weit verbreitete Methoden der Molekularbiologie. Oligos erzeugt eine beliebige DNA-oder RNA-Sequenz enthalten sein und kann bereit sein, eine Vielzahl von Basis-und Zucker-Modifikationen zählen werden. Darüber hinaus können Oligos entwickelt, um spezifische Nukleinsäure Veränderungen imitieren und damit als wichtige Werkzeuge dienen dazu, Auswirkungen von DNA-Schäden und Mechanismen der Reparatur zu untersuchen. Wir fanden, dass Thermo Scientific Dharmacon RNA-haltigen Oligos mit einer Länge zwischen 50 und 80 Nukleotiden kann besonders geeignet um zu studieren, in vivo, Funktionen und Folgen der chromosomalen DNA / RNA-Hybriden und der Ribonukleotiden zu DNA eingebettet. RNA / DNA-Hybride können leicht während der DNA-Replikation,-Reparatur und Transkription zu bilden, aber sehr wenig über die Stabilität der RNA / DNA-Hybride in den Zellen und in welchem ​​Umfang diese Hybriden kann die genetische Integrität der Zellen beeinflussen bekannt. RNA-haltige Oligos, daher stellen eine perfekte Vektor Ribonukleotiden in die chromosomale DNA einzuführen und erzeugen RNA / DNA-Hybride der gewählten Länge und Basenzusammensetzung. Hier präsentieren wir Ihnen das Protokoll für die Aufnahme von Ribonukleotiden in das Genom der eukaryotischen Modellsystem Hefe / Saccharomyces cerevisiae /. Dennoch hat unser Labor genutzt Thermo Scientific Dharmacon RNA-haltigen Oligos an RNA / DNA-Hybride bei der chromosomalen Ebene in verschiedenen Zellsystemen zu generieren, von Bakterien bis zu menschlichen Zellen.

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Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Diese Arbeit zeigt, wie ein RNA / DNA-Hybrid bei der chromosomalen Ebene bilden und zeigen Übertragung der genetischen Information von RNA, um genomische DNA in Hefezellen.

Generierung von RNA / DNA-Hybride in genomischer DNA durch Transformation mit RNA-haltigen Oligonukleotiden

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

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Serie: Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Eine Standardmethodik, vor-Ort-Mutagenität als Funktion der Punktmutation Reparatur katalysiert durch CRISPR/Cas9 und SsODN in den menschlichen Zellen zu untersuchen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Forschung

Genetik

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA (siRNA) in gene silencing1, RNAi has become a powerful research tool in gene function studies. Compared to genetic deletion, RNAi-mediated gene silencing possesses many advantages, such as the ease with which it is carried out and its suitability to most cell lines. Multiple studies have demonstrated the applications of RNAi technology in cancer research. In particular, the development of the DNA vector-based technology to produce small hairpin RNA (shRNA) driven by the U6 or H1 promoter has made long term and inducible gene silencing possible2,3. Its use in combination with genetically engineered viral vectors, such as lentivirus, facilitates high efficiencies of shRNA delivery and/or integration into genomic DNA for stable shRNA expression. 
We describe a detailed procedure using the DNA vector-based RNAi technology to determine gene function, including construction of lentiviral vectors expressing shRNA, lentivirus production and cell infection, and functional studies using a mouse xenograft model. 
Various strategies have been reported in generating shRNA constructs. The protocol described here employing PCR amplification and a 3-fragment ligation can be used to directly and efficiently generate shRNA-containing lentiviral constructs without leaving any extra nucleotide adjacent to a shRNA coding sequence. Since the shRNA-expression cassettes created by this strategy can be cut out by restriction enzymes, they can be easily moved to other vectors with different fluorescent or antibiotic markers. Most commercial transfection reagents can be used in lentivirus production. However, in this report, we provide an economic method using calcium phosphate precipitation that can achieve over 90% transfection efficiency in 293T cells. Compared to constitutive shRNA expression vectors, an inducible shRNA system is particularly suitable to knocking down a gene essential to cell proliferation. We demonstrate the gene silencing of Yin Yang 1 (YY1), a potential oncogene in breast cancer4,5, by a Tet-On inducible shRNA system and its effects on tumor formation. Research using lentivirus requires review and approval of a biosafety protocol by the Biosafety Committee of a researcher's institution. Research using animal models requires review and approval of an animal protocol by the Animal Care and Use Committee (ACUC) of a researcher's institution.

RNA interference (RNAi) possesses many advantages over gene knockout and has been broadly used as a tool in gene functional studies. The invention of DNA vector-based RNAi technology has made long term and inducible gene knockdown possible, and also increased the feasibility of gene silencing in vivo.

DNA-Vektor-basierte RNA-Interferenz, um Genfunktionen in Cancer Study

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

Medizin

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial purification of biologically important RNA/protein complexes. However, this strategy suffers from one major disadvantage that limits its broader utilization: the biotin/streptavidin interaction can be broken only under denaturing conditions that also disrupt the integrity of the eluted complexes, hence precluding their subsequent functional analysis and/or further purification by other methods. In addition, the eluted samples are frequently contaminated with the background proteins that nonspecifically associate with streptavidin beads, complicating the analysis of the purified complexes by silver staining and mass spectrometry. To overcome these limitations, we developed a variant of the biotin/streptavidin strategy in which biotin is attached to an RNA substrate via a photo-cleavable linker and the complexes immobilized on streptavidin beads are selectively eluted to solution in a native form by long wave UV, leaving the background proteins on the beads. Shorter RNA binding substrates can be synthesized chemically with biotin and the photo-cleavable linker covalently attached to the 5&#39; end of the RNA, whereas longer RNA substrates can be provided with the two groups by a complementary oligonucleotide. These two variants of the UV-elution method were tested for purification of the U7 snRNP-dependent processing complexes that cleave histone pre-mRNAs at the 3&#39; end and they both proved to compare favorably to other previously developed purification methods. The UV-eluted samples contained readily detectable amounts of the U7 snRNP that was free of major protein contaminants and suitable for direct analysis by mass spectrometry and functional assays. The described method can be readily adapted for purification of other RNA binding complexes and used in conjunction with single- and double-stranded DNA binding sites to purify DNA-specific proteins and macromolecular complexes.

RNA/protein complexes purified using botin-streptavidin strategy are eluted to solution under denaturing conditions in a form unsuitable for further purification and functional analysis. Here, we describe a modification of this strategy that utilizes a photo-cleavable linker in RNA and a gentle UV-elution step, yielding native and fully functional RNA/protein complexes.

Einzelschritt-Reinigung der makromolekularen komplexe mit RNA an Biotin und ein Foto-spaltbaren Linker befestigt

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Biochemie

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite coupling reactions with the precision and density of UV light reflected from micrometer-sized mirrors. Photolithography yields microarrays that can accommodate from hundreds of thousands up to several million different DNA sequences, 100-nt or longer, in only a few hours. With this very large sequence space, microarrays are ideal platforms for exploring the mechanisms of nucleic acid&#183;ligand interactions, which are particularly relevant in the case of RNA. We recently reported on the preparation of a new set of RNA phosphoramidites compatible with in situ photolithography and which were subsequently used to grow RNA oligonucleotides, homopolymers as well as mixed-base sequences. Here, we illustrate in detail the process of RNA microarray fabrication, from the experimental design, to instrumental setup, array synthesis, deprotection and final hybridization assay using a template 25mer sequence containing all four bases as an example. In parallel, we go beyond hybridization-based experiments and exploit microarray photolithography as an inexpensive gateway to complex nucleic acid libraries. To do so, high-density DNA microarrays are fabricated on a base-sensitive monomer that allows the DNA to be conveniently cleaved and retrieved after synthesis and deprotection. The fabrication protocol is optimized so as to limit the number of synthetic errors and to that effect, a layer of &#946;-carotene solution is introduced to absorb UV photons that may otherwise reflect back onto the synthesis substrates. We describe in a step-by-step manner the complete process of library preparation, from design to cleavage and quantification.

In this article, we present and discuss new developments in the synthesis and applications of nucleic acid microarrays fabricated in situ. Specifically, we show how the protocols for DNA synthesis can be extended to RNA and how microarrays can be used to create retrievable nucleic acid libraries.

High-Density DNA und RNA Mikroarrays - Photolithographische Synthese, Hybridisierung und Vorbereitung von großen Nukleinsäurebibliotheken

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen durch die Mikroinjektion von Oozyten

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Entwicklungsbiologie

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular methodology for applications in various fields and for different research purposes. The procedure described herein focuses on the synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA 5&#39;-[CUA CGG AAU CAU]-3&#39; containing zero, one, or two modifications located at the C2&#39;-O-position. The probes are based on 2-thiophenylmethyl groups, incorporated into RNA nucleotides via standard organic synthesis and introduced into the corresponding oligonucleotides via their respective phosphoramidites. This report makes use of phosphoramidite chemistry via the four canonical nucleobases (Uridine (U), Cytosine (C), Guanosine (G), Adenosine (A)), as well as 2-thiophenylmethyl functionalized nucleotides modified at the 2&#39;-O-position; however, the methodology is amenable for a large variety of modifications that have been developed over the years. The oligonucleotides were synthesized on a controlled-pore glass (CPG) support followed by cleavage from the resin and deprotection under standard conditions, i.e., a mixture of ammonia and methylamine (AMA) followed by hydrogen fluoride/triethylamine/N-methylpyrrolidinone. The corresponding oligonucleotides were purified via polyacrylamide electrophoresis (20% denaturing) followed by elution, desalting, and isolation via reversed-phase chromatography (Sep-pak, C18-column). Quantification and structural parameters were assessed via ultraviolet-visible (UV-vis) and circular dichroism (CD) photometric analysis, respectively. This report aims to serve as a resource and guide for beginner and expert researchers interested in embarking in this field. It is expected to serve as a work-in-progress as new technologies and methodologies are developed. The description of the methodologies and techniques within this document correspond to a DNA/RNA synthesizer (refurbished and purchased in 2013) that uses phosphoramidite chemistry.

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

This article provides a detailed procedure on the solid-phase synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA modified at the C2&#39;-O-position. UV-vis and circular dichroism photometric analyses are used to quantify and characterize structural aspects, i.e., single-strands or double-strands.

Protokoll für die Festphasensynthese von Oligomeren der RNA mit einem 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -thiophenylmethyl-Modifikation und Charakterisierung über Kreisdichroismus

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

Chemie

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an upstream 3&#39; splice site within a pre-mRNA, a process called back-splicing. This circularization is likely aided by secondary structures in the pre-mRNA that bring the splice sites into close proximity. In human genes, Alu elements are thought to promote these secondary RNA structures, as Alu elements are abundant and exhibit base complementarities with each other when present in opposite directions in the pre-mRNA. Here, we describe the generation and analysis of large, Alu element containing reporter genes that form circular RNAs. Through optimization of cloning protocols, reporter genes with up to 20 kb insert length can be generated. Their analysis in co-transfection experiments allows the identification of regulatory factors. Thus, this method can identify RNA sequences and cellular components involved in circular RNA formation.

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

We clone and analyze reporter genes generating circular RNAs. These reporter genes are larger than constructs to analyze linear splicing and contain Alu elements. To investigate the circular RNAs, the constructs are transfected into cells and resulting RNA is analyzed using RT-PCR after removal of linear RNA.

Verwendung von Alu-Element enthaltenden Minigenes zur Analyse von kreisförmigen RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is applicable to a wide variety of organisms and is highly efficient in the species-rich order Coleoptera (beetles). Here, we summarize the necessary steps for developing this technique in a novel organism and illustrate its application to the different developmental stages of the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus. Target gene sequences can be obtained cost-effectively through the assembly of transcriptomes against a close relative with known genomics or de novo. Candidate gene cloning utilizes a specific cloning vector (the pCR4-TOPO plasmid), which allows the synthesis of double-stranded RNA (dsRNA) for any gene with the use of a single common primer. The synthesized dsRNA can be injected into either embryos for early developmental processes or larvae for later developmental processes. We then illustrate how RNAi can be injected into aquatic larvae using immobilization in agarose. To demonstrate the technique, we provide several examples of RNAi experiments, generating specific knockdowns with predicted phenotypes. Specifically, RNAi for the tanning gene laccase2 leads to cuticle lightening in both larvae and adults, and RNAi for the eye pigmentation gene white produces a lightening/lack of pigmentation in eye tubes. In addition, the knockdown of a key lens protein leads to larvae with optical deficiencies and a reduced ability to hunt prey. Combined, these results exemplify the power of RNAi as a tool for investigating both morphological patterning and behavioral traits in organisms with only transcriptomic databases.

RNA interference is a widely applicable, powerful technique for manipulating gene expression at specific developmental stages. Here, we describe the necessary steps for implementing this technique in the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus, from the acquisition of gene sequences to the knockdown of genes that affect structure or behavior.

RNA-Interferenz in Wasserkäfern als leistungsstarkes Werkzeug zur Manipulation der Genexpression an bestimmten Entwicklungszeitpunkten

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

Umwelt

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Bakterielle künstliche Chromosomen: A Functional Genomics-Werkzeug für das Studium der Positiv-Strang-RNA-Viren

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Immunologie und Infektion

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work demonstrates that concepts from DNA nanotechnology can be used to program the enzymatic activity of the phage-derived T7 RNA polymerase (RNAP) and build scalable synthetic gene regulatory networks. First, an oligonucleotide-tethered T7 RNAP is engineered via expression of an N-terminally SNAP-tagged RNAP and subsequent chemical coupling of the SNAP-tag with a benzylguanine (BG)-modified oligonucleotide. Next, nucleic-acid strand displacement is used to program polymerase transcription on-demand. In addition, auxiliary nucleic acid assemblies can be used as &#34;artificial transcription factors&#34; to regulate the interactions between the DNA-programmed T7 RNAP with its DNA templates. This in vitro transcription regulatory mechanism can implement a variety of circuit behaviors such as digital logic, feedback, cascading, and multiplexing. The composability of this gene regulatory architecture facilitates design abstraction, standardization, and scaling. These features will enable the rapid prototyping of in vitro&#160;genetic devices for applications such as bio-sensing, disease detection, and data storage.

We describe the engineering of a novel DNA-tethered T7 RNA polymerase to regulate in vitro transcription reactions. We discuss the steps for protein synthesis and characterization, validate proof-of-concept transcriptional regulation, and discuss its applications in molecular computing, diagnostics, and molecular information processing.

DNA-Tethered RNA Polymerase für programmierbare In-vitro-Transkription und molekulare Berechnung

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...