Name: generation of rna/dna hybrids in genomic dna by transformation using rna-containing oligonucleotides
Uploaded: 2010-11-24T18:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides at JoVE.com

Bu çalışma, Gürcistan Kanseri Koalisyonu hibe R9028 tarafından desteklenmiştir.

Gerekçe Thermo Scientific Dharmacon oligos, 50 80-mers kullanımı istismar, burada oligos hedef kromozomal DNA tavlama aşağıdaki maya hücreleri genomik DNA genetik bilgi aktarabilirsiniz hangi bir gen düzeltme testi dayalı bir prosedür mevcut. Oligos tarafından hedef Başarılı beklenen fenotip gösteren maya kolonileri görünümünü tarafından atılırsa. Istenilen genetik modifikasyon oligo dizisi dahil bir veya daha fazla ribonucleotides içinde yapılır ise, genetik bilginin RNA yolu böylece kromozom hedef DNA, kromozom seviyesinde hedefleme işlemi sırasında bir RNA / DNA hibrid formları doğrudan akar. Thermo Scientific Dharmacon RNA içeren oligo ribonukleotid / s DNA onarım sentezi yoluyla hedef gen için şablon olarak hizmet edebilir ya da DNA içine gömülü olabilir ve DNA replikasyonu sırasında şablon olarak hizmet vermektedir. Bu deneylerde maya / Saccharomyces cerevisiae / ökaryot model sistemi kullanmak; Ancak, benzer bir yaklaşım, diğer organizmalar veya hücre tipleri de uygulanabilir . Bu video, biz bir hedef maya genomik lokus homoloji ile tasarlanmış bir Thermo Scientific Dharmacon oligo ve hedef gendeki bir mutasyon düzeltmek için ortada bir ribonukleotid içeren. RNA içeren oligo dönüşüm sonra, belirli bir frekansta, oligo RNA yolu kromozomal DNA içine dahil ve DNA replikasyon sırasında DNA sentezi için şablon olarak hizmet olabilir gösterir hedeflenen sitenin düzeltme gözlemliyoruz. RNA yolu içinde taşınan genetik bilgi stably aşağıdaki hücre nesillere aktarılır. Burada Thermo Scientific Dharmacon RNA içeren oligo ve yaklaşım kromozomal DNA aktarılması RNA bilgilerini tespit etmek için maya hücre dönüşüm adımları açıklar. A. RNA içeren Oligo Bu Deney tasarımı kullanılan Maya bir genetik kusur düzeltmek için bir RNA içeren oligo tasarladık S. trp5 lokustaki cerevisiae kromozomal DNA. Protokolünde kullanılan maya suşu, iki baz silinmesi ve bir saçmalık mutasyon (Şekil 1A) ile bir mutant gen trp5 içerir . Böyle bir maya suşu, triptofan auxotrophic mutant ve triptofan olmadan medya koloniler teşkil etmemektedir. TRP5 geninin DNA dizisi Saccharomyces Genom Veritabanı (http://www.yeastgenome.org/) kullanılabilir. Bu protokolde kullanılan Thermo Scientific Dharmacon RNA içeren oligo 2-baz DNA ekleme, silme mutasyon ve trp5 allel (Şekil 1A) anlamsız mutasyon düzeltmek için tasarlanmış bir ribonukleotid düzeltmek için tasarlanmış 65-mer, . Oligo sırası şu şekilde tasarlanmıştır: 5&#39;-AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG-CG-GATCCCACATTCTG-rG-GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT. Bu oligo 200 nM ölçekte Thermo Scientific Dharmacon (Lafayette, CO) tarafından sentezlenir ve desalted, deprotected SAYFA arıtma olmadan kullanılamaz. Maya Dönüşüm RNA içeren Oligo (Storici ark değiştirilmiş, 2007 1) B. Hazırlık <ol><li> Oligo tüpleri dahil olmak üzere bir deney, pipetler, girdap, raflar, deneysel alan ve her şeyi başlamadan önce potansiyel RNaz kontaminasyonu temizlemek için RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile araştırmacı tarafından giyilen eldiven için kullanılacak malzemeler silin. RNaz içermeyen su, kimyasal reaktifler, tüpler ve tüm adımları pipet uçları kullanın. Bu deneyde her adım RNaz arındırılmış olmalıdır. </li><li> Thermo Scientific Dharmacon RNA içeren oligo şirketten 250 pmoles / ul stok solüsyonu RNaz ücretsiz su ve pelet çözmek için gayretle vorteks alınan süspanse edin. -80 ° C saklayınız </li><li> Dönüşüm hemen önce, buz üzerinde RNA içeren oligo Çözülme ve RNaz ücretsiz tüpler RNaz içermeyen su ile 50 pmoles / ml ye tamamlanır. Her dönüşüm RNA içeren oligos 1 nmole gerektirir. </li><li> Oligos ikincil yapıları ortadan kaldırmak için 2 dakika süreyle 100 ° C ısıya blok RNA içeren oligos seçilmiş bir miktar denatüre. </li><li> Denatürasyon sonra hemen buz tüpü yerleştirin. Dönüşüm kadar buz üzerinde tutun. </li><li> Karşılık gelen bir deneyde kontrol olarak DNA sadece oligo kullanılır. Bu oligo -20 ° C den yukarıda açıklandığı gibi, çözülmüş ve RNA içeren oligo olarak dönüşüm için hazırlanmıştır. </li></ol> C. RNA içeren Oligo kullanarak Maya Hücreleri Dönüşüm <ol><li> Trp5 mutant maya hücreleri ile zengin YPD sıvı bir ortamda 5 ml inoküle edin ve 30 ° C gecede (bkz. Malzemeleri) büyümeye. </li><li> 50 ml YPD sıvı ortam içine 1.5 ml gecelik kültür aktarın. </li><li> 4 saat için 30 ° C çalkalayıcı (225 rpm) hücreler inkübe edin. </li><li> Çözüm 1 ve Çözüm 2 imm hazırlayınediately önce RNaz ücretsiz tüpler dönüşüm (Malzeme bakınız). </li><li> 50 ml RNaz ücretsiz tüp ve 2 dakika süreyle 1562 g karşılık gelen 3000 rpm dönüş için hücre kültürü aktarın. Hücre yağış pelet yaklaşık. 0.3 cm 3. </li><li> 50 ml, 2 dakika süreyle 3000 rpm&#39;de RNaz ücretsiz su ve spin ile süpernatant ve yıkama hücreler çıkarın. </li><li> Orta mümkün olduğunca mevcut olabilir kültür ortamı ve RNases kurtulmak için adım 6 5 kez tekrarlayın. </li><li> Çözüm 1 ve 2 dakika süreyle 3000 rpm&#39;de spin 5 ml supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. </li><li> Çözüm 1 250 ul supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. Bu hücre miktarı 7-8 dönüşümler için yeterli. </li><li> Kısım 50 ul RNaz ücretsiz mikrosantrifüj tüpler hücre süspansiyonu, 20 ul RNA içeren oligo çalışma çözümü (1 nmole), ya da sadece DNA-oligo çalışma çözümü (1 nmole), ya da steril su 20 ul 20 ul negatif kontrol için bir oligo. Sonra her bir dönüşüm tepki için 300 ul Çözüm 2 ekleyin. Kendileri gibi taşıyıcı oligos hareket olarak, dönüşüm sürecinin somon sperm DNA eklemenize gerek yoktur. </li><li> Vortex şiddetle homojen karıştırın. </li><li> 30 ° C de 30 dakika bir çalkalayıcı dönüşüm reaksiyonları inkübe edin. </li><li> Isı şoku 42 ° C de 15 dk. </li><li> 4 dakika süreyle 2236 g, 5000 rpm devir hızına karşılık gelen hücreler aşağı spin. </li><li> 100 ul steril su supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. </li><li> Bu hücre süspansiyonu bir kısım alın ve 100.000 kat ve yaklaşık kullanarak bir YPD plaka plaka hücreleri tarafından steril su ile seyreltilmiş. 30 - 15 steril cam boncuk ve inkübe ° C 2 gün boyunca. </li><li> Plaka yeniden süspanse hücrelerin her biri yaklaşık kullanarak triptofan (SC-Trp) olmadan sentetik tam katı besiyeri Petri kabı dönüşüm reaksiyonu. 30 - 15 steril cam boncuk ve inkübe ° C 4-5 gün (Şekil 2). </li></ol> RNA içeren Oligo D. Gen Düzeltme Analizi <ol><li> RNA içeren oligo için gen düzeltme frekansı hesaplamak için seçici besiyeri (Şekil 2) yanı sıra YPD orta yetiştirilen kolonileri, DNA tek oligo ve hayır-oligo kontrol sayısını. Elde edilen sayı karşılaştırın. Spontan reversion oranı iki-baz silme ve anlamsız mutasyon trp5 allellerin kullanılan maya suşu 10-9 daha azdır, dolayısıyla biz hiçbir oligos hücreleri eklenir seçici orta koloniler oluşturulmasını bekliyoruz. </li><li> Birkaç dışarı Streak rastgele tek koloni izolatları elde etmek için orta YPD üzerine transformant koloniler aldı. Koloni büyümesi için iki gün bekleyin, sonra birkaç (en az 5) tek koloniler ve YPD ve seçici orta yamalar yapmak. </li><li> Koloni PCR (Şekil 1B) RNA içeren oligo tarafından hedef bölge (250-1,000 bp) yükseltmek için bir çift astar tasarlayın. (Storici ve Resnick değiştirilmiş, 2006 2) aşağıdaki gibi koloni PCR prosedürü. <ol><li> Süspanse edin hücreleri (yaklaşık 1 mm3) su 50 ul bireysel yamaları alınan ve 1 adet lyticase ekleyin. 100 ısı blok inkübasyonu takiben 10 dakika, ° C çözüm hücreler ve bırakın genomik DNA kırmak için 5 dakika oda sıcaklığında inkübe </li><li> PCR koşulları: PCR reaksiyon hücre tabanda çözüm ul içeren 10, 50 pmoles ileri ve geri primerler, 10 mM dNTP, Taq polimeraz 1 birim, 10x tampon ve 5 ul 1 ul steril su ile ayarlanır. 50 ul son hacim. 30 devir 95 30 s, 30 s: 55 ° C ° C ve 1 dakika 72 ° C;; son uzatma süresi 7 dakika 72 ° C, daha sonra örnekleri PCR programı 95 ° C&#39;de 3 dakika 4 tutulur ° C Bu tepkime için bir uzatma süresi 1 dakika kb / varsayılır. </li><li> PCR ardından, örnekler PCR ürünü gözlem için% 1 veya% 2 (PCR ürünü beklenen boyutuna göre) agaroz jel (Şekil 3) üzerinde çalışmaktadır. </li></ol></li><li> RNA içeren oligo tarafından aktarılan genetik bilgi maya genomik hedef bölgede yeni bir kısıtlama sitesi (Şekil 1B) oluşturuyorsa, bu, uygun bir restriksiyon enzimi ile PCR ürününün sindirerek doğru bilgi transferi doğrulamak mümkün. RNA içeren oligo tarafından üretilen herhangi bir sınırlama sitesi ise, 6. adıma gidin. Digest belirli bir restriksiyon enzimi kullanılarak PCR ürünleri. Sindirim reaksiyonu restriksiyon enzimi ul PCR ürün, tampon, BSA (bazı enzimler için kullanılan enzim için talimat gerekli olmayabilir), 0.5 ul, 6 ve 15 ul steril su içerir. Numuneler kullanılan enzim için spesifik sıcaklığında 1 saat inkübe edilir. </li><li> Genetik modifikasyon gözlemlemek için% 2 agaroz jel aynı satırda sindirilir örnekleri ile birlikte sindirilmemiş bir örneği çalıştırmak b transferRNA içeren oligo y RNA yolu (Şekil 3). </li><li> PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünleri arındırmak ve DNA dizi analizi için onları hazırlamak. Ürün yükseltmek için kullanılan aynı primerler ile sıralama için örnekler gönderin. </li><li> Seçilen bir referans dizisi (Şekil 4) ile birden fazla dizilerinin uyum sağlayan bir yazılım kullanarak DNA dizi analizi sonuçları analiz edin. </li></ol> E. RNA içeren oligo Alkali Arıtma (Şekil 5) <ol><li> Her reaksiyon için RNA içeren oligo veya DNA-oligo 1 nmole (250 pmoles / ml stok solüsyonu 4 ul), 1.5 ml tüp içine ekleyin. </li><li> Hidroliz 1 M NaOH 4 ul ekleyin ya da alternatif olarak negatif kontrol olarak 1 saat 4 ul H 2 O ekleyin ve bir su banyosunda 65 ° C&#39;de inkübe Daha sonra su banyosunda buz hareket ettirin. </li><li> 2 ul 1.2 M HCl, H 2 O 1 M Tris-HCl ve 4 ul ul 4, ya da alternatif olarak H 2 O 6 ul ve negatif kontrol için 1 M Tris-HCl 4 ul ile nötralize edin. Dönüşüm kadar buz üzerinde tutun. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Kusurlu trp5 gen ve RNA içeren oligo düzeltilebilir TRP5 allel şematik diyagramı.) Trp5 mutant gen 2-baz silinmesi (siyah üçgen) ve 1-baz saçmalık mutasyon (yıldız) içerir. Tek iplikli RNA içeren 2-baz ekleme (mavi döngü) ve bir Van91 I restriksiyon enzimi sitesi (braket gösterilen) üreten 1-RNA baz ikame (kırmızı dikdörtgen) oligo genetik kusurları düzeltmek için maya hücreleri dönüştü. trp5 gen. B) TRP5 genin RNA içeren oligo (düzeltilmiş üsleri mavi dikdörtgenler olarak belirtilmiştir) tarafından onarıldıktan sonra, Van91 I site TRP5 gen oluşturulur. TRP5 gen sadece bir Van91 I restriksiyon sitesi de dahil olmak üzere 278 bp parçası PCR primerleri bir çift (P1 ve P2) tarafından yükseltilir. Van91 P1 ve P2 PCR ürününün sindirim sonra oluşturulan 177 bp ve 101 bp parça de gösterilir. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. RNA içeren oligo Dönüşüm sonucudur.) Maya hücreleri hiçbir oligo ile dönüştürülmüş SC-Trp ortamda herhangi bir koloni oluşturmak yok, plakaları ab bakın. B) Tabaklar cg show maya kolonileri SC-Trp büyüyen hücreleri sonra RNA içeren oligo 1 nmole dönüşür. C) Tabaklar hl show maya kolonileri SC-Trp büyüyen hücreleri sonra 1 nmole ile ilgili DNA tek kontrol oligo dönüşür. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Genetik bilgi aktarımı Algılama RNA içeren hedeflenen genomik bölge P1 ve P2 ile amplifiye Van91 I restriksiyon enzimi ile sindirilir PCR örneklerinin% 2 agaroz jel elektroforezi yükseltme PCR ürün sınırlama sindirim maya kromozomal DNA oligo. Lanes 1, 8 ve 15, 100 boyutları, 200, 300, 400 ve 500 bp DNA merdivenin sol tarafta belirtilen şeritli 2, PCR trp5 mutant suşunun genomik DNA amplifiye trp5 lokus ürünü; 3 şeritli, PCR şeritli 9 14 ürün sadece DNA-oligo tarafından hedeflenen bir Trp + koloni elde edilen genomik DNA amplifiye; Van91 I sınırlama sindirim şeritli 4-7, PCR ürünleri elde edilen genomik DNA, RNA içeren oligo tarafından hedef Trp + koloniler amplifiye 2 ila 7 şerit PCR ürünleri. 10 ila 14 şerit kesilmemiş PCR ürün gruplarından varlığı TRP5 lokus (CCACATTCTGG) Van91 Ben kısmi sindirimi ile açıklanabilir. Van91 (CCANNNN NTGG) için kesme sitenin birden çok dizileri göz önüne alındığında, TRP5 oluşturulan site enzim için en uygun hedef olmayabilir. Aslında, yukarıdaki tüm PCR ürünleri sıralama aşağıdaki DNA (bkz. Şekil 4) oligos tarafından yapılan dışında herhangi bir ek değişiklikleri algılamak. Van91 P1 ve P2 astar ve sindirim ürün grupları ile amplifiye 278 bp PCR bant, 177 bp ve 101 bp sağdaki oklarla gösterilmiştir . <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig4tmb.jpg" border="0" alt="Şekil 4Thumb" /> Şekil 4. RNA içeren oligo gen düzeltme gösteren DNA dizi analizi sonuçları. Genomik bölge A) DNA Elektroferogram RNA içeren oligo tarafından hedef. DNA dizisi (kutulu mavi) G RNA içeren oligo rG türemiştir. Ayrıca kutulu CG üslerinin yerleştirilmesi. Diğer tüm PCR ürünleri sonuçlar Sıralama floresan sinyalleri ile arka plan üzerinde, aynı zamanda bu kadar net. B) Trp + transfo TRP5 bölge DizilerDNA sadece oligo (T1) ve RNA içeren oligo (T2-T5), üstünde fikir birliği sırayla maç ve hedef rmants (Genomik DNA, kırmızı oligos göre hedefleme önce trp5 mutant hücreler ile karşılaştırıldığında gölgeli). Onarım RNA içeren alt oligo iki temel DNA ekleme ve tek-baz (G) kırmızı ile işaretlenmiş RNA ikame vardır. Sarı gölge gösterisi ile mavi kutulu bölgelerde RNA içeren DNA sadece oligo oligo olarak sıra tam silme mutasyon ve tüm test örnekleri anlamsız mutasyon düzeltildi. Kesik çizgiler RNA içeren oligo dizisi konumu işaretleyin. Lütfen Şekil 4 büyük halini görmek için <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/2152/2152fig4.jpg">buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5. Alkali tedavi RNA içeren oligo gen düzeltme önler. RNA içeren oligo (R) dönüşümü frekans, kırmızı çubuğunda ve mavi çubuk sadece DNA-oligo (D) gösterilir gösterilir . Hata çubukları her oligo için 3 bağımsız dönüşümler için ortalama standart hata temsil eder. DNA sadece oligo NaOH tedavi ile benzer frekans dönüşüm olmadan ve görüntüler. Farklı NaOH ile 0 tedavisi sonrasında, RNA içeren oligo dönüşüm frekans düşer. Bu nedenle, RNA içeren oligo hazırlık DNA sadece oligo ile kontamine değildir, bu nedenle, gözlenen dönüşüm frekans RNA içeren oligo özel.

<ol>
	<li>Storici, F., Bebenek, K., Kunkel, T. A., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-templated+DNA+repair.">RNA-templated DNA repair.</a> Nature. 447, 338-3341 (2007).</li><li>Storici, F., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delitto+perfetto+approach+to+in+vivo+site-directed+mutagenesis+and+chromosome+rearrangements+with+synthetic+oligonucleotides+in+yeast.">The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast.</a> Methods Enzymol. 409, 329-345 (2006).</li><li>Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-mediated+DNA+modifications+and+RNA-templated+DNA+repair.">RNA-mediated DNA modifications and RNA-templated DNA repair.</a> Curr Opin Mol Ther. 10, 224-230 (2008).</li><li>Cerritelli, S. M., Crouch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonuclease+H:+the+enzymes+in+eukaryotes.">Ribonuclease H: the enzymes in eukaryotes.</a> FEBS J. 276, 1494-1505 (2009).</li></ol>

Bu yazı için video üretimi, bu yayında kullanılan reaktifler ve alet üreten Thermo Fisher Scientific sponsor oldu.

RNA hücrelerde genomik DNA genetik bilgi aktarımı olabilir aslında sentetik RNA içeren oligos (Dharmacon sentezlenmiş oligos) 1 istismar keşfedildi. Bu, hücrelerin DNA sentezi için şablonlar olarak RNA içeren moleküllerin ya da sadece RNA dizileri kullanabileceğiniz ilke kanıtı oldu. RNA içeren, sadece genetik bilginin RNA, genomik DNA ters transkripsiyonu DNA kopyalama ara gerek kalmadan doğrudan transfer edilebilir gösteriye yol açmadığı oligos değil, aynı zamanda RNA&#39;nın homolog şablon olarak kullanılabilir olması kanıtı DNA hasarı 1,3 tamiri. Oligos biz burada sunulan örnekte olduğu gibi, RNA sadece yapılan veya bir DNA dizisi gömülü sadece tek bir ribonukleotid içeren olabilir. RNA içeren oligo genomik kusurlu trp5 allel anlamsız mutasyon düzeltmek için tasarlanmış bir gömülü ribonukleotid vardır. Ribonukleotid genomik DNA genetik bilgi transferi hedeflenen hücrelerin fenotipi (hücre triptofan eksik orta büyüyen) bir değişiklik ortaya çıkar. RNA içeren oligo ile elde edilen gen düzeltme frekansı ölçülür ve kontrol DNA sadece oligo ile karşılaştırıldığında. Çeşitli maya genler mutasyona farklı hücre arka plan, bu gen düzeltme tahlil yaparak, biz faktörü / s özellikle RNA içeren oligos tarafından hedef etkileyecek şekilde algılayabilir. Böylece, hücrelerin RNA / DNA hibritleri istikrar nasıl düzenleyen mekanizmalar ortaya çıkarabilir. Bir sadece RNA içeren oligos farklı türevlerini tasarımı DNA modifikasyonu şablon olarak hizmet etmek, belirli bir RNA sistem için olasılığını belirleyebilirsiniz ve DNA içine gömülü özel RNA dizilerinin istikrar belirleyebilirsiniz. Ayrıca, tercih edilen in vivo yüzeylerde RNA / DNA hibritleri ile etkileşen faktörler nelerdir tanımlayabilirsiniz. Ağırlıklı olarak kısa kullanılarak, in vitro çalışmalarda çeşitli RNA içeren oligos RNases H in vivo fonksiyonları yanı sıra, RNaz H enzimler 4, DNA ile bir melez RNA tanıyabilir faktörlerin fonksiyonu karakterize etmek için yapılmış olsa da RNA / DNA hibrid istikrarı çoğunlukla bilinmemektedir etkileyebilecek diğer proteinlerin kimlik olarak. Yararlanma imkanı RNA içeren önemli bir uzunluğu (50-80-mers) ve en iyi kalite oligos (Thermo Scientific Dharmacon RNA içeren oligos gibi) doğrudan in vivo moleküler süreçleri geniş bir yelpazede incelenmesi yolu açık ilgi hücreleri. Olarak kullanarak, bu video, dönüşüm gösterilen RNA içeren oligos aslında RNases tarafından bozulmasını önlemek için, DNA molekülleri kullanarak dönüşümü ile karşılaştırıldığında sadece birkaç ek adımlar gerektirir. Bu nedenle, RNA içeren oligos maya sistemi ile sınırlı değil. Kullanarak dönüşümü DNA oligos dönüşüm yetkin herhangi bir organizma ya da hücre tipi uygulanabilir. Sonuç olarak, hücrelerini hedef RNA içeren oligos hücrelerinin in vivo DNA gömülü ve RNA / DNA hibritler ve ribonucleotides oluşturmak için fırsat sağlar . In vivo olarak istikrar, fonksiyon ve bunların sonuçlarını RNA üretilir / DNA hibritleri potansiyel olarak bilinmeyen DNA onarım mekanizmaları açığa çıkarmak ve hedef gen için yeni stratejiler ortaya koymak, analiz ve karakterize edilebilir .

A. Dönüşüm reaktifleri ve medya (Storici ve Resnick değiştirilmiş, 2006 <ol><li> YPD (Maya Peptonlu Dekstroz): 1 litre için 10 g maya özü, 20 g soya pepton, 20 g dekstroz. YPD katı ortam yapmak için 15 g agar ekleyin. Kullanmadan önce Otoklav. Oda sıcaklığında saklayın. </li><li> Çözüm 1: 0.1 M lityum asetat. Dönüşüm hemen önce hazırlayın. Çözüm 1 çalışan bir çözümdür, böylece toz doğrudan hazırlanır. Hisse senedi bir çözüm oldu. Oda sıcaklığında tutun. LiAc DNA maya hücre duvarının geçirgenliği artar. </li><li> Çözüm 2: lityum asetat 0.1 M ve% 50 polietilen glikol 4000. Ayrıca çözüm 2 çalışan bir çözümdür ve doğrudan tozundan yapılır. Stok solüsyonu hazırlanır. Oda sıcaklığında tutun. PEG mevduat maya hücreleri üzerine oligos. </li><li> RNA içeren oligos (Thermo Scientific Dharmacon), 50-80-mers, desalted deprotected ve non-saflaştırılmış. 250 pmoles / ml süspanse edin. -80 ° C saklayınız </li><li> Desalted ve non-saflaştırılmış DNA sadece oligos, 50-80-mers,. 50 pmoles / ml süspanse edin. -20 ° C&#39;de muhafaza </li><li> SC-Trp (Sentetik eksiksiz bir medya eksik triptofan) katı ortam. </li><li> Otoklav ile sterilize 0.5 cm çapında cam boncuklar. </li><li> RNaz-off: RNaz dekontaminasyon çözüm. </li><li> DNaz / RNaz içermeyen, steril santrifüj tüplerine. </li><li> DNaz / RNaz içermeyen, steril konik tüpler. </li><li> ZAP ile DNaz / RNaz içermeyen, steril aerosol pipet uçları: 1-200 ml, 100-1000 ml. </li></ol> B. Colony PCR malzemeleri. <ol><li> Desalted ve non-saflaştırılmış DNA primerleri. 50 pmoles / ml steril su içinde eritin. -20 ° C&#39;de muhafaza </li><li> Taq DNA polimeraz, tampon, dNTP. </li><li> PCR tüpleri. </li></ol> C. PCR saflaştırma. <ol><li> PCR saflaştırma kiti. </li></ol> D. Jel Elektroforez. <ol><li> Agaroz. </li><li> 1 x TBE tamponu (45 mM Tris-borat ve 1 mM etilendiamin tetraacetate) 10x TBE seyreltilir. </li><li> Prestained moleküler ağırlık belirteci. </li><li> DNA yükleme boya. </li></ol> E. Kısıtlama sindirim. <ol><li> Kısıtlama enzimler, 10x tamponlar, BSA. </li></ol> F. RNA içeren oligo Alkali tedavi. <ol><li> 1 M NaOH çözeltisi. </li><li> 1.2 M HCl çözeltisi. </li><li> 1 M Tris-HCl, pH 7.4 çözüm. </li></ol>

generation of rna/dna hybrids in genomic dna by transformation using rna-containing oligonucleotides

Sentetik kısa nükleik asit polimerleri, oligonükleotidler (oligos), moleküler biyolojinin en işlevsel ve en yaygın araçları. Oligos istenen herhangi bir DNA veya RNA dizisi içeren imal edilebilir ve geniş bir taban ve şeker değişiklikler içerecek şekilde hazırlanmış olabilir. Ayrıca, oligos spesifik nükleik asit değişiklik taklit etmek ve böylece, DNA hasarı ve onarım mekanizmalarının etkilerini araştırmak için önemli bir araç olarak hizmet edebilir dizayn edilebilir. Olduğunu saptadık Thermo Scientific Dharmacon RNA içeren 50 ve 80 nükleotidler arasında uzunluğa sahip oligos in vivo, işlevleri ve kromozomal RNA / DNA hibritleri sonuçları ve DNA içine gömülü ribonucleotides, çalışma için uygun olabilir. RNA / DNA hibritleri kolayca hücreleri ve bu melez hücrelerin genetik bütünlüğü ne ölçüde etkileyebilir RNA / DNA hibritleri istikrarı hakkında çok az bilinmektedir, ancak, DNA replikasyonu, onarımı ve transkripsiyon sırasında oluşabilir. Bu nedenle, RNA içeren oligos, kromozomal DNA ribonucleotides tanıtmak ve RNA / DNA hibritleri seçilen uzunluğu ve taban kompozisyon oluşturmak için mükemmel bir vektör temsil eder. Burada, ökaryotik model sistem maya / Saccharomyces cerevisiae / genom içine ribonucleotides eklenmesi için protokol sunuyoruz . Ancak, laboratuvar kullanılan Thermo Scientific Dharmacon RNA içeren oligos bakterilerin insan hücreleri, farklı hücre sistemlerinde kromozomal düzeyde RNA / DNA hibritleri oluşturmak için.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides at JoVE.com

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Bu çalışma kromozomal düzeyde bir RNA / DNA hibrid formu ve maya hücreleri genomik DNA, RNA genetik bilginin transferi ortaya nasıl gösterir.

RNA içeren Oligonükleotidler kullanarak Dönüşüm Genomik DNA, RNA / DNA Hibritlerin Üretimi

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

generation-rnadna-hybrids-genomic-dna-transformation-using-rna

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

26.8K Görüntüleme.  Georgia Institute of Technology. Bu çalışma kromozomal düzeyde bir RNA / DNA hibrid formu ve maya hücreleri genomik DNA, RNA genetik bilginin transferi ortaya nasıl gösterir.

Video: Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Genetik

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA (siRNA) in gene silencing1, RNAi has become a powerful research tool in gene function studies. Compared to genetic deletion, RNAi-mediated gene silencing possesses many advantages, such as the ease with which it is carried out and its suitability to most cell lines. Multiple studies have demonstrated the applications of RNAi technology in cancer research. In particular, the development of the DNA vector-based technology to produce small hairpin RNA (shRNA) driven by the U6 or H1 promoter has made long term and inducible gene silencing possible2,3. Its use in combination with genetically engineered viral vectors, such as lentivirus, facilitates high efficiencies of shRNA delivery and/or integration into genomic DNA for stable shRNA expression. 
We describe a detailed procedure using the DNA vector-based RNAi technology to determine gene function, including construction of lentiviral vectors expressing shRNA, lentivirus production and cell infection, and functional studies using a mouse xenograft model. 
Various strategies have been reported in generating shRNA constructs. The protocol described here employing PCR amplification and a 3-fragment ligation can be used to directly and efficiently generate shRNA-containing lentiviral constructs without leaving any extra nucleotide adjacent to a shRNA coding sequence. Since the shRNA-expression cassettes created by this strategy can be cut out by restriction enzymes, they can be easily moved to other vectors with different fluorescent or antibiotic markers. Most commercial transfection reagents can be used in lentivirus production. However, in this report, we provide an economic method using calcium phosphate precipitation that can achieve over 90% transfection efficiency in 293T cells. Compared to constitutive shRNA expression vectors, an inducible shRNA system is particularly suitable to knocking down a gene essential to cell proliferation. We demonstrate the gene silencing of Yin Yang 1 (YY1), a potential oncogene in breast cancer4,5, by a Tet-On inducible shRNA system and its effects on tumor formation. Research using lentivirus requires review and approval of a biosafety protocol by the Biosafety Committee of a researcher's institution. Research using animal models requires review and approval of an animal protocol by the Animal Care and Use Committee (ACUC) of a researcher's institution.

RNA interference (RNAi) possesses many advantages over gene knockout and has been broadly used as a tool in gene functional studies. The invention of DNA vector-based RNAi technology has made long term and inducible gene knockdown possible, and also increased the feasibility of gene silencing in vivo.

Kanser gen Fonksiyon Eğitim için DNA vektör tabanlı RNA Girişim

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

Tıp

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial purification of biologically important RNA/protein complexes. However, this strategy suffers from one major disadvantage that limits its broader utilization: the biotin/streptavidin interaction can be broken only under denaturing conditions that also disrupt the integrity of the eluted complexes, hence precluding their subsequent functional analysis and/or further purification by other methods. In addition, the eluted samples are frequently contaminated with the background proteins that nonspecifically associate with streptavidin beads, complicating the analysis of the purified complexes by silver staining and mass spectrometry. To overcome these limitations, we developed a variant of the biotin/streptavidin strategy in which biotin is attached to an RNA substrate via a photo-cleavable linker and the complexes immobilized on streptavidin beads are selectively eluted to solution in a native form by long wave UV, leaving the background proteins on the beads. Shorter RNA binding substrates can be synthesized chemically with biotin and the photo-cleavable linker covalently attached to the 5&#39; end of the RNA, whereas longer RNA substrates can be provided with the two groups by a complementary oligonucleotide. These two variants of the UV-elution method were tested for purification of the U7 snRNP-dependent processing complexes that cleave histone pre-mRNAs at the 3&#39; end and they both proved to compare favorably to other previously developed purification methods. The UV-eluted samples contained readily detectable amounts of the U7 snRNP that was free of major protein contaminants and suitable for direct analysis by mass spectrometry and functional assays. The described method can be readily adapted for purification of other RNA binding complexes and used in conjunction with single- and double-stranded DNA binding sites to purify DNA-specific proteins and macromolecular complexes.

RNA/protein complexes purified using botin-streptavidin strategy are eluted to solution under denaturing conditions in a form unsuitable for further purification and functional analysis. Here, we describe a modification of this strategy that utilizes a photo-cleavable linker in RNA and a gentle UV-elution step, yielding native and fully functional RNA/protein complexes.

Tek adım arıtma RNA bağlı Biotin ve fotoğraf yarilabilir bir bağlayıcı kullanarak makromoleküllerin kompleksleri

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Biyokimya

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite coupling reactions with the precision and density of UV light reflected from micrometer-sized mirrors. Photolithography yields microarrays that can accommodate from hundreds of thousands up to several million different DNA sequences, 100-nt or longer, in only a few hours. With this very large sequence space, microarrays are ideal platforms for exploring the mechanisms of nucleic acid&#183;ligand interactions, which are particularly relevant in the case of RNA. We recently reported on the preparation of a new set of RNA phosphoramidites compatible with in situ photolithography and which were subsequently used to grow RNA oligonucleotides, homopolymers as well as mixed-base sequences. Here, we illustrate in detail the process of RNA microarray fabrication, from the experimental design, to instrumental setup, array synthesis, deprotection and final hybridization assay using a template 25mer sequence containing all four bases as an example. In parallel, we go beyond hybridization-based experiments and exploit microarray photolithography as an inexpensive gateway to complex nucleic acid libraries. To do so, high-density DNA microarrays are fabricated on a base-sensitive monomer that allows the DNA to be conveniently cleaved and retrieved after synthesis and deprotection. The fabrication protocol is optimized so as to limit the number of synthetic errors and to that effect, a layer of &#946;-carotene solution is introduced to absorb UV photons that may otherwise reflect back onto the synthesis substrates. We describe in a step-by-step manner the complete process of library preparation, from design to cleavage and quantification.

In this article, we present and discuss new developments in the synthesis and applications of nucleic acid microarrays fabricated in situ. Specifically, we show how the protocols for DNA synthesis can be extended to RNA and how microarrays can be used to create retrievable nucleic acid libraries.

Yüksek Yoğunluklu DNA ve RNA mikrodizileri - Fotolitografik Sentez, Hibridizasyon ve Büyük Nükleik Asit Kütüphanelerinin Hazırlanması

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

Oositlerin Mikroenjeksiyonu ile Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Üretilmesi

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Gelişim Biyolojisi

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular methodology for applications in various fields and for different research purposes. The procedure described herein focuses on the synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA 5&#39;-[CUA CGG AAU CAU]-3&#39; containing zero, one, or two modifications located at the C2&#39;-O-position. The probes are based on 2-thiophenylmethyl groups, incorporated into RNA nucleotides via standard organic synthesis and introduced into the corresponding oligonucleotides via their respective phosphoramidites. This report makes use of phosphoramidite chemistry via the four canonical nucleobases (Uridine (U), Cytosine (C), Guanosine (G), Adenosine (A)), as well as 2-thiophenylmethyl functionalized nucleotides modified at the 2&#39;-O-position; however, the methodology is amenable for a large variety of modifications that have been developed over the years. The oligonucleotides were synthesized on a controlled-pore glass (CPG) support followed by cleavage from the resin and deprotection under standard conditions, i.e., a mixture of ammonia and methylamine (AMA) followed by hydrogen fluoride/triethylamine/N-methylpyrrolidinone. The corresponding oligonucleotides were purified via polyacrylamide electrophoresis (20% denaturing) followed by elution, desalting, and isolation via reversed-phase chromatography (Sep-pak, C18-column). Quantification and structural parameters were assessed via ultraviolet-visible (UV-vis) and circular dichroism (CD) photometric analysis, respectively. This report aims to serve as a resource and guide for beginner and expert researchers interested in embarking in this field. It is expected to serve as a work-in-progress as new technologies and methodologies are developed. The description of the methodologies and techniques within this document correspond to a DNA/RNA synthesizer (refurbished and purchased in 2013) that uses phosphoramidite chemistry.

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

This article provides a detailed procedure on the solid-phase synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA modified at the C2&#39;-O-position. UV-vis and circular dichroism photometric analyses are used to quantify and characterize structural aspects, i.e., single-strands or double-strands.

Bir 2&#39;-amino asit içeren RNA Oligomerlerinin Katı Faz Sentezi Protokolü<em&gt; Ç</em&gt; Tiyofenilmetil Değiştirme ve Sirküler Dikroizm ile Karakterizasyonlar

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

Kimya

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an upstream 3&#39; splice site within a pre-mRNA, a process called back-splicing. This circularization is likely aided by secondary structures in the pre-mRNA that bring the splice sites into close proximity. In human genes, Alu elements are thought to promote these secondary RNA structures, as Alu elements are abundant and exhibit base complementarities with each other when present in opposite directions in the pre-mRNA. Here, we describe the generation and analysis of large, Alu element containing reporter genes that form circular RNAs. Through optimization of cloning protocols, reporter genes with up to 20 kb insert length can be generated. Their analysis in co-transfection experiments allows the identification of regulatory factors. Thus, this method can identify RNA sequences and cellular components involved in circular RNA formation.

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

We clone and analyze reporter genes generating circular RNAs. These reporter genes are larger than constructs to analyze linear splicing and contain Alu elements. To investigate the circular RNAs, the constructs are transfected into cells and resulting RNA is analyzed using RT-PCR after removal of linear RNA.

Dairesel RNA'ları Analiz Etmek Için Minigen İçeren Alu Elementin Kullanımı

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is applicable to a wide variety of organisms and is highly efficient in the species-rich order Coleoptera (beetles). Here, we summarize the necessary steps for developing this technique in a novel organism and illustrate its application to the different developmental stages of the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus. Target gene sequences can be obtained cost-effectively through the assembly of transcriptomes against a close relative with known genomics or de novo. Candidate gene cloning utilizes a specific cloning vector (the pCR4-TOPO plasmid), which allows the synthesis of double-stranded RNA (dsRNA) for any gene with the use of a single common primer. The synthesized dsRNA can be injected into either embryos for early developmental processes or larvae for later developmental processes. We then illustrate how RNAi can be injected into aquatic larvae using immobilization in agarose. To demonstrate the technique, we provide several examples of RNAi experiments, generating specific knockdowns with predicted phenotypes. Specifically, RNAi for the tanning gene laccase2 leads to cuticle lightening in both larvae and adults, and RNAi for the eye pigmentation gene white produces a lightening/lack of pigmentation in eye tubes. In addition, the knockdown of a key lens protein leads to larvae with optical deficiencies and a reduced ability to hunt prey. Combined, these results exemplify the power of RNAi as a tool for investigating both morphological patterning and behavioral traits in organisms with only transcriptomic databases.

RNA interference is a widely applicable, powerful technique for manipulating gene expression at specific developmental stages. Here, we describe the necessary steps for implementing this technique in the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus, from the acquisition of gene sequences to the knockdown of genes that affect structure or behavior.

Belirli Gelişimsel Zaman Noktalarında Gen İfadesi Manipüle Etmek Için Güçlü Bir Araç Olarak Su Böcekleri RNA Girişim

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

Çevre

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work demonstrates that concepts from DNA nanotechnology can be used to program the enzymatic activity of the phage-derived T7 RNA polymerase (RNAP) and build scalable synthetic gene regulatory networks. First, an oligonucleotide-tethered T7 RNAP is engineered via expression of an N-terminally SNAP-tagged RNAP and subsequent chemical coupling of the SNAP-tag with a benzylguanine (BG)-modified oligonucleotide. Next, nucleic-acid strand displacement is used to program polymerase transcription on-demand. In addition, auxiliary nucleic acid assemblies can be used as &#34;artificial transcription factors&#34; to regulate the interactions between the DNA-programmed T7 RNAP with its DNA templates. This in vitro transcription regulatory mechanism can implement a variety of circuit behaviors such as digital logic, feedback, cascading, and multiplexing. The composability of this gene regulatory architecture facilitates design abstraction, standardization, and scaling. These features will enable the rapid prototyping of in vitro&#160;genetic devices for applications such as bio-sensing, disease detection, and data storage.

We describe the engineering of a novel DNA-tethered T7 RNA polymerase to regulate in vitro transcription reactions. We discuss the steps for protein synthesis and characterization, validate proof-of-concept transcriptional regulation, and discuss its applications in molecular computing, diagnostics, and molecular information processing.

Programlanabilir In vitro Transkripsiyon ve Moleküler Hesaplama için DNA-Bağlı RNA Polimeraz

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...