Estabelecimento de um modelo robusto e reprodutível de fibrose cutânea e muscular induzida por radiação

Aqui apresentamos um protocolo para induzir fibrose cutânea induzida por radiação no membro posterior de camundongos e realizar medições pós-irradiação de comprometimento crônico por meio de análises de excursão de membros e índice de marcha para avaliar o resultado funcional. O modelo elucida os mecanismos de fibrose cutânea relacionados à radiação e é útil em estudos terapêuticos subclínicos.

A fibrose cutânea induzida por radiação (RISF) pode resultar de uma infinidade de cenários, incluindo terapia contra o câncer, exposição acidental ou atos de terrorismo. Os feixes radioativos podem penetrar na pele e afetar as estruturas em seu caminho, incluindo pele, músculos e órgãos internos. A pele é a primeira estrutura a ser exposta à radiação e é suscetível a desenvolver fibrose crônica, que é difícil de tratar. Atualmente, as opções limitadas de tratamento mostram eficácia moderada na mitigação da fibrose cutânea relacionada à radiação. Um fator-chave que dificulta o desenvolvimento de contramedidas eficazes é a ausência de um modelo conveniente e robusto que possa permitir a tradução dos resultados experimentais para humanos. Aqui, um modelo robusto e reprodutível de fibrose cutânea murina de membros posteriores foi estabelecido para avaliação profilática e terapêutica de possíveis agentes para recuperação funcional e molecular.

O membro posterior direito foi irradiado com dose única de 40 (Gray) Gy para induzir fibrose cutânea. Os indivíduos desenvolveram edema e dermatite nos estágios iniciais, seguidos por constrição visível da pele. Os membros irradiados mostraram uma amplitude de movimento significativamente reduzida nas semanas seguintes. Nos estágios tardios, os efeitos colaterais agudos diminuíram, mas a fibrose crônica persistiu. Um índice de marcha foi realizado como um ensaio funcional adicional, que demonstrou o desenvolvimento de comprometimento funcional. Esses métodos não invasivos demonstraram medidas confiáveis para rastrear a progressão da fibrose, o que é apoiado por análises histológicas. As análises de dose de radiação, aplicação e pós-irradiação empregadas neste modelo oferecem um método vigoroso e reprodutível para estudar a fibrose cutânea induzida por radiação e testar a eficácia de agentes terapêuticos.

A pele é o maior órgão do corpo, cobrindo e protegendo o corpo dos perigos. Possui três camadas distintas: epiderme, derme e hipoderme. Cada camada tem suas funções únicas: a epiderme evita a desidratação e a invasão microbiana; a derme possui uma rica rede de células e uma matriz extracelular que fornece resistência à tração e elasticidade¹; A camada dérmica contém os receptores sensoriais, folículos pilosos, glândulas e vasos para redes linfáticas e capilares. A hipoderme ou tecido subcutâneo, com sua abundância de tecido adiposo, contorna o corpo e distribui o estresse mecânico ^2,3,4.

A radiação, gerada como resultado de acidentes, guerras, terrorismo ou aplicações terapêuticas, penetra no corpo de forma linear progressiva, levando a pele a ser o primeiro órgão a entrar em contato. A ameaça de tais incidentes se intensificou devido ao aumento do uso de materiais radioativos em indústrias, instalações médicas e instalações militares⁵. Clinicamente, o dano causado pela radiação na pele é caracterizado pela síndrome da radiação cutânea (RSC), uma das quatro subsíndromes da síndrome aguda da radiação (SRA). A resposta da pele à radiação ionizante tem implicações importantes para o tratamento e proteção contra danos adicionais⁶. Lesões concomitantes, como queimaduras e traumas, complicam ainda mais o desfecho clínico quando combinadas com lesões por radiação⁷. A extensão da exposição da pele à radiação se correlaciona com um limiar de ponto de não retorno, a partir do qual o comprometimento de outros órgãos resulta em falência de um ou múltiplos órgãos e, em última análise, leva à morte do paciente ^8,9. A lesão cutânea por radiação é composta por uma fase aguda e uma crônica. A lesão aguda por radiação manifesta-se clinicamente como eritema, edema cutâneo, dermatite, bolhas, desnudação epidérmica, descamação seca ou úmida, ulceração e alterações no cabelo e nas unhas. A fase crônica se manifesta como atrofia dérmica, fibrose, ulceração crônica e telangiectasias^10,11. Em geral, os efeitos agudos se manifestam predominantemente na epiderme, enquanto os efeitos crônicos são mais proeminentes na derme. A reação aguda à exposição à radiação leva a uma diminuição acentuada da atividade mitótica dentro de 12 h após a exposição, seguida de hiperemia, aumento celular, vacuolização, picnose nuclear e fragmentação ^4,12.

Doses de radiação superiores a 40 Gy resultam em descamação úmida e perda de epiderme, levando a um aumento da suscetibilidade a infecções¹³. Além disso, a exposição da pele à radiação induz a produção de citocinas, desencadeando uma resposta imune inflamatória na camada dérmica. Mediadores inflamatórios proeminentes incluem interleucinas (IL-1, IL-3, IL-5, IL-6 e IL-8) e fator de necrose tumoral-α (TNFα)¹⁴. A falha na resolução da inflamação pode eventualmente resultar no desenvolvimento de fibrose no local da lesão por radiação¹⁵. Feridas físicas adicionais ou lesões térmicas agravam ainda mais essa resposta fibrótica, estendendo-se pela camada muscular¹⁶. O fator de crescimento transformador β (TGFβ) é a citocina chave no desenvolvimento da fibrose¹⁷. Atualmente, muito poucas opções de tratamento mostram resultados promissores, e a maioria pode ter desafios com a adesão do paciente. Pesquisas adicionais explorando as respostas celulares e moleculares da pele a diferentes doses de radiação melhorarão a compreensão da fisiopatologia da pele induzida por radiação e aprimorarão o desenvolvimento de novas terapias.

Para facilitar a tradução clínica dos resultados da pesquisa em modelos pré-clínicos no alívio de lesões induzidas por radiação na pele e nos tecidos moles, é crucial projetar modelos experimentais altamente relevantes de intervenções terapêuticas após a irradiação. Modelos in vitro e in vivo de lesão induzida por radiação foram descritos, incluindo modelos de cultura de células de células endoteliais irradiadas^18,19, fibroblastos²⁰ ou queratinócitos¹⁹ e modelos animais in vivo de roedores, suínos e primatas não humanos. Modelos de roedores são amplamente utilizados em pesquisas de radiação devido às suas semelhanças em resposta à lesão por radiação com humanos e sua flexibilidade de manipulação genética²¹. As necessidades de dose de radiação são maiores em roedores do que em humanos quando se busca resultados semelhantes: descamação, fibrose e necrose^16,22. A descrição dos critérios de pontuação para medir a resposta à radiação aumentou ainda mais a adoção de modelos de roedores de lesão cutânea por radiação^21,23.

A pesquisa atual no ambiente pré-clínico se concentra na compreensão dos mecanismos de lesão cutânea induzida por radiação e no desenvolvimento de opções terapêuticas. Assim, é essencial estabelecer um modelo pré-clínico robusto e reprodutível para criar o insulto de radiação com alta traduzibilidade clínica. Este trabalho descreve um modelo murino de fibrose cutânea com dose de radiação otimizada e técnica de entrega. Nosso modelo, que combina medidas funcionais, histológicas e moleculares, pode ser usado para estudar efetivamente o mecanismo de desenvolvimento da fibrose e investigar novas opções terapêuticas.

O uso ético de animais foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC), que atua em conformidade com a Lei de Bem-Estar Animal. Os animais foram alojados em uma instalação aprovada pela Associação para Avaliação e Credenciamento de Cuidados com Animais de Laboratório Internacional (AAALAC) e tratados de acordo com o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Anestesia

1. Coloque os ratos na caixa de um sistema de anestesia para pequenos animais (Figura 1). Entregue isoflurano a 4% na caixa e aguarde 5-10 minutos, momento em que abaixe o isoflurano para 2-3%.
2. Confirme a profundidade da anestesia por pinça do dedo do pé. Aplique lubrificante para os olhos para evitar o ressecamento. Mova o sujeito para o cone do nariz com fluxo de isoflurano a 2%.
3. Use a técnica acima para anestesiar cada camundongo para ensaio de barbear e medição de membros. Use uma dose de injeção intraperitoneal de pentobarbital de 1,25 mg / kg para anestesiar camundongos para irradiação.

2. Preparação da área da pele

1. Planeje raspar os ratos 2-3 dias antes de irradiar. Apare o cabelo usando um aparador (Figura 2A).
2. Aplique o creme depilatório e aguarde 1-2 min (Figura 2B). Limpe o creme com gaze seca e enxágue a pele com uma gaze embebida em solução salina com tampão fosfato (PBS) (Figura 2C).

3. Procedimento de irradiação

1. Anestesiar cada camundongo com uma injeção intraperitoneal administrada 5 minutos antes da irradiação. Posicione o membro no campo de radiação (25 cm x 25 cm) e fixe-o com fita cirúrgica (Figura 3A-C).
2. Restrinja o corpo usando fita cirúrgica (Figura 3D). Coloque um bolo de 1 cm de espessura para evitar / minimizar a penetração profunda de radiações ( Figura 3E ).
3. Calcule o aplicador e os fatores de corte para fornecer 40 Gy à pele do camundongo. Para o experimento aqui, use um acelerador linear para gerar um feixe de elétrons de 6 MeV para 3740 unidades de monitor para induzir queimaduras de irradiação. Nesse cenário, um campo de radiação de 25 cm x 25 cm na dose de 1.000 MU/min com 100 cm de distância entre a fonte e a superfície (SSD), que é a distância da fonte de irradiação até o topo do bolo alimentar para fornecer os 40 Gy. O tempo de irradiação varia de acordo com o acelerador linear usado, a energia do feixe e o tamanho do campo. Um físico médico ou de radiação deve ser consultado para calcular as unidades de monitoramento necessárias para fornecer 40Gy no acelerador linear.

4. Monitoramento visual do desenvolvimento de fibrose

1. Use uma câmera digital portátil para documentar a progressão da fibrose. Use a configuração macro para capturar fotos detalhadas.
2. Anestesifique camundongos por inalação de isoflurano.
3. Tire fotos posicionando a lente mais perto da pele e pressione capturar. Tente manter as fotos o mais consistentes possível. Mantenha o sujeito sob supervisão direta até que a consciência suficiente para manter a decúbito esternal seja recuperada.

5. Medição da excursão da perna como resultado funcional da fibrose

1. A partir da terceira semana após a irradiação, planeje fazer medições a cada semana por até 6 semanas.
2. Inicie e mantenha a anestesia conforme descrito acima. Prepare um campo na frente do cone do nariz e fixe um transferidor com fita adesiva no centro (Figura 4A).
3. Transfira o mouse para o campo e coloque suavemente o nariz no cone. Posicione o joelho direito no centro do transferidor (Figura 4B).
4. Mantenha o joelho fixo usando a mão esquerda e use a mão direita para dorsiflexionar o pé com os dedos indicador e pólen (Figura 4C,D).
5. Observe o grau de extensão lendo o valor indicado pelos dedos dos pés. Realize o mesmo procedimento na perna contralateral não irradiada.

6. Medição do índice funcional da marcha

1. Imprima em 3D a trilha de caminhada de roedores para criar uma trilha de caminhada de 40 cm suspensa a uma altura de 15 cm com piso transparente (Figura 5). Coloque um gravador de vídeo embaixo da faixa e comece a filmar. A câmera é ajustada para gravar um vídeo na resolução mais alta possível e com uma taxa de quadros mínima de 60 quadros por segundo.
2. Abra uma extremidade da faixa e transfira o mouse para dentro. Deixe o animal andar livremente na pista. Capture o animal andando da maneira mais suave possível pelo menos três vezes.
3. Verifique a qualidade do vídeo antes de gravar o próximo mouse.
4. Transfira os vídeos para um computador com um reprodutor de vídeo, aplicativo de captura de tela, um programa de processamento de imagem e um software de planilha. Assista às gravações para capturar três pegadas diferentes e claras usando a função de captura de tela (Figura 6).
5. Abra o programa de processamento de imagem para medições de propagação do dedo do pé. Selecione Arquivo no painel superior e clique em Abrir para localizar e exibir a imagem a ser analisada.
6. Selecione Ferramenta Linha reta na segunda linha do painel superior (Figura 7_1). Usando esta ferramenta, marque a largura da parede e clique em Analisar > Definir Escala e, em seguida, insira o valor exato para uma distância conhecida para calibrar a escala (Figura 7_2-5).
7. Use a Ferramenta Linha Reta para marcar o perímetro para diferentes medidas (Figura 6C, D; 1: comprimento do pé, 2: afastamento do dedo do pé externo, 3: espaçamento do dedo do pé interno), selecione Analisar > Medir e registre o valor do comprimento (Figura 8).
8. Realize as análises para os membros irradiados e não irradiados. Use a seguinte equação publicada anteriormente para avaliar a funcionalidade²⁴
   
   onde SFI = índice de funcionalidade ciática, E = pata experimental ou lesionada, N = pata normal ou não lesionada, TS = extensão do dedo do pé e PL = comprimento da impressão.

7. Eutanásia

1. Transfira o assunto para uma caixa conectada à linha CO₂ . Inicie a infusão de CO₂ para atingir a concentração de 30% a 70% dentro da câmara. Para uma câmara de 5 L, a infusão de gás deve estar entre 1,5-3,5 L/min.
2. Espere que o animal pare de respirar por 5-10 min. Eutanásia por luxação cervical, segurando a cabeça no lugar a partir da base do crânio e puxando firmemente a cauda²⁵.

8. Histologia e análises a jusante ¹⁷

1. Puxe o membro posterior irradiado para prepará-lo para a excisão. Selecione uma área de 2 cm x 1 cm para o plano posterior da pele extrema.
2. Use uma tesoura afiada para coletar cuidadosamente a amostra de pele. Corte o tecido ao meio a partir do eixo longo para obter duas peças separadas.
3. Fixe um pedaço de tecido em solução salina tamponada com formalina a 10%. Processe o tecido fixo para preparar cortes histológicos em lâminas.
4. Transfira o segundo pedaço para uma caixa cheia de gelo seco para preservar as proteínas e o RNA. Em seguida, transfira rapidamente as amostras de tecido para um freezer a -80 °C e mantenha-as congeladas até o processamento posterior.
5. Manchar as lâminas para coloração de hematoxilina e eosina (H&E) e coloração tricrômica de Masson. Visualize as lâminas coradas ao microscópio e tire imagens usando uma ampliação de 10x. Meça a espessura do epitélio usando um software de processamento de imagem, conforme explicado acima, para o ensaio funcional da marcha.

9. Estatísticas

1. Apresente os dados como média ± desvio padrão. Avalie os resultados usando análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de comparação múltipla de Bonferroni ou teste t de Student.

O estabelecimento e a otimização do protocolo de irradiação atual resultaram em uma indução consistente e reprodutível de fibrose em camundongos. Os membros direitos dos camundongos foram posicionados e fixados dentro do campo de radiação no dia da irradiação, e 40 Gy de radiação foram administrados.

O desenvolvimento de comprometimento funcional na pele foi monitorado por meio da captura de imagens semanais, pós-irradiação. As fotos mostraram ...

A lesão cutânea é um resultado provável da exposição acidental ou relacionada ao tratamento médico à radiação. Os reatores nucleares possuem um risco de violação acidental devido a erro humano ou desastres naturais como Chernobyl e Fukushima^26,27. A dosagem terapêutica para o tratamento do câncer é a exposição mais comum, que usa regimes de dose repetida fracionada que correm o risco de causar fibrose relacionada...

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse relacionados a este trabalho.

Este trabalho é financiado por bolsas de pesquisa do Departamento de Defesa W81XWH-19-PRMRP-DA, NIAID/NIH Grant 5R21AI153971-02 e PSF/MTF Grant 603902.