Establecimiento de un modelo robusto y reproducible de fibrosis cutánea y muscular inducida por radiación

Aquí presentamos un protocolo para inducir fibrosis cutánea inducida por radiación en la extremidad trasera de ratones y realizamos mediciones posteriores a la irradiación del deterioro crónico a través de análisis de la excursión de la extremidad y el índice de marcha para evaluar el resultado funcional. El modelo dilucida los mecanismos de fibrosis cutánea relacionados con la radiación y es útil en estudios terapéuticos subclínicos.

La fibrosis cutánea inducida por radiación (RISF, por sus siglas en inglés) puede ser el resultado de una gran cantidad de escenarios, incluida la terapia contra el cáncer, la exposición accidental o los actos de terrorismo. Los haces radiactivos pueden penetrar a través de la piel y afectar las estructuras a su paso, incluida la piel, los músculos y los órganos internos. La piel es la primera estructura en exponerse a la radiación y es susceptible de desarrollar fibrosis crónica, que es difícil de tratar. En la actualidad, las opciones de tratamiento limitadas muestran una eficacia moderada para mitigar la fibrosis cutánea relacionada con la radiación. Un factor clave que dificulta el desarrollo de contramedidas eficaces es la ausencia de un modelo conveniente y robusto que pueda permitir la traducción de los hallazgos experimentales a los seres humanos. Aquí, se ha establecido un modelo robusto y reproducible de fibrosis cutánea de extremidades traseras murinas para la evaluación profiláctica y terapéutica de posibles agentes para la recuperación funcional y molecular.

La extremidad posterior derecha fue irradiada con una dosis única de 40 (Gray) Gy para inducir fibrosis cutánea. Los sujetos desarrollaron edema y dermatitis en las primeras etapas, precedidas por constricción visible de la piel. Las extremidades irradiadas mostraron una reducción significativa del rango de movimiento de las extremidades en las semanas siguientes. En las últimas etapas, los efectos secundarios agudos disminuyeron, pero la fibrosis crónica persistió. Se realizó un índice de marcha como ensayo funcional adicional, que demostró el desarrollo de deterioro funcional. Estos métodos no invasivos demostraron mediciones fiables para el seguimiento de la progresión de la fibrosis, lo que está respaldado por análisis histológicos. Los análisis de dosis de radiación, aplicación y post-irradiación empleados en este modelo ofrecen un método vigoroso y reproducible para estudiar la fibrosis cutánea inducida por radiación y probar la eficacia de los agentes terapéuticos.

La piel es el órgano más grande del cuerpo, que cubre y protege el cuerpo de los peligros. Tiene tres capas distintas: epidermis, dermis e hipodermis. Cada capa tiene sus funciones únicas: la epidermis evita la deshidratación y la invasión microbiana; La dermis tiene una rica red de células y una matriz extracelular que proporciona resistencia a la tracción y elasticidad¹; La capa dérmica contiene los receptores sensoriales, los folículos pilosos, las glándulas y los vasos para las redes linfáticas y capilares. La hipodermis o tejido subcutáneo, con su abundancia de tejido adiposo, contornea el cuerpo y distribuye el estrés mecánico ^2,3,4.

La radiación, generada como resultado de accidentes, guerras, terrorismo o aplicaciones terapéuticas, penetra a través del cuerpo de una naturaleza lineal y progresiva, lo que hace que la piel sea el primer órgano en entrar en contacto. La amenaza de este tipo de incidentes se ha intensificado debido al aumento del uso de materiales radiactivos en industrias, instalaciones médicas e instalaciones militares⁵. Desde el punto de vista clínico, el daño por radiación en la piel se caracteriza por el síndrome de radiación cutánea (SRC), uno de los cuatro subsíndromes del síndrome de radiación aguda (SRA). La respuesta de la piel a las radiaciones ionizantes tiene implicaciones importantes para el tratamiento y la protección contra daños posteriores⁶. Las lesiones concomitantes, como quemaduras y traumatismos, complican aún más el resultado clínico cuando se combinan con lesiones por radiación⁷. El grado de exposición de la piel a la radiación se correlaciona con un umbral de punto de no retorno, a partir del cual el deterioro de otros órganos da lugar a un fallo orgánico único o múltiple y, en última instancia, conduce a la muerte del paciente ^8,9. La lesión cutánea por radiación se compone de una fase aguda y otra crónica. La lesión aguda por radiación se manifiesta clínicamente como eritema, edema cutáneo, dermatitis, ampollas, denudación epidérmica, descamación seca o húmeda, ulceración y cambios en el cabello y las uñas. La fase crónica se manifiesta como atrofia dérmica, fibrosis, ulceración crónica y telangiectasias ^10,11. En general, los efectos agudos se manifiestan predominantemente en la epidermis, mientras que los efectos crónicos son más prominentes en la dermis. La reacción aguda a la exposición a la radiación conduce a una marcada disminución de la actividad mitótica dentro de las 12 horas posteriores a la exposición, seguida de hiperemia, agrandamiento celular, vacuolización, picnosis nuclear y fragmentación ^4,12.

Las dosis de radiación superiores a 40 Gy dan lugar a una descamación húmeda y a la pérdida de la epidermis, lo que conduce a una mayor susceptibilidad a las infecciones¹³. Además, la exposición de la piel a la radiación induce la producción de citocinas, lo que desencadena una respuesta inmunitaria inflamatoria en la capa dérmica. Los mediadores inflamatorios destacados incluyen interleucinas (IL-1, IL-3, IL-5, IL-6 e IL-8) y el factor de necrosis tumoral α (TNFα)¹⁴. El fracaso en la resolución de la inflamación puede eventualmente resultar en el desarrollo de fibrosis en el sitio de la lesión por radiación¹⁵. Las heridas físicas adicionales o las lesiones térmicas agravan aún más esta respuesta fibrótica, extendiéndose a través de la capa muscular¹⁶. El factor de crecimiento transformante β (TGFβ) es la citocina clave en el desarrollo de la fibrosis¹⁷. En la actualidad, muy pocas opciones de tratamiento muestran resultados prometedores, y la mayoría podría tener problemas con el cumplimiento por parte de los pacientes. La investigación adicional que explora las respuestas celulares y moleculares de la piel a diferentes dosis de radiación mejorará la comprensión de la fisiopatología de la piel inducida por la radiación y mejorará el desarrollo de nuevas terapias.

Para facilitar la traslación clínica de los resultados de la investigación en modelos preclínicos para aliviar las lesiones inducidas por la radiación en la piel y los tejidos blandos, es crucial diseñar modelos experimentales altamente relevantes de intervenciones terapéuticas posteriores a la irradiación. Se han descrito modelos in vitro e in vivo de lesiones inducidas por radiación, incluyendo modelos de cultivo celular de células endoteliales irradiadas^18,19, fibroblastos²⁰ o queratinocitos¹⁹ y modelos animales in vivo de roedores, cerdos y primates no humanos. Los modelos de roedores son ampliamente utilizados en la investigación de la radiación debido a sus similitudes en la respuesta a las lesiones por radiación con los seres humanos y su flexibilidad de manipulación genética²¹. Los requerimientos de dosis de radiación son mayores en roedores que en humanos cuando se buscan resultados similares: descamación, fibrosis y necrosis^16,22. La descripción de los criterios de puntuación para medir la respuesta a la radiación ha mejorado aún más la adopción de modelos de lesiones cutáneas por radiación en roedores^21,23.

La investigación actual en el entorno preclínico se centra en la comprensión de los mecanismos de las lesiones cutáneas inducidas por la radiación y en el desarrollo de opciones terapéuticas. Por lo tanto, es esencial establecer un modelo preclínico robusto y reproducible para crear el insulto de radiación con alta traducibilidad clínica. Este trabajo describe un modelo murino de fibrosis cutánea con dosis de radiación optimizada y técnica de administración. Nuestro modelo, que combina mediciones funcionales, histológicas y moleculares, se puede utilizar para estudiar eficazmente el mecanismo del desarrollo de la fibrosis e investigar nuevas opciones terapéuticas.

El uso ético de animales fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC), que actúa de conformidad con la Ley de Bienestar Animal. Los animales fueron alojados en una instalación aprobada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC) y tratados de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Anestesia

1. Coloque los ratones en la caja de un sistema de anestesia para animales pequeños (Figura 1). Administre isoflurano al 4% en la caja y espere 5-10 minutos, momento en el que baje el isoflurano al 2-3%.
2. Confirme la profundidad de la anestesia mediante un pellizco en los dedos de los pies. Aplique lubricante para los ojos para evitar que se seque. Mueva el sujeto al cono de la nariz con un flujo de isoflurano al 2%.
3. Utilice la técnica anterior para anestesiar a cada ratón para el afeitado y el ensayo de medición de extremidades. Utilice una dosis inyectable de pentobarbital intraperitoneal de 1,25 mg/kg para anestesiar ratones para la irradiación.

2. Preparación de la zona de la piel

1. Planea afeitar a los ratones 2-3 días antes de irradiarlos. Recorte el cabello con una maquinilla (Figura 2A).
2. Aplique la crema depilatoria y espere 1-2 min (Figura 2B). Limpie la crema con una gasa seca y enjuague la piel con una gasa empapada en solución salina tampón fosfato (PBS) (Figura 2C).

3. Procedimiento de irradiación

1. Anestesiar a cada ratón con una inyección intraperitoneal administrada 5 min antes de la irradiación. Coloque la extremidad en el campo de radiación (25 cm x 25 cm) y asegúrela con cinta quirúrgica (Figura 3A-C).
2. Restrinja el cuerpo con cinta quirúrgica (Figura 3D). Colocar un bolo de 1 cm de espesor para prevenir/minimizar la penetración profunda de las radiaciones (Figura 3E).
3. Calcule el aplicador y los factores de recorte para administrar 40 Gy a la piel del ratón. Para el experimento aquí, use un acelerador lineal para generar un haz de electrones de 6 MeV para 3740 unidades de monitor para inducir quemaduras por irradiación. En este entorno, un campo de radiación de 25 cm x 25 cm a una dosis de 1.000 MU/min con una distancia de 100 cm entre la fuente de radiación y la superficie (SSD), que es la distancia desde la fuente de irradiación hasta la parte superior del bolo para administrar los 40 Gy. El tiempo de irradiación variará según el acelerador lineal utilizado, la energía del haz y el tamaño del campo. Se debe consultar a un físico médico o de radiación para calcular las unidades de monitor necesarias para administrar 40Gy en el acelerador lineal.

4. Seguimiento visual del desarrollo de la fibrosis

1. Use una cámara digital de mano para documentar la progresión de la fibrosis. Utilice la configuración de macro para capturar fotos detalladas.
2. Anesteticar ratones por inhalación de isoflurano.
3. Tome fotografías colocando la lente más cerca de la piel y presione capturar. Intenta que las fotos sean lo más consistentes posible. Mantener al sujeto bajo supervisión directa hasta que se recupere la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.

5. Medición de la excursión de la pierna como resultado funcional de la fibrosis

1. A partir de la tercera semana después de la irradiación, planifique hacerse mediciones cada semana durante un máximo de 6 semanas.
2. Inicie y mantenga la anestesia como se describe anteriormente. Prepare un campo frente al cono de la nariz y fije un transportador con cinta adhesiva en el centro (Figura 4A).
3. Transfiera el mouse al campo y coloque suavemente su nariz en el cono. Coloque la rodilla derecha en el centro del transportador (Figura 4B).
4. Mantenga la rodilla fija con la mano izquierda y use la mano derecha para dorsiflexionar el pie con los dedos índice y pollex (Figura 4C, D).
5. Anote el grado de extensión leyendo el valor indicado por los dedos de los pies. Realice el mismo procedimiento en la pierna contralateral no irradiada.

6. Medición del índice funcional de la marcha

1. Imprime en 3D la pista de rodedores para crear un sendero de 40 cm suspendido a una altura de 15 cm con un suelo transparente (Figura 5). Coloque una grabadora de video debajo de la pista y comience a filmar. La cámara está ajustada para grabar un vídeo a la resolución más alta posible y a una velocidad de fotogramas mínima de 60 fotogramas por segundo.
2. Abra un extremo de la pista y transfiera el mouse adentro. Deja que el animal camine libremente por la pista. Capture al animal caminando lo más suavemente posible al menos tres veces.
3. Compruebe la calidad del vídeo antes de grabar con el siguiente ratón.
4. Transfiera los videos a una computadora con un reproductor de video, una aplicación de captura de pantalla, un programa de procesamiento de imágenes y un software de hoja de cálculo. Mire las grabaciones para capturar tres huellas diferentes y claras utilizando la función de captura de pantalla (Figura 6).
5. Abra el programa de procesamiento de imágenes para las mediciones de la separación de los dedos. Seleccione Archivo en el panel superior y haga clic en Abrir para buscar y mostrar la imagen que se va a analizar.
6. Seleccione la herramienta Línea recta de la segunda fila del panel superior (Figura 7_1). Con esta herramienta, marque el ancho de la pared y haga clic en Analizar > Establecer escala, luego ingrese el valor exacto para una distancia conocida para calibrar la escala (Figura 7_2-5).
7. Utilice la herramienta Línea recta para marcar la huella para diferentes medidas (Figura 6C, D; 1: longitud del pie, 2: extensión exterior de la puntera, 3: separación interior de la puntera), seleccione Analizar > medida y registre el valor de la longitud (Figura 8).
8. Realizar los análisis tanto de las extremidades irradiadas como de las no irradiadas. Utilice la siguiente ecuación publicada anteriormente para evaluar la funcionalidad²⁴
   
   donde SFI = índice de funcionalidad ciática, E = pata experimental o lesionada, N = pata normal o no lesionada, TS = extensión de la punta y PL = longitud de impresión.

7. Eutanasia

1. Transfiera el sujeto a una caja conectada a una línea de CO₂ . Inicie la infusión de CO₂ para alcanzar una concentración del 30%-70% dentro de la cámara. Para una cámara de 5 L, la infusión de gas debe estar entre 1,5 y 3,5 L/min.
2. Espere a que el animal deje de respirar durante 5-10 min. Eutanasia por luxación cervical sosteniendo la cabeza en su lugar desde la base del cráneo y tirando firmemente de la cola²⁵.

8. Histología y análisis posteriores ¹⁷

1. Tire de la extremidad trasera irradiada para prepararla para la escisión. Seleccione un área de 2 cm x 1 cm en el plano posterior de la piel de la extremidad.
2. Use un par de tijeras afiladas para recolectar cuidadosamente la muestra de piel. Corta el tejido por la mitad desde el eje largo para obtener dos piezas separadas.
3. Fije una pieza de tejido en solución salina tamponada con formalina al 10%. Procese el tejido fijado para preparar secciones histológicas en portaobjetos.
4. Transfiera la segunda pieza a una caja llena de hielo seco para preservar las proteínas y el ARN. A continuación, transfiera rápidamente las muestras de tejido a un congelador a -80 °C y manténgalas congeladas hasta su posterior procesamiento.
5. Tiñir los portaobjetos para la tinción de hematoxilina y eosina (H&E) y la tinción tricrómica de Masson. Visualice los portaobjetos teñidos bajo un microscopio y tome imágenes con un aumento de 10x. Mida el grosor del epitelio utilizando un software de procesamiento de imágenes como se explicó anteriormente para el ensayo funcional de la marcha.

9. Estadísticas

1. Presente los datos como media ± desviación estándar. Evalúe los resultados utilizando el análisis de varianza (ANOVA) seguido de la prueba de comparación múltiple de Bonferroni o la prueba t de Student.

El establecimiento y la optimización del protocolo de irradiación actual dieron como resultado una inducción consistente y reproducible de la fibrosis en ratones. Las extremidades derechas de los ratones se colocaron y aseguraron dentro del campo de radiación el día de la irradiación, y se administraron 40 Gy de radiación.

El desarrollo del deterioro funcional de la piel se controló mediante la captura de imágenes cada semana, después de la irradiaci...

Las lesiones cutáneas son el resultado probable de una exposición accidental o relacionada con el tratamiento médico a la radiación. Los reactores nucleares poseen un riesgo de ruptura accidental debido a errores humanos o desastres naturales como Chernóbil y Fukushima^26,27. La dosis terapéutica para el tratamiento del cáncer es la exposición más común, que utiliza regímenes fraccionados de dosis repetidas que corren e...

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos ni otros conflictos de intereses relacionados con este trabajo.

Este trabajo está financiado por becas de investigación del Departamento de Defensa W81XWH-19-PRMRP-DA, NIAID/NIH Grant 5R21AI153971-02 y PSF/MTF Grant 603902.