Messa a punto di un modello robusto e riproducibile di fibrosi cutanea e muscolare indotta da radiazioni

Qui presentiamo un protocollo per indurre la fibrosi cutanea indotta da radiazioni nell'arto posteriore dei topi ed eseguiamo misurazioni post-irradiazione della compromissione cronica tramite analisi dell'escursione dell'arto e dell'indice di deambulazione per valutare il risultato funzionale. Il modello chiarisce i meccanismi di fibrosi cutanea correlati alle radiazioni ed è utile negli studi terapeutici subclinici.

La fibrosi cutanea indotta da radiazioni (RISF) può derivare da una pletora di scenari, tra cui la terapia del cancro, l'esposizione accidentale o gli atti di terrorismo. I raggi radioattivi possono penetrare attraverso la pelle e influenzare le strutture lungo il loro percorso, tra cui pelle, muscoli e organi interni. La pelle è la prima struttura ad essere esposta alle radiazioni ed è suscettibile di sviluppare la fibrosi cronica, che è difficile da trattare. Attualmente, le opzioni di trattamento limitate mostrano un'efficacia moderata nel mitigare la fibrosi cutanea correlata alle radiazioni. Un fattore chiave che ostacola lo sviluppo di contromisure efficaci è l'assenza di un modello conveniente e robusto che possa consentire la traduzione dei risultati sperimentali nell'uomo. Qui, è stato stabilito un modello di fibrosi cutanea murina degli arti posteriori robusto e riproducibile per la valutazione profilattica e terapeutica di possibili agenti per il recupero funzionale e molecolare.

L'arto posteriore destro è stato irradiato utilizzando una singola dose di 40 (Gray) Gy per indurre la fibrosi cutanea. I soggetti hanno sviluppato edema e dermatite nelle fasi iniziali precedute da una visibile costrizione cutanea. Gli arti irradiati hanno mostrato un range di movimento degli arti significativamente ridotto nelle settimane successive. Nelle fasi avanzate, gli effetti collaterali acuti si sono attenuati, ma la fibrosi cronica è persistita. È stato eseguito un indice dell'andatura come test funzionale aggiuntivo, che ha dimostrato lo sviluppo di una compromissione funzionale. Questi metodi non invasivi hanno dimostrato misurazioni affidabili per tracciare la progressione della fibrosi, supportate da analisi istologiche. Le analisi della dose di radiazioni, dell'applicazione e del post-irradiazione impiegate in questo modello offrono un metodo vigoroso e riproducibile per studiare la fibrosi cutanea indotta da radiazioni e testare l'efficacia degli agenti terapeutici.

La pelle è l'organo più grande del corpo, che copre e protegge il corpo dai pericoli. Ha tre strati distinti: epidermide, derma e ipoderma. Ogni strato ha le sue funzioni uniche: l'epidermide previene la disidratazione e l'invasione microbica; il derma ha una ricca rete di cellule e una matrice extracellulare che fornisce resistenza alla trazione ed elasticità¹; Lo strato dermico contiene i recettori sensoriali, i follicoli piliferi, le ghiandole e i vasi per le reti linfatiche e capillari. L'ipoderma o tessuto sottocutaneo, con la sua abbondanza di tessuto adiposo, modella il corpo e distribuisce le sollecitazioni meccaniche ^2,3,4.

Le radiazioni, generate a seguito di incidenti, guerre, terrorismo o applicazioni terapeutiche, penetrano attraverso il corpo in modo lineare progressivo, portando la pelle ad essere il primo organo a venire a contatto. La minaccia di tali incidenti si è intensificata a causa dell'aumento dell'uso di materiali radioattivi nelle industrie, nelle strutture mediche e^{nelle installazioni militari}. Clinicamente, il danno da radiazioni alla pelle è caratterizzato dalla sindrome cutanea da radiazioni (CRS), una delle quattro sottosindromi della sindrome acuta da radiazioni (ARS). La risposta della pelle alle radiazioni ionizzanti ha importanti implicazioni per il trattamento e la protezione da ulteriori danni⁶. Lesioni concomitanti come ustioni e traumi complicano ulteriormente l'esito clinico se combinate con lesioni da radiazioni⁷. L'entità dell'esposizione della pelle alle radiazioni è correlata a un punto di soglia di non ritorno, a partire dal quale la compromissione di altri organi provoca un'insufficienza di uno o più organi e, infine, porta alla morte del paziente ^8,9. La lesione cutanea da radiazioni è composta da una fase acuta e una cronica. La lesione acuta da radiazioni si manifesta clinicamente come eritema, edema cutaneo, dermatite, formazione di vesciche, denudazione epidermica, desquamazione secca o umida, ulcerazione e alterazioni dei capelli e delle unghie. La fase cronica si manifesta con atrofia dermica, fibrosi, ulcerazione cronica e teleangectasie^10,11. In generale, gli effetti acuti si manifestano prevalentemente nell'epidermide, mentre gli effetti cronici sono più evidenti nel derma. La reazione acuta all'esposizione alle radiazioni porta ad una marcata diminuzione dell'attività mitotica entro 12 ore dall'esposizione, seguita da iperemia, ingrossamento cellulare, vacuolizzazione, picnosi nucleare e frammentazione ^4,12.

Dosi di radiazioni superiori a 40 Gy provocano desquamazione umida e perdita dell'epidermide, con conseguente aumento della suscettibilità alle infezioni¹³. Inoltre, l'esposizione della pelle alle radiazioni induce la produzione di citochine, innescando una risposta immunitaria infiammatoria nello strato dermico. I principali mediatori dell'infiammazione includono le interleuchine (IL-1, IL-3, IL-5, IL-6 e IL-8) e il fattore di necrosi tumorale-α (TNFα)¹⁴. Il fallimento nella risoluzione dell'infiammazione può eventualmente provocare lo sviluppo di fibrosi nel sito del danno da radiazioni¹⁵. Ulteriori ferite fisiche o lesioni termiche aggravano ulteriormente questa risposta fibrotica, estendendosi attraverso lo strato muscolare¹⁶. Il fattore di crescita trasformante-β (TGFβ) è la citochina chiave nello sviluppo della fibrosi¹⁷. Attualmente, pochissime opzioni di trattamento mostrano risultati promettenti e la maggior parte potrebbe avere problemi con la compliance del paziente. Ulteriori ricerche che esplorano le risposte cellulari e molecolari della pelle a diverse dosi di radiazioni miglioreranno la comprensione della fisiopatologia cutanea indotta dalle radiazioni e favoriranno lo sviluppo di nuove terapie.

Per facilitare la traduzione clinica dei risultati della ricerca in modelli preclinici nell'alleviare le lesioni indotte dalle radiazioni alla pelle e ai tessuti molli, è fondamentale progettare modelli sperimentali altamente rilevanti di interventi terapeutici dopo l'irradiazione. Sono stati descritti modelli sia in vitro che in vivo di danno indotto da radiazioni, inclusi modelli di coltura cellulare di cellule endoteliali irradiate^18,19, fibroblasti²⁰ o cheratinociti¹⁹ e modelli animali di roditori, suini e primati non umani in vivo. I modelli di roditori sono ampiamente utilizzati nella ricerca sulle radiazioni a causa delle loro somiglianze in risposta al danno da radiazioni con gli esseri umani e della loro flessibilità di manipolazione genetica²¹. I requisiti di dose di radiazioni sono più elevati nei roditori rispetto agli esseri umani quando si cercano risultati simili: desquamazione, fibrosi e necrosi^16,22. La descrizione dei criteri di punteggio per misurare la risposta alle radiazioni ha ulteriormente migliorato l'adozione di modelli di roditori di lesioni cutanee da radiazioni^21,23.

L'attuale ricerca in ambito preclinico si concentra sulla comprensione dei meccanismi delle lesioni cutanee indotte dalle radiazioni e sullo sviluppo di opzioni terapeutiche. Pertanto, è essenziale stabilire un modello preclinico robusto e riproducibile per creare l'insulto da radiazioni con un'elevata traducibilità clinica. Questo lavoro descrive un modello murino di fibrosi cutanea con dose di radiazioni e tecnica di somministrazione ottimizzate. Il nostro modello, che combina misurazioni funzionali, istologiche e molecolari, può essere utilizzato per studiare efficacemente il meccanismo di sviluppo della fibrosi e studiare nuove opzioni terapeutiche.

L'uso etico degli animali è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), che agisce in conformità con l'Animal Welfare Act. Gli animali sono stati ospitati in una struttura approvata dall'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) e trattati secondo la Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

1. Anestesia

1. Metti i topi nella scatola di un sistema di anestesia per piccoli animali (Figura 1). Erogare il 4% di isoflurano nella scatola e attendere 5-10 minuti, dopodiché abbassare l'isoflurano al 2-3%.
2. Confermare la profondità dell'anestesia con un pizzico per le dita dei piedi. Applicare un lubrificante per gli occhi per prevenire la secchezza. Spostare il soggetto verso il cono del naso con un flusso di isoflurano al 2%.
3. Utilizzare la tecnica di cui sopra per anestetizzare ogni topo per la rasatura e il test di misurazione degli arti. Utilizzare una dose di iniezione intraperitoneale di pentobarbital di 1,25 mg/kg per anestetizzare i topi per l'irradiazione.

2. Preparazione dell'area cutanea

1. Pianifica di radere i topi 2-3 giorni prima dell'irradiazione. Taglia i capelli usando un tagliacapelli (Figura 2A).
2. Applicare la crema depilatoria e attendere 1-2 minuti (Figura 2B). Pulire la crema con una garza asciutta e sciacquare la pelle con una garza imbevuta di soluzione salina tampone fosfato (PBS) (Figura 2C).

3. Procedura di irradiazione

1. Anestetizzare ogni topo con un'iniezione intraperitoneale somministrata 5 minuti prima dell'irradiazione. Posizionare l'arto nel campo di radiazione (25 cm x 25 cm) e fissarlo con nastro chirurgico (Figura 3A-C).
2. Limitare il corpo utilizzando del nastro chirurgico (Figura 3D). Posizionare un bolo di 1 cm di spessore per prevenire/ridurre al minimo la penetrazione profonda delle radiazioni (Figura 3E).
3. Calcola i fattori dell'applicatore e del ritaglio per erogare 40 Gy sulla pelle del topo. Per l'esperimento qui, utilizzare un acceleratore lineare per generare un fascio di elettroni da 6 MeV per 3740 unità monitor per indurre ustioni da irradiazione. In questa impostazione, un campo di radiazione di 25 cm x 25 cm a una dose di 1.000 MU/min con una distanza da sorgente a superficie (SSD) di 100 cm, che è la distanza dalla sorgente di irradiazione alla sommità del bolo per erogare i 40 Gy. Il tempo di irradiazione varia in base all'acceleratore lineare utilizzato, all'energia del fascio e alle dimensioni del campo. È necessario consultare un radioterapista o un fisico medico per calcolare le unità di monitoraggio necessarie per erogare 40Gy sull'acceleratore lineare.

4. Monitoraggio visivo dello sviluppo della fibrosi

1. Usa una fotocamera digitale portatile per documentare la progressione della fibrosi. Utilizzare l'impostazione macro per scattare foto dettagliate.
2. Anesethetizzare i topi mediante inalazione di isoflurano.
3. Scattare foto posizionando l'obiettivo più vicino alla pelle e premere il pulsante di acquisizione. Cerca di mantenere le foto il più coerenti possibile. Tenere il soggetto sotto supervisione diretta fino a quando non viene riacquistata una coscienza sufficiente per mantenere la decubita sternale.

5. Misurazione dell'escursione delle gambe come esito funzionale della fibrosi

1. A partire dalla terza settimana dopo l'irradiazione, pianificare le misurazioni ogni settimana per un massimo di 6 settimane.
2. Iniziare e mantenere l'anestesia come descritto sopra. Preparare un campo davanti al cono anteriore e fissare un goniometro con del nastro adesivo al centro (Figura 4A).
3. Trasferisci il topo sul campo e appoggia delicatamente il naso sul cono. Posizionare il ginocchio destro al centro del goniometro (Figura 4B).
4. Tenere il ginocchio fisso con la mano sinistra e usare la mano destra per dorsiflettere il piede con l'indice e il pollex (Figura 4C, D).
5. Annotare il grado di estensione leggendo il valore indicato dalle dita dei piedi. Eseguire la stessa procedura sulla gamba controlaterale non irradiata.

6. Misurazione dell'indice funzionale del cammino

1. Stampa in 3D il percorso di camminamento per roditori per creare un percorso di 40 cm sospeso a un'altezza di 15 cm con un pavimento trasparente (Figura 5). Posiziona un videoregistratore sotto la traccia e inizia le riprese. La fotocamera è regolata per registrare un video alla massima risoluzione possibile e a un frame rate minimo di 60 fotogrammi al secondo.
2. Apri un'estremità della pista e trasferisci il mouse all'interno. Lascia che l'animale cammini liberamente sulla pista. Cattura l'animale che cammina nel modo più fluido possibile almeno tre volte.
3. Controlla la qualità del video prima di registrare il mouse successivo.
4. Trasferisci i video su un computer con un lettore video, un'applicazione screenshot, un programma di elaborazione delle immagini e un software per fogli di calcolo. Guarda le registrazioni per acquisire tre impronte diverse e chiare utilizzando la funzione screenshot (Figura 6).
5. Aprire il programma di elaborazione delle immagini per le misurazioni dell'apertura delle dita dei piedi. Seleziona File dal pannello superiore e fai clic su Apri per trovare e visualizzare l'immagine da analizzare.
6. Selezionare Strumento Linea retta dalla seconda riga del pannello superiore (Figura 7_1). Utilizzando questo strumento, contrassegnare la larghezza della parete e fare clic su Analizza > Imposta scala, quindi inserire il valore esatto per una distanza nota per calibrare la scala (Figura 7_2-5).
7. Utilizzare lo strumento Linea retta per contrassegnare l'impronta per diverse misurazioni (Figura 6C, D; 1: lunghezza del piede, 2: apertura esterna della punta, 3: apertura interna della punta), selezionare Analizza > misura e registrare il valore della lunghezza (Figura 8).
8. Eseguire le analisi sia per gli arti irradiati che per quelli non irradiati. Utilizzare la seguente equazione pubblicata in precedenza per valutare la funzionalità²⁴
   
   dove SFI = indice di funzionalità sciatica, E = zampa sperimentale o ferita, N = zampa normale o illesa, TS = apertura delle dita e PL = lunghezza dell'impronta.

7. Eutanasia

1. Trasferire il soggetto in una scatola collegata alla linea CO₂ . Avviare l'infusione di CO₂ per raggiungere una concentrazione del 30%-70% all'interno della camera. Per una camera da 5 L, l'infusione di gas deve essere compresa tra 1,5 e 3,5 L/min.
2. Attendi che l'animale smetta di respirare per 5-10 minuti. Eutanasia per lussazione cervicale tenendo la testa in posizione dalla base del cranio e tirando con decisione la coda²⁵.

8. Istologia e analisi a valle ¹⁷

1. Tirare l'arto posteriore irradiato per prepararlo all'escissione. Selezionare un'area di 2 cm x 1 cm rispetto al piano posteriore della pelle estrema.
2. Utilizzare un paio di forbici affilate per raccogliere con cura il campione di pelle. Tagliare il tessuto a metà dall'asse lungo per ottenere due pezzi separati.
3. Fissare un pezzo di tessuto in soluzione salina tamponata con formalina al 10%. Processare il tessuto fissato per la preparazione di sezioni istologiche su vetrini.
4. Trasferisci il secondo pezzo in una scatola piena di ghiaccio secco per preservare le proteine e l'RNA. Quindi, trasferire rapidamente i campioni di tessuto in un congelatore a -80 °C e conservarli congelati fino a un'ulteriore elaborazione.
5. Colorare i vetrini per la colorazione di ematossilina ed eosina (H&E) e la colorazione Trichrome di Masson. Visualizza i vetrini colorati al microscopio e scatta immagini utilizzando l'ingrandimento 10x. Misurare lo spessore dell'epitelio utilizzando il software di elaborazione delle immagini come spiegato sopra per il test funzionale dell'andatura.

9. Statistiche

1. Presenta i dati come media ± deviazione standard. Valutare i risultati utilizzando l'analisi della varianza (ANOVA) seguita dal test multi-confronto di Bonferroni o dal t-test di Student.

La creazione e l'ottimizzazione dell'attuale protocollo di irradiazione ha portato a un'induzione coerente e riproducibile della fibrosi nei topi. Gli arti destri dei topi sono stati posizionati e fissati all'interno del campo di radiazioni il giorno dell'irradiazione e sono stati somministrati 40 Gy di radiazioni.

Lo sviluppo di compromissione funzionale della pelle è stato monitorato catturando immagini ogni settimana, dopo l'irradiazione. Le foto hanno mos...

La lesione cutanea è un probabile risultato dell'esposizione accidentale o correlata a un trattamento medico alle radiazioni. I reattori nucleari presentano un rischio di rottura accidentale a causa di errori umani o disastri naturali come Chernobyl e Fukushima^26,27. Il dosaggio terapeutico per il trattamento del cancro è l'esposizione più comune, che utilizza regimi di dose ripetuta frazionata che rischiano di causare fibrosi...

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse relativi a questo lavoro.

Questo lavoro è finanziato da sovvenzioni di ricerca del Dipartimento della Difesa W81XWH-19-PRMRP-DA, NIAID/NIH Grant 5R21AI153971-02 e PSF/MTF Grant 603902.