放射線誘発性皮膚および筋肉線維症の堅牢で再現性のあるモデルの確立

ここでは、マウスの後肢に放射線誘発性皮膚線維症を誘発し、四肢エクスカーションおよび歩行指数分析 による 慢性障害の照射後測定を行い、機能的転帰を評価するためのプロトコルを紹介します。このモデルは、放射線に関連する皮膚線維症のメカニズムを解明し、無症状の治療研究に有用です。

放射線誘発性皮膚線維症(RISF)は、がん治療、偶発的な被ばく、テロ行為など、さまざまなシナリオから生じる可能性があります。放射性ビームは皮膚を貫通し、皮膚、筋肉、内臓などの経路の構造に影響を与える可能性があります。皮膚は放射線に最初に被曝する構造であり、治療が困難な慢性線維症を発症しやすい。現在、限られた治療選択肢が放射線関連の皮膚線維症の緩和に中等度の有効性を示しています。効果的な対策の開発を妨げる主な要因は、実験結果を人間に翻訳できる便利で堅牢なモデルがないことです。ここでは、機能的および分子的回復のための可能性のある薬剤の予防的および治療的評価のために、堅牢で再現性のあるマウス後肢皮膚線維症モデルが確立されました。

右後肢に40(Gray)Gyの単回線量を用いて照射し、皮膚線維化を誘発した。被験者は初期段階で浮腫と皮膚炎を発症し、目に見える皮膚の収縮によって進行しました。照射された四肢は、その後の数週間で四肢の可動域が有意に減少したことを示しました。後期には、急性の副作用は治まったが、慢性線維症は持続した。追加の機能アッセイとして歩行指数が実施され、機能障害の発症が実証されました。これらの非侵襲的方法は、組織学的分析によって裏付けられている線維症の進行を追跡するための信頼性の高い測定を実証しました。このモデルで採用されている放射線量、適用、および照射後の分析は、放射線誘発性皮膚線維症を研究し、治療薬の有効性をテストするための積極的で再現性のある方法を提供します。

皮膚は体の最大の器官であり、体を危険から覆い、保護します。表皮、真皮、皮下組織の3つの異なる層があります。各層には独自の機能があります:表皮は脱水症や微生物の侵入を防ぎます。真皮には、細胞の豊富なネットワークと、引張強度と弾力性を提供する細胞外マトリックスがあります¹。真皮層には、感覚受容体、毛包、腺、およびリンパ管および毛細血管ネットワークの血管が含まれています。皮下組織または皮下組織は、脂肪組織が豊富にあり、体の輪郭を描き、機械的ストレスを分散します^2,3,4。

事故、戦争、テロ、または治療への応用の結果として生成された放射線は、直線的に進行性で体内に浸透し、皮膚が最初に接触する臓器になります。このような事故の脅威は、産業、医療施設、軍事施設5での放射性物質の使用の増加により、激化^{しています。}臨床的には、皮膚への放射線障害は、急性放射線症候群(ARS)の4つのサブ症候群の1つである皮膚放射線症候群(CRS)によって特徴付けられます。電離放射線に対する皮膚の反応は、治療とさらなる損傷からの保護に重要な意味を持っています⁶。火傷や外傷などの付随する損傷は、放射線損傷と組み合わせると臨床転帰をさらに複雑にします⁷。放射線への皮膚被曝の程度は、他の臓器の障害が単一または複数の臓器不全を引き起こし、最終的に患者の死につながるノーリターン閾値と相関しています^8,9。皮膚放射線障害は、急性期と慢性期で構成されています。急性放射線障害は、紅斑、皮膚浮腫、皮膚炎、水疱、表皮剥離、乾性または湿性落屑、潰瘍形成、および毛髪や爪の変化として臨床的に現れます。慢性期は、皮膚萎縮、線維症、慢性潰瘍、および毛細血管拡張症として現れます^10,11。一般に、急性の影響は主に表皮に現れますが、慢性の影響は真皮に最も顕著です。放射線被曝に対する急性反応は、被曝から12時間以内に有糸分裂活性の著しい減少をもたらし、続いて充血、細胞肥大、空胞化、核ピクノーシス、および断片化が進行する^4,12。

40Gyを超える放射線量は、湿った落屑と表皮の喪失を引き起こし、感染に対する感受性の増加につながります¹³。さらに、放射線への皮膚曝露はサイトカイン産生を誘導し、真皮層で炎症性免疫応答を引き起こします。著名な炎症メディエーターには、インターロイキン(IL-1、IL-3、IL-5、IL-6、およびIL-8)および腫瘍壊死因子-α(TNFα)¹⁴が含まれる。炎症の解消に失敗すると、最終的には放射線損傷部位に線維化が進行する可能性があります¹⁵。追加の身体的創傷または熱傷は、この線維性反応をさらに悪化させ、筋肉層¹⁶を通って広がる。トランスフォーミング成長因子-β(TGFβ)は、線維症の発症における主要なサイトカインです¹⁷。現在、有望な結果を示す治療選択肢はほとんどなく、大多数は患者のコンプライアンスに課題を抱えている可能性があります。さまざまな放射線量に対する皮膚の細胞および分子応答を調査するさらなる研究により、放射線誘発性の皮膚病態生理学の理解が向上し、新しい治療法の開発が促進されます。

放射線による皮膚や軟部組織への損傷を軽減するための前臨床モデルでの研究成果の臨床応用を促進するためには、放射線照射後の治療的介入の関連性の高い実験モデルを設計することが重要である。放射線誘発性傷害のin vitroおよびin vivoモデルの両方が記載されており、これには、照射された内皮細胞^18,19、^線維芽細胞²⁰、またはケラチノサイト¹⁹の細胞培養モデル、およびin vivoのげっ歯類、ブタ、および非ヒト霊長類動物モデルが含まれる。げっ歯類モデルは、放射線傷害に対するヒトとの類似性や遺伝子操作の柔軟性から、放射線研究で広く使用されています²¹。放射線量要件は、落屑、線維症、および壊死^16,22という同様の結果を求める場合、げっ歯類の方がヒトよりも高くなります。放射線に対する反応を測定するための採点基準の説明は、放射線皮膚損傷^21,23のげっ歯類モデルの採用をさらに強化しました。

前臨床における現在の研究は、放射線誘発性皮膚損傷のメカニズムの理解と治療選択肢の開発に焦点を当てています。したがって、高い臨床翻訳可能性を備えた放射線障害を作成するための堅牢で再現性のある前臨床モデルを確立することが不可欠です。この研究では、最適化された放射線量と送達技術を用いた皮膚線維症のマウスモデルについて説明しています。機能測定、組織学的測定、分子測定を組み合わせた私たちのモデルは、線維症の発生メカニズムを効果的に研究し、新しい治療選択肢を検討するために使用できます。

動物は、AAALAC(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International)が承認した施設に収容され、National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(National Institutes for the Care and Use of Laboratory Animals)ガイドに従って治療されました。

1.麻酔

1. マウスを小動物麻酔システムの箱に入れます(図1)。4%イソフルランをボックスに供給し、5〜10分間待つと、イソフルランを2〜3%に下げます。
2. つま先をつまんで麻酔の深さを確認します。乾燥を防ぐためにアイローションを塗布してください。被験者を2%イソフルランフローでノーズコーンに移動します。
3. 上記の技術を使用して、シェービングと四肢測定アッセイのために各マウスに麻酔をかけます。1.25 mg / kgの腹腔内ペントバルビタール注射用量を使用して、マウスに麻酔をかけて照射します。.

2.皮膚領域の準備

1. 照射の2〜3日前にマウスを剃る計画を立ててください。バリカンを使用して髪をトリミングします(図2A)。
2. 脱毛クリームを塗布し、1〜2分待ちます(図2B)。クリームを乾いたガーゼで拭き、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に浸したガーゼで皮膚を洗い流します(図2C)。

3.照射手順

1. 照射の5分前に投与された腹腔内注射で各マウスに麻酔をかけます。四肢を放射線野(25 cm x 25 cm)に配置し、サージカルテープで固定します(図3A-C)。
2. サージカルテープを使用して体を制限します(図3D)。放射線の深い浸透を防止/最小限に抑えるために、厚さ1cmのボーラスを配置します(図3E)。
3. アプリケーターとカットアウトの係数を計算して、マウスの皮膚に 40 Gy を照射します。ここでの実験では、線形加速器を用いて3740モニターユニット用の6MeV電子ビームを生成し、照射火傷を誘発します。この設定では、1,000 MU/minの線量で25 cm x 25 cmの放射線野を、100 cmの線源から表面までの距離(SSD)で、これは照射源からボーラスの上部までの距離で40 Gyを送達します。照射時間は、使用する線形加速器、ビームエネルギー、磁場の大きさによって異なります。放射線物理学者または医学物理学者に相談して、線形加速器に40Gyを供給するために必要なモニターユニットを計算する必要があります。

4. 線維症の進行の視覚的モニタリング

1. ハンドヘルドデジタルカメラを使用して、線維症の進行を記録します。マクロ設定を使用して、詳細な写真を撮影します。
2. イソフルランを吸入してマウスを麻酔します。.
3. レンズを肌に近づけて写真を撮り、キャプチャを押します。写真の一貫性を保つようにしてください。胸骨の横臥を維持するのに十分な意識が回復するまで、被験者を直接の監督下に置いてください。

5. 線維症の機能的アウトカムとしての脚の逸脱の測定

1. 照射後3週間目から、最大6週間まで毎週測定を行うように計画してください。
2. 上記のように麻酔を開始し、維持します。ノーズコーンの前にフィールドを準備し、中央にテープで分度器を固定します(図4A)。
3. マウスをフィールドに移し、マウスの鼻をコーンにそっと置きます。右膝を分度器の中心に配置します(図4B)。
4. 左手で膝を固定し、右手で人差し指と花粉指で足を背屈させます(図4C、D)。
5. つま先で示された値を読み取ることにより、伸長の程度に注意してください。反対側の非照射脚についても同様の手順を行います。

6. 歩行機能指数の測定

1. げっ歯類の歩行軌跡を3Dプリントして、15cmの高さに吊り下げられた40cmの歩行経路を透明な床で作成します(図5)。トラックの下にビデオレコーダーを置き、撮影を開始します。カメラは、可能な限り高い解像度と毎秒60フレームの最小フレームレートでビデオを録画するように調整されています。
2. トラックの一方の端を開き、マウスを中に移します。動物がトラック上を自由に歩けるようにします。動物ができるだけスムーズに歩く様子を少なくとも3回は捉えます。
3. 次のマウスを録画する前に、ビデオの品質を確認してください。
4. ビデオプレーヤー、スクリーンショットアプリケーション、画像処理プログラム、およびスプレッドシートソフトウェアを使用して、ビデオをコンピューターに転送します。スクリーンショット機能を使用して、3つの異なる明確な足跡をキャプチャするための記録をご覧ください(図6)。
5. つま先スプレッド測定用の画像処理プログラムを開きます。上部パネルから 「ファイル 」を選択し、「 開く 」をクリックして、分析する画像を検索して表示します。
6. 上部パネルの2行目から [直線ツール ]を選択します(図7_1)。このツールを使用して、壁の幅をマークし、[ 分析] > [スケールの設定] をクリックし、既知の距離の正確な値を入力してスケールをキャリブレーションします (図 7_2-5)。
7. 直線ツールを使用して、さまざまな測定のフットプリントをマークし(図6C、D、1:足の長さ、2:つま先の内側の広がり、3:つま先の内側の広がり)、分析>測定を選択し、長さの値を記録します(図8)。
8. 照射した肢と照射していない肢の両方について解析を行います。以前に公開された次の式を使用して、機能^{を評価します 24}
   
   ここで、SFI = 坐骨神経機能指数、E = 実験的または負傷した足、N = 正常または負傷していない足、TS = つま先スプレッド、PL = プリント長さ。

7.安楽死

1. 対象物をCO₂ ライン接続されたボックスに移します。CO₂ 注入を開始して、チャンバー内の 30% から 70% の濃度に達します。5 Lチャンバーの場合、ガス注入は1.5〜3.5 L / minでなければなりません。
2. 動物が呼吸を止めるのを5〜10分間待ちます。頭蓋骨の基部から頭を所定の位置に保持し、尾²⁵をしっかりと引っ張ることにより、頸部脱臼によって安楽死させます。

8. 組織学とダウンストリーム解析 ¹⁷

1. 照射した後肢を引っ張って切除の準備をします。末端の皮膚の後面から2cm×1cmの領域を選択します。
2. 鋭利なハサミを使用して、皮膚サンプルを慎重に収集します。組織を長軸から半分に切り取り、2つの別々のピースを取得します。
3. 1つのティッシュピースを10%ホルマリン緩衝生理食塩水で固定します。固定組織を加工して、スライド上に組織切片を作製します。
4. 2枚目をドライアイスで満たされた箱に移し、タンパク質とRNAを保存します。その後、組織サンプルを-80°Cの冷凍庫に素早く移し、次の処理まで凍結しておきます。
5. スライドを染色して、ヘマトキシリンとエオシン(H&E)の染色、およびMassonのトリクローム染色を染色します。染色されたスライドを顕微鏡で視覚化し、10倍の倍率で画像を撮影します。歩行機能アッセイについて上記で説明したように、画像処理ソフトウェアを使用して上皮の厚さを測定します。

9. 統計学

1. データを平均±標準偏差として表示します。分散分析(ANOVA)とそれに続くボンフェローニの多重比較検定またはスチューデントt検定を使用して結果を評価します。

現在の照射プロトコルの確立と最適化により、マウスにおける線維症の一貫した再現性のある誘導が得られた。マウスの右肢を照射当日に放射線野内に位置して固定し、40Gyの放射線を投与した。

皮膚の機能障害の進行は、照射後、毎週画像を撮影することによって監視されました。写真は、最適化されたプロトコルが40日目までに95%の信頼度で?...

皮膚損傷は、放射線への偶発的または医学的治療関連の被曝の結果である可能性が高いです。原子炉は、人為的ミスやチェルノブイリや福島^26,27のような自然災害による偶発的な破損リスクを抱えています。がん治療のための治療薬による投与は最も一般的な曝露であり、治療部位に放射線関連線維症を引き起こすリスク?...

著者は、この作品に関連する競合する金銭的利益またはその他の利益相反を持っていません。

この研究は、国防総省 W81XWH-19-PRMRP-DA、NIAID/NIH Grant 5R21AI153971-02、および PSF/MTF Grant 603902 からの研究助成金によって資金提供されています。