인간 장내 미생물총(microbiota)에서 C-배당체 대사 효소를 특성화하기 위한 구조 생물학 및 분석 화학 접근법. 프로토콜. 하나는 단백질 생산과 정제입니다. 표현식 벡터의 구성.
NCBI에서 유전자 클러스터 서열 GenBank LC422372.1을 얻습니다. 유전자를 변형된 pET-28a 벡터로 복제합니다. 플라스미드를 E.coli BL21 DE3 수용 세포로 형질전환시킵니다.
그 후, 37도에서 밀리리터 카나마이신당 50마이크로그램으로 LB 배지에서 박테리아를 배양합니다. 박테리아 밀도 OD600이 0.6에 도달하면 0.2 밀리몰 IPTG를 배지에 첨가합니다. 박테리아를 16도에서 16시간 동안 배양합니다.
4도에서 4, 000 배 g의 박테리아 배양을 원심 분리하십시오. 상등액을 버리고 박테리아 펠릿을 유지하십시오. 박테리아 펠릿을 Buffer A.Purification of protein에 재현탁시킵니다.
박테리아 재현탁액에 1개의 밀리몰 PMSF를 추가합니다. 초음파 세포 차단기로 박테리아 현탁액을 용해시킵니다. 세균성 용해물을 48, 4개도에 40 분 동안 000 시간 g에 원심 분리하십시오.
니켈 친화성 크로마토그래피 NTA 컬럼을 사용하여 상등액의 단백질을 정제합니다. 결합된 단백질을 그래디언트에서 Buffer B로 용리합니다. 다음 단계를 위해 SDS-PAGE에서 UV 280 나노미터 흡수율이 높고 단백질 띠가 투명한 샘플을 수집합니다.
Buffer C.Purify에 대해 샘플을 투석하십시오. 이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 투석된 단백질을 정제합니다. Buffer C로 타겟 단백질을 컬럼에 결합하고, 결합된 단백질을 Buffer D 성분으로 용리합니다. 다음 단계를 위해 Buffer E.Collect 단백질 샘플과 함께 크기 배제 컬럼을 사용하여 단백질을 정제합니다.
단백질 샘플을 밀리리터당 20mg으로 농축하고 분취한 다음 액체 질소로 빠르게 동결합니다. 나중에 사용할 수 있도록 80도로 보관하십시오. UV 280 나노미터의 QuickDrop을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.
원형 이색법, CD, 스펙트럼 데이터 수집. 단백질을 1회 PBS 완충액, pH 7.4에서 밀리리터당 0.2mg으로 희석합니다. 기기 스캔 속도를 분당 50나노미터로 설정하고 스펙트럼 대역폭을 1나노미터로 설정합니다.
200 - 260 나노미터의 파장 범위에서 CD 스펙트럼 데이터를 수집합니다. PBS 배경을 빼고 세 가지 측정값의 평균값을 구합니다. 둘째, 단백질 결정학과 구조화된 결정입니다.
단백질 결정 성장 및 최적화. 48웰 결정 플레이트에서 단백질 결정화 키트를 사용하여 좌식 드롭 방법으로 결정화 초기 스크리닝을 수행합니다. 침전물 및 단백질 농도 구배를 설정하여 hanging-drop 방법을 사용하여 단백질 결정화를 최적화합니다.
완전한 성장 후 30분 동안 16도에서 저장 완충액과 표적 화합물을 포함하는 담금 용액으로 결정을 옮깁니다. 25%글리세롤이 보충된 결정화 완충액을 포함하는 동결 보호 용액으로 결정을 옮기고 데이터 수집을 위해 액체 질소에 즉시 보관합니다. 단백질 결정의 데이터 수집 및 구조화된 측정.
0.978 옹스트롬의 입사 파장을 사용하여 NFPS의 SSRF 빔라인에서 전체 X선 회절 데이터 세트를 수집합니다. 프로그램 결정학 데이터 처리 소프트웨어를 사용하여 처음에 결정 회절 데이터를 처리합니다. 자동 데이터 처리 프로그램을 사용하여 단계적으로 수행합니다.
자동 구조 모델 미세 조정 및 최적화를 위해 결정 구조 결정 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 셋째, 반응 활성 모니터링 및 운동 파라미터 측정. HPLC에 의한 DgpA/B/C 활성 모니터링.
C-글리코시드 절단 반응 시스템을 PBS 완충액, pH 7.4에서 DgpA/B/C 밀리리터 20마이크로몰, 망간 이온 리터당 1밀리몰, NAD 리터당 1밀리몰 1밀리몰, DTT 리터당 10밀리몰 및 기질, 푸에라린, 다이진, 게니스틴 리터당 0.1밀리몰을 포함합니다. 피펫팅으로 철저히 혼합하고 37도에서 8시간 동안 배양합니다. 반응 시스템에 메탄올 양의 3배를 첨가하여 반응을 종결합니다.
침전물을 제거하기 위하여 16, 000 시간 g에 15 분 동안 반응 해결책을 분리기. 0.22마이크로미터 필터 멤브레인을 사용하여 상층액을 여과합니다. 분당 1ml의 유속, UV 265나노미터의 검출 파장 및 10마이크로리터의 주입량으로 그래디언트 용리로 HPLC 분석을 수행합니다.
2, 6-디클로로페놀 인도페놀, DCPIP, 분석을 통한 DgpA 활성 모니터링. 1회 PBS 완충액, pH 7.4에서 리터 DCPIP당 0.8밀리몰, 리터당 50마이크로몰 단백질 및 리터당 10밀리몰 기판을 배양합니다. 20시간 반응 후 마이크로플레이트 리더를 사용하여 600나노미터에서 DCPIP의 흡광도 변화를 기록합니다.
푸에라린의 C-글리코시드 결합 절단 반응에 대한 포도당의 억제 속도 측정. 섹션 3.1에 설명된 대로 반응 시스템에 대한 다른 농도의 포도당에서 1회 PBS 완충액, pH 7.4에서 반응을 수행합니다. 37도에서 12시간 동안 반응을 수행합니다.
HPLC를 사용하여 생성된 제품의 정량 분석을 수행합니다. 운동 매개변수의 결정. 푸에라린의 농도는 리터당 0.01에서 4밀리몰로 설정되며, DgpA/B/C C-배당체 절단 반응에서 다이진과 게니스틴의 농도는 리터당 0.01에서 2밀리몰로 설정되었습니다.
섹션 3.1에 설명된 방법에 따라 37도에서 8시간 동안 반응을 수행합니다. 계산된 반응 속도와 기질 농도를 Prism의 Michaelise-Menten 모델에 피팅하여 Km 및 kcat kinetic 매개변수를 도출합니다. 넷, 반응 중간 생성물의 준비 및 검출.
반응 중간 생성물의 제조. daidzin 및 genistin을 기질로 사용하여 90ml의 반응 시스템으로 섹션 3.1에 설명된 방법에 따라 반응을 수행합니다. 분취용 액체 크로마토그래피 컬럼과 함께 분취용 HPLC를 사용하여 중간 생성물을 정제합니다.
나중에 사용할 수 있도록 진공 원심 농축기로 정제된 중간 생성물을 건조시킵니다. LC-MS를 사용한 반응 중간 생성물의 특성화. daidzin 및 genistin 반응에서 정제된 중간 생성물의 일부를 메탄올에 용해시켜 밀리리터당 50마이크로그램으로 각 화합물의 용액을 준비합니다.
13, 500회 g에서 10분 동안 원심분리기를 하고 LC-MS/MS 분석을 위한 발효액을 수집합니다. 주입량이 5마이크로리터인 LC-MS 분석을 위해 HPLC 분석과 동일한 그래디언트 용리 프로그램을 사용합니다. NMR을 사용한 반응 중간 생성물의 특성화.
양성자 및 탄소 13 NMR 분광법에 대해 dimethyl sulfoxide-deuterated six 에서 daidzin 반응에서 정제 된 중간 생성물의 일부를 용해시킵니다. 양성자에 대해 400메가헤르츠에서 NMR 기기의 NMR 스펙트럼을 기록합니다. 탄소 13에 대해 175메가헤르츠에서 NMR 기기의 NMR 스펙트럼을 기록합니다.
대표적인 결과. 전반적으로, 우리는 단백질 생산 및 정제, 결정화 실험, 활성 분석 및 그림 1의 반응 생성물 구조 식별을 포함하는 결합된 실험적 접근법을 설계했습니다. 구체적으로, 그림 2의 3단계 정제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피를 통해 고순도 단백질을 얻었습니다.
결정화 실험에서 우리는 그림 3A에서 D.3A에서 D.1 옹스트롬까지 각각 2.7 옹스트롬 및 2.1 옹스트롬의 분해능을 가진 DgpA의 결정 구조를 결정했으며, DgpA는 그림 3B 및 C의 헥사메릭 형태로 자동 억제 확인을 채택한다는 것을 추가로 발견했습니다. 다음으로, 우리는 그림 3E에서 포도당이 DgpA의 기질 인식 포켓에서 주요 아미노산과 수소 결합 네트워크를 형성한다는 것을 발견했습니다. 이를 바탕으로 돌연변이를 설계하고 그림 3J의 운동 매개변수를 사용하여 기질 절단 활성을 평가했습니다.
흥미롭게도, O-글리코시드 플라보노이드와 DgpA/B/C의 절단 동안, 우리는 그림 4A와 B에서 중간 화합물의 형성을 관찰했습니다.이 중간체는 그림 4C에서 H까지의 NMR 및 LC-MS 분석을 통해 C-글리코시드 플라보노이드로 확인되었으며, 이는 DgpA/B/C가 O-배당체를 C-배당체로 변환할 수 있음을 나타냅니다. 우리는 C-배당체 대사 효소의 구조와 기능적 특성을 연구하기 위해 화학과 생명 공학의 통합을 개척하여 이것이 합리적이고 실용적인 솔루션임을 입증했습니다. 이 접근 방식은 해당 분야의 연구 방법론의 격차를 메우고 다른 대사 기능을 가진 다른 유전자에 쉽게 적용할 수 있습니다.
따라서 다른 장내 미생물 기능 단백질의 구조적 및 기능적 특성에 대한 향후 연구를 위한 새로운 참조 모델을 제공합니다.
