Abordagens de biologia estrutural e química analítica para caracterizar enzimas metabólicas de glicosídeos C na microbiota intestinal humana. Protocolo. Um, produção e purificação de proteínas. Construção do vetor de expressão.
Obtenha a sequência de agrupamento de genes GenBank LC422372.1 do NCBI. Clone os genes em um vetor pET-28a modificado. Transforme os plasmídeos em células competentes para E.coli BL21 DE3.
Posteriormente, cultivar a bactéria em meio LB com 50 microgramas por mililitro de canamicina a 37 graus. Adicione 0,2 milimoles IPTG ao meio quando a densidade bacteriana OD600 atingir 0,6. Cultive a bactéria a 16 graus por 16 horas.
Centrifugar a cultura bacteriana a 4 000 vezes g a quatro graus. Rejeitar o sobrenadante e reter o sedimento bacteriano. Ressuspenda o pellet bacteriano no tampão A.Purificação da proteína.
Adicione um PMSF milimol à ressuspensão bacteriana. Lise a suspensão de bactérias por um disjuntor de células ultrassônico. Centrifugar o lisado bacteriano a 48 000 vezes g durante 40 minutos a quatro graus.
Purificar a proteína do sobrenadante utilizando a coluna NTA de cromatografia de afinidade de níquel. Eluir a proteína ligada com o tampão B em um gradiente. Colete amostras com alta absorção de UV de 280 nanômetros e bandas de proteína transparentes do SDS-PAGE para a próxima etapa.
Dialize as amostras contra o tampão C. Purifique a proteína dialisada usando uma coluna de cromatografia de troca iônica. Ligue a proteína alvo à coluna com o tampão C. Elua a proteína ligada com o ingrediente tampão D. Purifique a proteína usando uma coluna de exclusão de tamanho com o Tampão E.Colete amostras de proteína para a próxima etapa.
Concentre as amostras de proteína a 20 miligramas por mililitro, alíquota, congele-as rapidamente com nitrogênio líquido. Armazene-o a 80 graus para uso futuro. Meça a concentração de proteína usando QuickDrop com UV 280 nanômetros.
Dicroísmo circular, CD, coleta de dados de espectro. Dilua as proteínas a 0,2 miligramas por mililitro em um tampão PBS de uma vez, pH 7,4. Defina a velocidade de varredura do instrumento para 50 nanômetros por minuto e a largura de banda espectral para um nanômetro.
Colete dados espectrais de CD na faixa de comprimento de onda de 200 a 260 nanômetros. Subtraia o fundo do PBS e obtenha o valor médio de três medições. Dois, cristalografia de proteínas e determinação estruturada.
Crescimento e otimização de cristais de proteínas. Realize a triagem inicial de cristalização com o método de gota sentada usando os kits de cristalização de proteínas em placas de cristal de 48 poços. Defina os gradientes de precipitante e concentração de proteína para otimizar a cristalização de proteínas usando o método de gota suspensa.
Transfira os cristais para uma solução de imersão contendo tampão reservatório e compostos-alvo a 16 graus por 30 minutos após o crescimento completo. Transfira os cristais para uma solução crioprotetora contendo tampão de cristalização suplementado com 25% de glicerol e imediatamente armazenado em nitrogênio líquido para coleta de dados. Coleta de dados e determinação estruturada de cristais de proteínas.
Colete o conjunto completo de dados de difração de raios-X nas linhas de luz do SSRF do NFPS usando comprimentos de onda incidentes de 0,978 angstroms. Processe os dados de difração de cristal inicialmente usando o software de processamento de dados cristalográficos do programa. Executar faseamento usando um programa de processamento automático de dados.
Use o software de determinação de estrutura cristalina para refinamento e otimização automática do modelo de estrutura. Três, monitoramento da atividade de reação e determinação de parâmetros cinéticos. Monitoramento da atividade de DgpA/B/C por HPLC.
Monte o sistema de reação de clivagem do glicosídeo C em tampão PBS, pH 7,4, contendo 20 micromoles por mililitro DgpA/B/C, um milimoles por litro de íon manganês, um milimoles por litro NAD, 10 milimoles por litro de DTT e 0,1 milimoles por litro de substrato, puerarina, daidzina, genistina. Misture bem pipetando e incube a 37 graus por oito horas. Adicione três vezes a quantidade de metanol ao sistema de reação para encerrar a reação.
Centrifugar a solução de reacção a 16 000 vezes g durante 15 minutos para eliminar o precipitado. Filtrar o sobrenadante utilizando uma membrana filtrante de 0,22 micrómetros. Realize a análise de HPLC com eluição de gradiente a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto, comprimentos de onda de detecção de UV 265 nanômetros e um volume de injeção de 10 microlitros.
Monitoramento da atividade de DgpA com ensaio de 2, 6-diclorofenol indofenol, DCPIP. Incube 0,8 milimoles por litro de DCPIP, 50 micromoles por litro de proteína e 10 milimoles por litro de substrato em tampão PBS de uma vez, pH 7,4. Após 20 horas de reação, registre a mudança de absorbância do DCPIP a 600 nanômetros usando um leitor de microplacas.
Determinação da taxa de inibição da glicose na reação de clivagem da ligação C-glicosídica da puerarina. Efectuar a reacção em tampão PBS de uma só vez, pH 7,4, a diferentes concentrações de glicose no sistema de reacção, conforme descrito na secção 3.1. Realize a reação a 37 graus por 12 horas.
Realizar análise quantitativa dos produtos gerados usando HPLC. Determinação de parâmetros cinéticos. A concentração de puerarina é fixada de 0,01 a quatro milimoles por litro, e a de daidzina e genistina foi de 0,01 a dois milimoles por litro na reação de clivagem do glicosídeo C DgpA/B/C.
Efectuar a reacção a 37 graus durante oito horas de acordo com o método descrito no ponto 3.1. Derive os parâmetros cinéticos Km e kcat ajustando a taxa de reação calculada e a concentração do substrato a um modelo de Michaelise-Menten no Prism. Quatro, preparação e detecção do produto intermediário da reação.
Preparação do produto intermediário de reação. Utilizar daidzina e genistina como substratos para efectuar a reacção de acordo com os métodos descritos no ponto 3.1 com um sistema de reacção de 90 ml. Purificar o produto intermédio com uma HPLC preparativa com uma coluna de cromatografia líquida preparativa.
Seque os produtos intermediários purificados com um concentrador centrífugo a vácuo para uso futuro. Caracterização do produto intermediário da reação com LC-MS. Dissolver em metanol uma porção dos produtos intermédios purificados das reacções daidzina e genistina, a fim de preparar soluções de cada composto a 50 microgramas por mililitro.
Centrifugue a 13.500 vezes g por 10 minutos e colete os uspernatantes para análise LC-MS/MS. Use o mesmo programa de eluição de gradiente da análise por HPLC para análise LC-MS com um volume de injeção de cinco microlitros. Caracterização do produto intermediário da reação com RMN.
Dissolver uma parte dos produtos intermédios purificados da reacção daidzina em seis deuterados com dimetilsulfóxido, para espectroscopia de RMN de protões e carbono 13. Registre os espectros de RMN em um instrumento de RMN a 400 megahertz para um próton. Registre os espectros de RMN em um instrumento de RMN a 175 megahertz para carbono 13.
Resultados representativos. No geral, projetamos uma abordagem experimental combinada que inclui produção e purificação de proteínas, experimentos de cristalização, ensaios de atividade e a identificação de estruturas de produtos de reação na figura um. Especificamente, obtivemos proteínas de alta pureza por meio de cromatografia de purificação em três etapas, cromatografia de troca iônica e cromatografia de filtração em gel na figura dois.
Nos experimentos de cristalização, determinamos as estruturas cristalinas de DgpA, e o complexo DgpB/C com resoluções de 2,7 angstroms e 2,1 angstroms, respectivamente, na figura 3A a D. Descobrimos ainda que o DgpA adota a confirmação auto-inibida em sua forma hexamérica nas figuras 3B e C, o que foi validado usando o ensaio de redução DCPIP na figura 3F. Em seguida, descobrimos que a glicose forma uma rede de ligações de hidrogênio com aminoácidos chave na bolsa de reconhecimento de substrato de DgpA na figura 3E. Com base nisso, projetamos mutantes e avaliamos sua atividade de clivagem do substrato usando parâmetros cinéticos na figura 3J.
Curiosamente, durante a clivagem de flavonóides O-glicosídicos e DgpA/B/C, observamos a formação de compostos intermediários nas figuras 4A e B. Esses intermediários foram identificados como flavonóides C-glicosídicos por meio de análise de RMN e LC-MS na figura 4C a H, indicando que DgpA/B/C pode converter O-glicosídeos em C-glicosídeos. Fomos pioneiros na integração da química e da biotecnologia para estudar a estrutura e as características funcionais das enzimas do metabolismo dos glicosídeos C, demonstrando que esta é uma solução razoável e prática. Essa abordagem preenche lacunas nas metodologias de pesquisa dentro do campo e pode ser facilmente aplicada a outros genes com diferentes funções metabólicas.
Portanto, também fornece um novo modelo de referência para estudos futuros sobre as características estruturais e funcionais de outras proteínas funcionais microbianas intestinais.
