Dr. Rawi Ramautar would like to acknowledge the financial support of the Veni grant scheme of the Netherlands Organization of Scientific Research (NWO Veni 722.013.008).

참고 : 신진 대사 프로파일 링 연구를위한 쉬스 CE-MS의 사용을 여기에 설명 된 프로토콜은 연구용으로 만 사용됩니다. 아래에 설명 된 절차는 최근에 출판 된 작품의 4,5을 기준으로합니다. 또한 실험적인 세부 사항은이 논문에서 찾을 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 이 프로토콜에 설명 된 실험을 수행 할 때, 보호 안경, 실험실 코트와 장갑을 포함한 모든 적절한 실험실 안전 절차를 사용하십시오. 시약 솔루션 및 예제 1. 준비 <ol><li> 백그라운드 전해질의 제조 (BGE) <ol><li> 새로운 BGE 용액 (10 % (V / V) 아세트산의 pH 2.2)을 매일 준비한다. </li><li> 10 mL 유리 바이알에 9.0 mL의 물을 추가하고 흄 후드에서 물에 아세트산 1.0 mL로 추가한다. 충분히 와류를 사용하여 용액을 혼합한다. </li></ol></li><li> 대사 standar을 제조D 혼합물 <ol><li> 물 50 ㎕를 60 양이온 대사 물질을 함유하는 50 μM 양이온 표준 혼합물 50 μl를 잘 용해 용액을 혼합한다. -80 ° C에서 보관 사용하지 않을 때입니다. </li><li> 물 50 μL에 30 음이온 대사 물질을 함유하는 50 μM 음이온 표준 혼합물 50 μl를 잘 용해 용액을 혼합한다. 사용하지 않을 때에는 -80 ° C에서, 동일한 표준 혼합물의 동결 / 해동 사이클을 방지하기 위해 분량 씩,이 용액을 저장한다. 참고 : -80 ° C에서 제대로 저장 될 때 표준 혼합물 3 개월 동안 안정되어 대사 산물. </li></ol></li><li> 아교 모세포종 세포주 추출물의 제조 <ol><li> 1 ㎖의 얼음처럼 차가운 0.9 % 식염수 (21)로 접착 인간 U-87 MG 아교 모세포종 세포를 세 번 세척 하였다. </li><li> 자기편 셀에 2 ml의 얼음처럼 차가운 메탄올 / 물 용액 (8/2, v / v)의 추가 및 고무 세포 스크레이퍼 (21)를 밀고 사용 쳤어요. </l난&gt; <li> 2 분 동안 메탄올 / 물 튜브 용액 및 초음파 처리를 수집합니다. </li><li> 16,100 XG, 4 ° C에서 10 분 동안 메탄올 / 물 분획 (최종 비율 8/8/2, V / v / v)로 원심 분리기에 샘플을 클로로포름을 추가합니다. </li><li> 메탄올 / 물 층을 수집하고 진공 농축기를 사용하여이 부분을 증발. 쉬스 CE-MS에 의해 분석을 위해 50 μl의 물에 건조 된 자료를 복원합니다. 때 사용 -80 ° C에서 샘플을 보관하지. </li></ol></li></ol> 2. 쉬스 CE-MS 시스템 설정 <ol><li> 다공성 팁 터와 베어 융합 실리카 카트리지의 설치 <ol><li> 은 CE 기기의 다공성 팁 터 (30 μm의 내경 X 90cm 총 길이)로 새로운 베어 융합 실리카 카트리지를 놓습니다. </li><li> 100 % 메탄올을 사용하여 CE 기기를 제어하는 ​​소프트웨어와 함께 15 분 동안 50 psi에서 앞으로 린스를 적용하고 시각적으로 액체가 capil로부터 유출되었는지 확인이 헹굼 단계에서 라히 콘센트. 시각적으로 액체가 모세관 도전성로부터 유출되는지 여부를 검사 할 BGE 용액을 사용하여 5 분 동안 50 psi에서 역방향의 헹굼을 수행한다. </li><li> 어떠한 액적 형성 모세관 출구에서 관찰되지 않은 경우에는 100 psi의 압력에서의 단계를 반복 2.1.2. 어떤 액체 방울 형성이 단계 동안 관찰되지 않은 경우 새로운 베어 융합 실리카 카트리지를 설치합니다. </li><li> 10 분 동안 50 psi에서 물에 10 분 동안 50 psi에서 0.1 M NaOH를 다음 10 분 동안 50 psi에서 물을 분리 모세관 헹구고 10 분 동안 마지막 BGE와 50 PSI. 주 : 2.1.4 2.1.1까지 단지 새로운 모세관 카트리지의 설치에 필요한 단계. </li></ol></li><li> ESI-MS에 모세관 다공질 팁 이미 터 결합 참고 : MS 기기 교정 및 CE 시스템에 연결되어 있는지 확인, MS에 CE 모세관을 연결하기 전에. 에 ESI 전압을 설정0의 nanospray 소스와 MS 장비를 장착한다. 가스 한 기체 (2)와 인터페이스 히터 온도는 5 psi에서 1500 V. 세트 커튼 설정 이온 분무 전압을인가하여 발생하는 매우 낮은 유속으로 ESI 적용되지 않았다. <ol><li> 물 관에서 융합 실리카 카트리지의 스프레이 팁을 제거하고 MS 기기에 연결하기위한의 nanospray 소스 어댑터에 설치합니다. 은 CE 기기에서 BGE 튜브의 높이가 스프레이 팁의 높이를 일치하는지 확인합니다. </li><li> 5 분 동안 50 psi에서 BGE와 린스에 의해 도전 모세관을 통해 액체의 흐름을 확인합니다. 이 세정 동안 ESI 분무기 바늘의 기지에서 드롭 형성이 관찰해야 단계. </li><li> 순방향으로 10 분 동안 50 psi에서 BGE와 분리 모세관 플러시. 드롭 형성은이 단계에서 다공성 팁 터 (스프레이 팁)의 끝에서 관찰해야한다. </li><li> (C)의 거리에서 MS 입구의 입구 다공성 팁 이미 터를 배치IRCA 2mm 3. </li><li> 1 분의 램프 시간을 이용하여 30 kV로의 전압을인가하고 65 0 먼저 ESI 전압을 이용하여 대사 프로파일 링 연구 1,000 m / z에 대한 m / z 범위에서 MS 데이터를 취득 시작한다. 참고 : 더 전기 분무가 없을 것 같이 질량 스펙트럼 신호의 무효합니다. </li><li> 데이터 측정을 계속하는 동안 1000 V에 ESI 전압을 설정합니다. 일정한 배경 신호까지 200 V의 증가와 함께 ESI 전압을 증가 적어도 15 분 동안 관찰된다. </li><li> 최대 가장 안정한 MS 신호 (총 이온 electropherogram)를 제공하는 위치를 참조하기 위해, X, Y 또는 Z 방향으로 이동하여 MS 입구의 중심에 대하여 다공질 팁 이미 터의 위치를 ​​최적화한다. </li><li> 다공질 팁 이미 터의 위치를 ​​최적화하고 최적 ESI 전압을 결정한 후 0 V로 ESI 전압을 설정하고, 5 분의 램프 시간을 사용하여 1 kV의 30 kV로에서 CE의 전압을 감소시킨다. </li><li> 석사 방법 날기 만들기g 최적 ESI 전압 및 대사 산물 표준 및 생체 시료의 분석을위한 CE 기기에 CE 방법. </li></ol></li></ol> 대사 표준 및 생물학적 샘플 3. 분석 <ol><li> 쉬스 CE-MS 시스템의 성능 평가 <ol><li> 전송할 CE 유리 병에 맞는 입구 샘플 트레이에이 병을 넣어 빈 100 μL의 microvial (PCR 유리 병)에 음이온 성 대사 산물 표준 혼합물의 20 μL. 참고 : 신뢰할 수있는 주사에 대한 microvial에 필요한 최소 부피는 2 μL이다. <ol><li> 단계 2.2.9 중 작성된 MS의 인수 음이온 모드 방법을 시작하고 이후 CE 기기를 제어하는 ​​소프트웨어를 사용하여 CE 시퀀스를 시작합니다. </li><li> 10 psi에서 1.0 BGE 주입 후 60 초에서 2.0 psi에서 주입 한 다음 3 분 동안 50 psi에서 BGE와 분리 모세관 린스 (NL 20 모세관 체적의 3 %에 해당) 및비서. 주 :이어서, MS의 데이터 획득이 트리거된다. </li><li> 입구에서 30 분 동안 0.5 PSI의 압력으로 1.0 분의 램프 시간과 -30 kV로의 전압을인가한다. 30 분 전기 영동 분리 후, MS 데이터 취득을 중지하고 (전기 영동 분리 다공질 팁 모세관 터의 내구성을 향상 후 CE 전압의 점진적인 감소)을 5 분의 램프 시간을 사용 -1 kV의 세륨 전압을 감소시킨다. </li></ol></li><li> 샘플 주사 사이에, 3 분 동안 30 psi에서 물과 모세관, 0.1 M 수산화 나트륨, 물 및 BGE 각각 헹군다. </li><li> 이주 회 분석 음이온 대사 혼합물의 신호 강도를 측정함으로써, 기록 된 데이터를 분석한다. </li><li> 음이온 성 대사 산물 표준은 10, 28 분 사이의 영역에 표시할지 여부를 평가합니다. </li><li> 세 개의 구조적으로 관련된 이성체, 즉, D- 글루코스 -1- 인산, D- 포도당 -6- 인산과 D- 과당 -6- 인산이 있는지 확인일부 분리, 즉 처음 두 피크 사이의 해상도는 0.75 경이고 마지막 두 피크들 (도 1 참조) 0.50 년경이다. 주 : 1.5의 해상도는 두 개의 인접한 피크의베이스 라인 분리를 나타냅니다. </li><li> 반복 3.1.1 및 양이온 성 대사 산물 혼합물 3.1.2 단계를 반복합니다. MS 검출 긍정적 인 이온 모드에 있으며 CE 전압이 30 kV로 있는지 확인합니다. </li><li> 이주 회 분석 양이온 대사 혼합물의 신호 강도를 측정함으로써, 기록 된 데이터를 분석한다. </li><li> 양이온 성 대사 산물 표준 8과 22 분 사이의 영역에 표시할지 여부를 평가합니다. 이소류신과 루신 (15) 사이에 15.5 분을 마이그레이션 여부를 확인하고 해상도가 0.5 년경 있는지 확인. </li></ol></li><li> 생물학적 샘플 분석 <ol><li> 반복 3.1.1과 아교 모세포종 세포주의 추출물의 음이온 성 대사 프로파일 3.1.2 단계를 반복합니다. 참고 : 대사 콘시료 전처리 후의 텐트 20 셀 / NL 년경의 셀 밀도에 대응하고, 따라서, 20 NL 주입 분석 당 400 세포에 상응한다. . </li><li> 5 MDA 질량 정확도를 사용하여 대사 젖산 (m / z 89.0243)에 대한 추출 이온 electropherogram를 생성하고 신호 강도가 10 만 카운트 이상 여부를 확인합니다. </li><li> 반복 3.1.1과 아교 모세포종 세포주의 추출물의 양이온 대사 프로파일 3.1.2 단계를 반복합니다. 참고 : 매우 풍부한 정보 전체 이온 electropherogram이 모드에서 20 NL 주사 관찰해야한다. </li><li> 분석하거나 사용하지 후, 15 분 동안 50 psi에서 물과 모세관 헹구고 바이알 함유 물과 같은 물을 함유하는 튜브의 다공질 부 (배출 부)에서 모세관의 입구 부분을 저장한다. </li></ol></li></ol>

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We have nothing to disclose.

다공성 팁 이미 터를 사용하는 쉬스 CE-MS 방법은 높은 극성 및 대전 대사 분석을 위해 제공되었다. 이 방법의 독특한 특징은 음이온 성 또는 양이온 성 대사 산물에만 MS 검출 및 CE 전압의 극성을 전환함으로써 프로파일 될 수 있다는 것이다. 생물학적 시료에서 매우 극성 하전 대사 광범위한 구조적으로 유사한 대사에 중요한이며, (낮은) 나노 몰 범위의 검출 한계가 높은 분리 효율로 분석 될 수있다. 제시된 프로토콜은 생물학적 샘플의 대사 프로파일 링 방법의 유용성을 예시하기 위해 세포 추출물의 대사 프로파일 링 쉬스 CE-MS의 사용에 초점을 맞추었다. 여기에 설명 된 방법은 또한 적당한 시료 전처리 과정이 사용된다는 것을 고려할 인간 소변 5 생물학적 샘플, 다른 유형의 대사 프로파일을 위해 사용될 수있다. 쉬스 CE-MS 운전 방식D는 CE의 본질 저 유량 특성의 이용을 허용하는 다공성 이미 터 선단에 기초한다. 이러한 맥락에서 안정 ESI 신호 재현성 프로파일 대사 연구를위한 필수 조건이다. 따라서, 스프레이 팁이 제대로 MS 입구 앞에 위치되는 것이 중요하다. 이 셋업에서, 상기 ESI 프로세스는 BGE의 특성에 주로 의존하며, 따라서 BGE 최적화가 중요하다. 쉬스 구성 시스 - 액체 조성물의 모든 종류의 이온화 효율을 향상시키기 위해 첨가 될 수있는 시스 - 액체 CE-MS 시스템에 비해 적은 다재다능하다. 쉬스 ESI 분무기 바늘이 완전히 전도성 액체 (즉, BGE 용액)으로 가득해야합니다. 불안정한 ESI 신호는 부분적으로 또는 완전히 연결 모세관에서 발생할 수 있습니다. BGE와 높은 압력에서 세척하면이 문제를 해결할 수 있습니다. 그렇지 분리 모세관 교체 될 필요가있다. 전에 분석 성능 평가 안정한 ESI 배경 신호일일에서 다른 일치하는 첫 번째 생성해야합니다. 프로파일 대사 연구를위한 쉬스 CE-MS 법의 해석 성능 대사 표준 혼합물을 사용하여 매일 체크 할 필요가있다. 동일한 실험 조건 하에서, 일관된 이동 시간, 즉 3 % 미만의 편차 이내 일 (N = 10) 사이 일 (N = 5) 대사 산물 표준 혼합물 (12.5 μM)의 20 NL 주입하여 피크 높이 / 지역 (15 % 이하 변화) 및 (60,000과 400,000 사이의 범위) 판 번호를 얻을 수 있습니다. 검출 한계는 대부분의 대사 산물 표준에 대한 나노 몰 범위에 있어야합니다. 만 이러한 기준이 충족 될 때 생물학적 시료의 대사 프로파일 링을위한 준비 방법입니다. 상기 MS 악기 튜닝 할 필요가없는 경우에 재 교정 다공질 팁 모세관 터 변경 될 필요가있다. 분석 CE-MS 사이의 효과적인 세척 단계에뿐만 아니라, 높은 중요하다전위 잔효를 방지 할뿐만 아니라 분리 성능을 유지한다. 잠재적 이월는 샘플에 오염 때문에 새로운 BGE 튜브와 교체에 의해 해결 BGE 유리 병으로 인해 발생할 수 있습니다. 쉬스 CE-MS 법을 사용하지 않을 때, 분리 모세관을 분리하고 물에 모세관 모세관 수명을 연장하기 위해 물을 함유하는 튜브의 보호 슬리브로 침수 외부의 입구 측을 저장하는 것이 중요하다. 이 프로토콜에보고 된 절차에 따라 사용될 때 요약 제안 쉬스 CE-MS 방법은 생물학적 샘플의 대사 프로파일을위한 강력한 전위를 나타낸다. 이 단계에서, 실험실 간 비교 데이터가 확실히 대사 체학이 접근법의 (장기) 재현성 및 안정성을 평가하기 위해 쉬스 CE-MS 필요하다. 이 프로토콜은 그러한 연구를 촉진 할 수있다. 다양한 분석 과제는 여전히 고려 될 필요가있다. 최적의 반환 한에 대한필요치 않는 상기 CE 전류는 바람직하게는 5 이하 μA 모세관 다공질 팁 터에만 높은 처리량 검정법의 개발을 방해 할 수 91cm의 길이로 제공되며,이 단계에서 유지되어야한다. 또한, 낮은 pH 분리 버퍼는 구조적으로 관련된 당 포스페이트의 초기 분리를 달성하기위한 최적의하지 않을 음이온 대사 프로파일 링에 사용 하였다. 중요는 음이온 성 대사 산물 (부분적으로) 사용에 부정적인 분리 조건하에 충전되는 분석 할 수 있다는 것이다. 다음 단계는 현재이 임상 대사 프로파일 링 연구위한 쉬스 CE-MS 방법의 유용성을 평가하는 하나의 다공성 팁 모세관 에미는 최대 100 생물학적 시료의 분석에 사용될 수있다. 전반적으로, 쉬스 CE-MS 방식의 발전은의 생물학적 기능의 깊은 이해를 향해, 즉 대사 체학의 분야에서 새로운 방향을 엽니 다충분한 제한의 경우.

현대 대사 체학에서 상한 분석 분리 기술은 대표적인를 얻기 위해 대사 산물 클래스 다양한 분석에 사용되는 것은 생물체 하나의 생리적 상태의 아웃 읽었다. 대사 체학 연구의 궁극적 인 목적은 주어진 생물학적 / 임상 질문에 대한 답을 얻는 것이다. 현재, 인간의 대사 체 데이터베이스는 내인성 및 외인성 모두 화합물 (영양소, 미생물, 마약 및 기타 소스에서 후자의 발신)를 대표하는 40,000 개 이상의 대사 산물의 항목으로 구성되어 2. 물리 화학적 특성 및 이러한 대사 물질의 농도 범위에서 큰 다양성을 주어 다른 분리 메카니즘 여러 분석 기법은 주어진 생물학적 샘플에서 가능한 많은 대사 프로파일을 위해 함께 사용한다. 예를 들어,은 등 Psychogios. 대사 교수 다섯 분석 분리 기술의 조합을 사용4,000 개 이상의 화학적으로 다양한 대사 산물 3의 검출 결과 인간 혈청의 iling. 본 논문에서는 관심 생물학적 시료 4,5의 대사 프로파일 링을 위해 최근에 개발 된 CE-MS 전략에 지급됩니다. CE에서,보다 구체적으로, 모세관 영역 전기 영동 (CZE; 일반적 CE라고한다)는, 화합물은 따라서,이 분석 방법은 극성 및 대전 대사 분석에 매우 적합 그들의 전하로 크기의 비율에 기초하여 분리된다. CE 분리기구하여 생물학적 시료 6-8의 대사 조성물에 상보적인 뷰를 제공 크로마토 그래프 - 기반의 기술과 근본적으로 상이하다. 소와 동료들은 생물학적 시료 9, 10의 대사 산물의 글로벌 프로파일 링을위한 CE-MS의 유틸리티를 보여 처음이었다. 지금까지 대사 체학을위한 CE-MS의 가능성과 유용성이 널리 11-15을 입증하고있다.CE는 일반적으로 기술 (16, 17)을 인터페이싱 시스 액체를 통해 MS에 결합되고; 그러나, 시스 액에 의한 모세관 배출물의 희석으로, 검출 감도가 본질적으로 손상된다. 최근에는 고전 외피 - 액체 계면 5,18,19을 이용한 CE-MS에 비해 쉬스 인터페이스의 사용은 상당히 다양한 생물학적 시료에 존재하는 대사 물질의 검출 범위를 개선하는 것이 증명되었다. 약 300 분의 기능은 시스 - 액체 CE-MS (5)으로 관찰 한 반면, 예를 들어, 900 년경 분자 기능 쉬스 CE-MS에 의해 인간의 소변에서 검출되었다. 사용되는 쉬스 인터페이스는 나노 ESI-MS와 함께 CE의 본질적 저 유량 특성의 효과적인 사용을 허용, Moini (20)에 의해 발명 된 다공성 팁 터에 근거했다. 대사 체학 분야 쉬스 CE-MS의 사용을 촉진하기 위해,프로토콜은 아교 모세포종 세포주 추출물의 분석에 예시 된 바와 같이이 방법은 생물학적 시료에서 매우 극성 대사 산물의 해석에 사용하는 방법을 설명하기 제시된다. 양이온 대사 산물의 프로파일을위한 쉬스 CE-MS 방법도 이에 분석 시간을 줄이고의 글로벌 프로파일에 대한 단일 분석 플랫폼을 제공 동일 모세관 분리 조건을 이용하여 음이온 성 대사 산물의 프로파일을 위해 사용될 수 있음을 나타낸다 충전 대사. 프로토콜은 또한 MS 장비와 쉬스 다공질 팁 이미 터의 유효 정렬 전략을 설명한다.

<table><tbody><tr><td>CESI 8000 instrument</td><td>Sciex</td><td>A98089</td><td>OptiMS adapter required to couple CESI to MS</td></tr><tr><td>OptiMS Fused-Silica Cartridge, 30&amp;nbsp;&amp;mu;m ID x 90&amp;nbsp;cm total length</td><td>Sciex</td><td>B07367</td><td></td></tr><tr><td>OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td><td>Sciex</td><td>B07363</td><td></td></tr><tr><td>CESI vials</td><td>Sciex</td><td>B11648</td><td></td></tr><tr><td>Micro vials</td><td>Sciex</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td>Use in fume hood</td></tr><tr><td>Cationic metabolite mixture</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>H3304-3034</td><td></td></tr><tr><td>Anionic metabolite mixture</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>H3304-1031</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (LC-MS Ultra Chromasolv)</td><td>Sigma</td><td>14262</td><td>Use in fume hood</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide solution</td><td>Sigma</td><td>72079</td><td>0.1 M</td></tr><tr><td>U-87 MG Glioblastoma cell line</td><td>Sigma</td><td>89081402</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>650498</td><td>Toxic; use in fume hood</td></tr></tbody></table>

sheathless capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry for metabolic profiling of biological samples

대사 체학에서, 분석 기술의 다양한 복잡한 샘플 (내인성) 대사의 글로벌 프로파일에 사용된다. 본 논문에서는 프로토콜은 모세관 전기 영동 - 질량 분석 (CE-MS)에 의해 생물학적 시료에서 음이온과 양이온 성 대사 산물의 분석을 위해 제공됩니다. 화합물들은 전하로 크기의 비율에 기초하여 분리 될 때 CE는 극성이 높은 충전 및 대사 산물의 분석에 적합하다. 최근에 개발 된 쉬스 인터페이스 디자인, 즉, 다공질 팁 인터페이스 이온화 (ESI) MS 전기 분무를 위해 CE 결합에 사용된다. 이 인터페이스 방식은 극성 대사 클래스의 광범위한 나노 몰 검출 한계의 결과로, MS와 함께 CE의 본질적 저 유량 특성의 효과적인 사용을 할 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 분석을 위해 낮은 pH를 분리 조건에서 다공성 팁 이미 터와 베어 융합 실리카 모세관을 이용에 근거생물학적 시료에서 대사 클래스의 광범위한. 동일한 쉬스 CE-MS 방법 만 MS 검출을 스위칭하여 당 포스페이트, 뉴클레오티드 및 유기산을 포함한 아미노산 클레오 작은 펩티드 또는 음이온 대사를 포함한 양이온 성 대사 산물의 프로파일을 위해 사용될 수 있음을 입증한다 분리 전압 극성. 뇨, 뇌척수액 및 교 아세포종 세포주 추출물과 같은 다양한 생물학적 시료에서 매우 풍부한 정보 대사 프로파일은 CE-MS 분석의 1 시간이 프로토콜에 의해 얻을 수있다.

제안 쉬스 CE-MS 방법은 고효율 제공 할 수있다, 즉, 60,000에서 400,000 범위의 플레이트 번호 BGE로서 10 % 아세트산 (PH 2.2)를 사용하여 나노 몰 검출 한계의 음이온 및 양이온의 대사에 대한 정보. 극성이 높은 음이온 성 대사 분석에있어서의 분리 성능은 세 구조적으로 관련된 당 인산 이성질체 (도 1)에 대해 설명된다. 기준선 분리가 세 가지 분석 물질에 대해 획득되지 않았지만, 부분이 분리 분석이 동일한 정확한 질량을 가지고 MS에 의해 자신의 선택적 검출을 허용하기에 충분하다. 세포의 제한된 수의 대사 프로파일을위한 쉬스 CE-MS 법의 전위, 즉 20 NL 사출 400 셀에 대응하는 (셀 밀도는 20 셀 / NL 경 임) 추출물 양이온 대사 분석을 위해 설명된다 아교 모세포종 세포주 (300 개 이상의 분자 기능은 S / N-비율 ≥ 5 위에 검출 된 그림 2). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig1.jpg" /> 음이온 모드에서 쉬스 CE-MS로 얻은 세 설탕 인산 이성질체 (25 μM)에 대한 쉬스 CE-MS. 추출 이온 electropherogram에 의해 분석 설탕 인산 이성질체의 그림 1. 실험 조건 : BGE, 10 % 아세트산 (PH 2.2); 분리 전압, -30 kV의 (+0.5의 PSI는 CE 모세관의 입구에 적용); 샘플 주입, 60 초 동안 2.0 PSI. 권한 4 재현. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54535/54535fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig2.jpg" /> 이소류신 및 L 그림 2. 분석양이온 모드 쉬스 CE-MS로 수득 개의 아미노산 이성질체 (25 μM)의 쉬스 CE-MS. 추출 이온 electropherogram 의해 eucine. 실험 조건 : BGE, 10 % 아세트산 (PH 2.2); 분리 전압은 30 kV로; 샘플 주입, 60 초 동안 2.0 PSI. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54535/54535fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig3.jpg" /> 세포주 추출물에서 양이온 성 대사 산물 프로파일 링 쉬스 CE-MS 그림 3. 잠재적. 대사 프로파일 (총 이온 electropherogram) 양이온 모드 쉬스 CE-MS와 아교 모세포종 세포주 추출물에서 관찰했다. 실험 조건 : BGE, 10 % 아세트산 (PH 2.2); 분리 전압은 30 kV로; 샘플 주입, 60 초 동안 2.0 PSI. 권한 4 재현 </s&gt;까지. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54535/54535fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

쉬스 다공질 팁 인터페이스 설계를 이용하여 모세관 전기 영동 - 질량 분석법에 의한 생체 시료의 대사 프로파일 링을위한 프로토콜이 제시된다.

생물 시료의 대사 프로파일 링에 대한 쉬스 모세관 전기 영동 - 질량 분석

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

sheathless-capillary-electrophoresismass-spectrometry-for-metabolic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.6K 조회수.  Leiden University.  쉬스 다공질 팁 인터페이스 설계를 이용하여 모세관 전기 영동 - 질량 분석법에 의한 생체 시료의 대사 프로파일 링을위한 프로토콜이 제시된다. 

비디오: Sheathless Capillary Electrophoresis–Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. The approach offers an unbiased and in-depth analysis that can enable the development of diagnostic tests, novel therapies, and further our understanding of disease processes. The inherent chemical diversity of the metabolome creates significant analytical challenges and there is no single experimental approach that can detect all metabolites. Additionally, the biological variation in individual metabolism and the dependence of metabolism on environmental factors necessitates large sample numbers to achieve the appropriate statistical power required for meaningful biological interpretation. To address these challenges, this tutorial outlines an analytical workflow for large scale non-targeted metabolite profiling of serum by UPLC-MS. The procedure includes guidelines for sample organization and preparation, data acquisition, quality control, and metabolite identification and will enable reliable acquisition of data for large experiments and provide a starting point for laboratories new to non-targeted metabolite profiling by UPLC-MS.

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. This article outlines a typical workflow utilized for non-targeted metabolite profiling of serum including sample organization and preparation, data acquisition, data analysis, quality control, and metabolite identification.

울트라 성능 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (UPLC-MS)에 의해 혈청 대규모 비 타겟 Metabolomic 프로파일

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

연구

화학

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first separated into polar and non-polar fractions by a liquid-liquid phase extraction, and partially purified to facilitate downstream analysis. Both aqueous (polar metabolites) and organic (non-polar metabolites) phases of the initial extraction are processed to survey a broad range of metabolites. Metabolites are separated by different liquid chromatography methods based upon their partition properties. In this method, we present microflow ultra-performance (UP)LC methods, but the protocol is scalable to higher flows and lower pressures. Introduction into the mass spectrometer can be through either general or compound optimized source conditions. Detection of a broad range of ions is carried out in full scan mode in both positive and negative mode over a broad m/z range using high resolution on a recently calibrated instrument. Label-free differential analysis is carried out on bioinformatics platforms. Applications of this approach include metabolic pathway screening, biomarker discovery, and drug development.

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted metabolomics provides a hypothesis generating snapshot of a metabolic profile. This protocol will demonstrate the extraction and analysis of metabolites from cells, serum, or tissue. A range of metabolites are surveyed using liquid-liquid phase extraction, microflow ultraperformance liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) coupled to differential analysis software.

Ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (UPLC-HRMS)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

생화학

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but also to identify biomarkers for early-stage cancer detection and prediction of chemotherapy response in cancer patients. Preparation of uniform samples for metabolomic analysis is a critical issue that remains to be addressed. Here, we present an easy and reliable protocol for extracting aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis using capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS). Aqueous metabolites from cultured cells are analyzed by culturing and washing cells, treating cells with methanol, extracting metabolites, and removing proteins and macromolecules with spin columns for CE-MS analysis. Representative results using lung cancer cell lines treated with diamide, an oxidative reagent, illustrate the clearly observable metabolic shift of cells under oxidative stress. This article would be especially valuable to students and investigators involved in metabolomics research, who are new to harvesting metabolites from cell lines for analysis by CE-MS.

The purpose of this article is to describe a protocol for extraction of aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis, particularly, capillary electrophoresis-mass spectrometry.

모 세관 전기 영동-질량 분 광 법에의 한 대사체학 분석을 위해 배양 된 부착 세포 로부터 수성 대사 산물의 추출

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

암 연구학

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic development. To enable single-cell investigations directly in live embryos, new analytical approaches are needed, particularly those that are sensitive, selective, quantitative, robust, and scalable to different cell sizes. Here, we present a protocol that enables the in situ analysis of metabolism in single cells in freely developing embryos of the South African clawed frog (Xenopus laevis), a powerful model in cell and developmental biology. This approach uses a capillary microprobe to aspirate a defined portion from single identified cells in the embryo, leaving neighboring cells intact for subsequent analysis. The collected cell content is analyzed by a microscale capillary electrophoresis electrospray ionization (CE-ESI) interface coupled to a high-resolution tandem mass spectrometer. This approach is scalable to various cell sizes and compatible with the complex three-dimensional structure of the developing embryo. As an example, we demonstrate that microprobe single-cell CE-ESI-MS enables the elucidation of metabolic cell heterogeneity that unfolds as a progenitor cell gives rise to descendants during development of the embryo. Besides cell and developmental biology, the single-cell analysis protocols described here are amenable to other cell sizes, cell types, or animal models.

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

We describe steps that enable fast in situ sampling of a small portion of an individual cell with high precision and minimal invasion using capillary-based micro-sampling, to facilitate chemical characterization of a snapshot of metabolic activity in live embryos using a custom-built single cell capillary electrophoresis and mass spectrometry platform.

단일 셀 대사체학 라이브 개구리 (Xenopus laevis) 배아에 대 한 현미경 모 세관 전기 이동 법 질량 분석

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ratios (m/z), which are useful to deduce molecular weights and structures. While it is essentially a destructive analytical method, recent advancements in the ambient ionization technique have enabled us to acquire data while leaving tissue in a relatively intact state in terms of integrity. Probe electrospray ionization (PESI) is a so-called direct method because it does not require complex and time-consuming pretreatment of samples. A fine needle serves as a sample picker, as well as an ionization emitter. Based on the very sharp and fine property of the probe tip, destruction of the samples is minimal, allowing us to acquire the real-time molecular information from living things in situ. Herein, we introduce three applications of PESI-MS technique that will be useful for biomedical research and development. One involves the application to solid tissue, which is the basic application of this technique for the medical diagnosis. As this technique requires only 10 mg of the sample, it may be very useful in the routine clinical settings. The second application is for in vitro medical diagnostics where human blood serum is measured. The ability to measure fluid samples is also valuable in various biological experiments where a sufficient volume of sample for conventional analytical techniques cannot be provided. The third application leans toward the direct application of probe needles in living animals, where we can obtain real-time dynamics of metabolites or drugs in specific organs. In each application, we can infer the molecules that have been detected by MS or use artificial intelligence to obtain a medical diagnosis.

This article introduces sample preparation methods for a unique real-time analytical method based on the ambient mass spectrometry. This method lets us perform real-time analysis of the biological molecules in vivo without any special pretreatments.

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

멀티 주입-모 세관 전기 이동 법 질량 분석을 사용 하 여 높은 처리량 및 포괄적인 약물 감시

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. The single-probe, a microscale sampling and ionization device, can be coupled with a mass spectrometer for on-line, rapid SCMS analysis of cellular constituents under ambient conditions. Previously, the single-probe SCMS technique was primarily used to measure cells immobilized onto a substrate, limiting the types of cells for studies. In the current study, the single-probe SCMS technology has been integrated with a cell manipulation system, typically used for in vitro fertilization. This integrated cell manipulation and analysis platform uses a cell-selection probe to capture identified individual floating cells and transfer the cells to the single-probe tip for microscale lysis, followed by immediate mass spectrometry analysis. This capture and transfer process removes the cells from the surrounding solution prior to analysis, minimizing the introduction of matrix molecules in the mass spectrometry analysis. This integrated setup is capable of SCMS analysis of targeted patient-isolated cells present in body fluids samples (e.g., urine, blood, saliva, etc.), allowing for potential applications of SCMS analysis to human medicine and disease biology.

An integrated cell manipulation platform is developed for use in conjunction with a single-probe mass spectrometry setup for the on-line analysis of individual suspension cells under ambient conditions.

단일 현탁액 세포에서 약물 및 대사 산물의 질량 분석 분석을 위한 단일 프로브와 결합된 통합 셀 조작 플랫폼

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the past decade. Interest in the bio-nano interface arises from the fact that the biomolecular corona confers a biological identity to NMs and thus causes the body to identify them as &#8220;self&#8221;. For example, previous studies have demonstrated that the proteins in the corona are capable of interacting with membrane receptors to influence cellular uptake and established that the corona is responsible for cellular trafficking of NMs and their eventual toxicity. To date, most research has focused upon the protein corona and overlooked the possible impacts of the metabolites included in the corona or synergistic effects between components in the complete biomolecular corona. As such, this work demonstrates methodologies to characterize both the protein and metabolite components of the biomolecular corona using bottom-up proteomics and metabolomics approaches in parallel. This includes an on-particle digest of the protein corona with a surfactant used to increase protein recovery, and a passive characterization of the metabolite corona by analyzing metabolite matrices before and after NM exposures. This work introduces capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry (CESI-MS) as a new technique for NM corona characterization. The protocols outlined here demonstrate how CESI-MS can be used for the reliable characterization of both the protein and metabolite corona acquired by NMs. The move to CESI-MS greatly decreases the volume of sample required (compared to traditional liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (LC-MS) approaches) with multiple injections possible from as little as 5 &#181;L of sample, making it ideal for volume limited samples. Furthermore, the environmental consequences of analysis are reduced with respect to LC-MS due to the low flow rates (&#60;20 nL/min) in CESI-MS, and the use of aqueous electrolytes which eliminates the need for organic solvents.

Here we present a protocol to characterize the complete biomolecular corona, proteins, and metabolites, acquired by nanomaterials from biofluids using a capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry approach.

나노 물질에 의해 획득 된 단백질과 대사 산물 코로나특성화를위한 모세관 전기 전구 질량 분광법 접근법

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the cell&#39;s survival requirements. Alternatively, carrying out DBTL cycles in cell-free environments can accelerate this process and alleviate concerns with host compatibility. A promising approach to cell-free metabolic engineering (CFME) leverages metabolically active crude cell extracts as platforms for biomanufacturing and for rapidly discovering and prototyping modified proteins and pathways. Realizing these capabilities and optimizing CFME performance requires methods to characterize the metabolome of lysate-based cell-free platforms. That is, analytical tools are necessary for monitoring improvements in targeted metabolite conversions and in elucidating alterations to metabolite flux when manipulating lysate metabolism. Here, metabolite analyses using high-performance liquid chromatography (HPLC) coupled with either optical or mass spectrometric detection were applied to characterize metabolite production and flux in E. coli S30 lysates. Specifically, this report describes the preparation of samples from CFME lysates for HPLC analyses using refractive index detection (RID) to quantify the generation of central metabolic intermediates and by-products in the conversion of low-cost substrates (i.e., glucose) to various high-value products. The analysis of metabolite conversion in CFME reactions fed with 13C-labeled glucose through reversed-phase liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (MS/MS), a powerful tool for characterizing specific metabolite yields and lysate metabolic flux from starting materials, is also presented. Altogether, applying these analytical methods to CFME lysate metabolism enables the advancement of these systems as alternative platforms for executing faster or novel metabolic engineering tasks.

The protocols describe high-performance liquid chromatography methods coupled to refractive index or mass spectrometric detection for studying metabolic reactions in complex lysate-based cell-free systems.

리자테 기반 세포 없는 시스템에서 대사산물 프로파일링을 위한 굴절률 또는 질량 분광 검출에 결합된 액체 크로마토그래피

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...