이 작품은 R01 GM108635 및 U54 GM094618, 메이요 클리닉 - ASU 공동 씨 그랜트 상 및 NSF STC 수상 1231306.는 우리는 원고 준비에 도움 A. 워커 감사 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 부여 지원되었다.

1. 필터링 솔루션 및 지질 참고 : LCP 인젝터를 방해 할 수있는 샘플의 미립자 오염 물질의 도입을 피하기 위해 가능한 한이 프로토콜에 사용 된 모든 시약과 도구가 깨끗해야한다. <ol><li> 5 μm의 스핀 다운 필터를 통해 모든 침전제 솔루션 및 용융 지질를 필터링합니다. 청소 주사기 철저히 건조 압축 공기를 적용합니다. 선택적으로, 샘플 준비 과정에서 먼지 입자 또는 섬유를 트래핑 방지하기 위해 휴대용 클린 룸 후드를 사용합니다. </li></ol> LCP의 MP의 2에서 재구성 주 : 결정화를위한 최선의 LCP 호스트 지질의 선택 대상 MP에 의존하고, 일반적으로 호스트 지질 스크리닝 정석 실험 (14)에서 식별된다. Monoacylglycerols (멕스)는 LCP 결정화 (15)에 사용되는 지질의 일반적인 클래스를 나타낸다. 프로토콜은 9.9로 MAG (모노 올레)를 사용에 기초이 날짜 16 메조의 결정화를위한 가장 성공적인 지질이기 때문에, 지질를 개최. 9.9 MAG 그들의 위상 동작 계정 차이점을 고려한 후에 다른 LCP 호스트 지질 또는 지질의 혼합물로 치환 될 수있다. 예를 들어,의 GPCR의 경우는 일반적으로 모노 올레 수용체 안정화 콜레스테롤로 도핑된다. 여기서, 구 사용 : 1 MAG 9.9 (W / w) : 호스트 지질로서 콜레스테롤 혼합물. <ol><li> 앞서 설명한대로 13 믹스 개의 주사기 (# 1, # 2) 및 결합기를 이용하여 적절한 LCP 호스트 지질과 세제 미셀 용액에 정제 MP를 타겟팅. </li><li> 간략하게, MP 솔루션 용융 지질과 주사기 # 2와로드 주사기 # 1. 2 V 9.9 MAG에 대한 / V 지질 / MP 솔루션, 1 : 1 v / V를 단지 해당 LCP 호스트 지질의 최대 수화 용량보다 낮은 수준, 예를 들어, 3에 해당하는 지질 및 수성 MP 솔루션 사이의 비율을 사용하여 대부분의 다른 짧은 체인 멕에 대한 지질 / MP 용액 (7.9 MAG9.7 MAG 등). </li><li> 주사기 커플러를 통해 주사기를 연결하고 시료가 균일하고 투명해질 때까지 앞뒤로 주사기의 혼합물을 이동하는 플런저를 누름으로써 물질을 혼합 시작합니다. LCP-SFX하여 완전한 데이터 세트의 수집에 대한 LCP 샘플의 약 50 μl를 준비합니다. 최종 샘플 량은 일반적으로 샘플 통합 및 지질 적정 (5 절) 후 2 (㎕를 100 ~까지)의 약 배 증가 할 것이다. </li></ol> 3. 주사기에 결정화 설정 <ol><li> 투명하고 균질 한 LCP를 형성 한 후, 주사기 # 2으로 전체 샘플을 이동. 주사기 # 2에 연결된 커플러를 유지하면서, 주사기 # 1 분리. </li><li> 다른 100 μL에 이동식 바늘 (게이지 26S)를 연결 깨끗한 주사기 (주사기 # 3)과에 침전제 솔루션의 흡인 약 70 μL. F 트리거 침전제 용액의 조성고밀도의 미세 ormation 각 대상 MP에 대한 고유하고 이들 프로토콜로 진행하기 전에 결정되어야한다. 여기서,은 A 2A 수용체 (40 mM의 나트륨 티오 시아 네이트, 100 mM 시트르산 나트륨 pH를 5 26~28% PEG400)의 미세 결정의 샤워 수득 최적화 침전제 용액 조성물을 사용한다. </li><li> 주사기 내부의 테프론 페룰을 유지하면서 주사기 # 3에서 바늘을 분리합니다. </li><li> 테프론 페룰 모두 주사기에 위치에 제대로 있는지 확인하고, 커플러를 통해 주사기 # 2, # 3를 연결합니다. 조심스럽게 위치에 단단히 커플러를 조입니다. </li><li> 수직으로 바닥에 주사기 # 2와 LCP 문자열 주사기 # 3의 플런저에 닿을 때까지 천천히 그리고 꾸준히 주사기 # 3에 주사기 # 2에서 단백질 라덴 LCP 샘플을 주입의 방향을 결합 주사기. 주입 된 LCP 볼륨 주사기 # 3 (~ 7 μL)의 약 1/10 초기 침전제 볼륨에 달할 것입니다. 모두 syri의 규모 읽기 볼륨을 확인nges (모두 플런저는 약 7 μL로 이동해야합니다). </li><li> 분리 주사기 # 2. 커플러는 이제 침전제 용액에 침지 샘플을 포함 주사기 # 3에 접속되어있다. </li><li> 완전히 플런저 주사기 인터페이스 커플러의 개방 단부와 바늘 너트 포함 주사기 # 3, 밀봉 파라 필름을 사용한다. 이 단계에서 불완전 밀봉 변경할 수있는 침전제 조건 탈수 할 수있는 샘플을 일으킬 수 있습니다. </li><li> 반복 ~ 6 추가 주사기 (# 9 4- #)의 총 이용에 LCP 샘플의 50 μl를 결정화를 설정 3.3-3.7 단계 (~ 각 주사기 당 LCP의 7 μL). </li><li> 상점은 하나 또는 두 개의 섬유 무료 청소 조직이 샘플 탈수를 방지하기 위해 물에 미리 담가과 플라스틱 밀봉 봉투에 주사기를 밀봉. 결정 성장하는 동안 20 ° C를 인큐베이터에서 가방 가게 주사기를 밀봉합니다. </li></ol> 4. 크리스탈 검출 <ol><li> 이미지 LC에 인큐베이터에서 주사기를 제거직접 주사기 내부 P 샘플 (# 3 # 9) 교차 편광과 실체 현미경 하에서 모든 12 ~ 24 시간. LCP의 필라멘트에서 균일 한 빛이 작아 결정 크기의 경우에 단단히 포장 반짝이 입자와 같은 결정을 식별하거나. </li><li> 가방에 밀봉 된 주사기를 반환하고, 향후 사용을 위해 20 ° C에서 보관. </li></ol> 7.9 MAG 5. 샘플 통합 및 적정 참고 :) 초과 침전제 용액을 흡수하고 b)는 XFEL 빔을 주사에 냉동 지질을 방지하기 위해 : 여기에 설명 된 지질 적정 단계는 두 가지 목적을 제공합니다. 9.9 MAG 이루어지는 LCP 샘플은 데이터를 수집하기위한 진공 챔버에 주입 할 때, 집중 증발 라멜라 결정상으로 샘플의 일부를 변환하는 다운 평형 상전이 온도 (~ 18 ° C)의 온도에 샘플을 냉각 할 (LC). 빔에 의해 공격 LC 단계의이 패치는 강렬한 분말 diffr을 생산예를 들면 코넬 - SLAC 픽셀 어레이 검출기 (CSPAD)와 같은 민감한 검출기 (6)가 손상 될 수 있습니다 액션 반지. 이러한 혼합물은 낮은 상전이 온도를 가지고 짧은 체인 지질 (MAG 9.7 또는 7.9 MAG)와 9.9 MAG 시료의 적정이 문제를 완화시킨다. 여기, 우리는 7.9 MAG와 9.9 MAG 구성된 LCP의 적정을 설명합니다. 짧은 사슬 멕스 (9.7 MAG 7.9 MAG 등), 결정화에 사용되는 또는 직렬 결정학 데이터는 대기압에서 회수 할 때 단계 5.11의 적정 여전히 필요하지만 때 채용 원래 LCP 호스트 지질을 사용하여 수행 될 수있다 결정화. <ol><li> 약 1 시간 데이터 수집의 시작 전에 20 ° C 배양기에서 샘플을 주사기를 제거합니다. </li><li> 결정화 조건의 유사한 결정 모양과 유사성을 기반으로 샘플 통합을위한 2-4 주사기를 선택합니다. </li><li> 조심스럽게 선택된 주사기에서 밀봉 파라 필름을 제거합니다. </li><li> 없애다주사기 커플러는 처음 선택한 주사기에 깨끗한 이동식 바늘 (게이지 26S)를 연결합니다. 부드럽게 천천히 microcentrifuge 관에 바늘을 통해 침전물을 짜내 앞으로 플런저를 밀어 넣습니다. 이 단계에서 운동주의는이 단계에서 플런저에 높은 압력을 적용하는 샘플의 일부 또는 전체 손실로 이어지는, 침전제 용액과 함께 결정 라덴 LCP의 일부를 추출 할 수 있기 때문이다. </li><li> 침전제의 대부분이 제거 된 상기 LCP 니들 입구에 축적 될 때, 플런저를 중지. </li><li> 다른 선택 주사기와 단계를 반복 5.4-5.5. </li><li> , 결과 LCP 샘플을 통합 깨끗 커플러를 통해 두 개의 주사기를 연결합니다. </li><li> 다른 주사기의 하나에서 모든 샘플을 전송하기 위해 하나의 주사기 플런저 우울. </li><li> 빈 주사기를 분리합니다. </li><li> 반복 2-4 사전에서 결정 라덴 LCP 재료를 모두 통합 5.7-5.9 단계하나의 주사기에 -selected 주사기. 가능한 한 많은 침전물을 제거합니다. </li><li> 빈 주사기에 7.9 MAG 또는 원래 짧은 체인 MAG 호스트 지질 ~ 5 μl를 추가합니다. 주사기 커플러를 통해 통합 된 샘플 주사기에이 주사기를 연결하고 대안 주사기 플런저를 누름으로써 섞는다. 모든 잔류 용액을 흡수하여 균일하고 투명한 LCP가 형성 될 때까지 반복한다. 적정 후에 LCP의 최종 양은 과량 침전제와 그 조성물의 양에 따라 20 내지 35 μL로 변할 수있다. </li><li> 하나의 주사기에 전체 혼합 LCP 샘플을 이동하고 빈 주사기를 분리합니다. </li></ol> 미세 6. 특성 <ol><li> 통합 샘플 주사기에 LCP-인젝터 로딩 바늘 (포인트 스타일 3, 게이지 (22), 길이 1 인치)를 연결합니다. </li><li> 조심스럽게 유리 슬라이드에 LCP 샘플 ~ 1 μl를 배출하고는 유리 커버 슬립으로 다룹니다. 조심스럽게 누르지샌드위치에 커버 슬립 샘플. </li><li> 밝은 필드 조명 및 교차 편광기를 사용하여 가장 높은 배율 (전형적 100X)에서 스테레오 현미경 LCP 샘플 이미지를 취할. 가능하면, 시료 중의 단백질 미세 결정의 존재를 확인하기 위해 UV 형광 현미경 (키랄 크리스탈 이차 비선형 영상)을 SONICC 이미 저 (17)를 사용하여 추가 이미지를 취할. </li><li> 결정 크기 및 밀도 (10)를 추정한다. 데이터 수집 실험 이상적인 결정 밀도는 결정 크기는 X 선 빔의 직경과 LCP 스트림의 직경에 의존하며, 약 10~40%의 결정 적중률 초래한다. </li></ol> 크리스탈 밀도 7. 조정 주 : 결정 밀도 단계에서 발견 된 경우 6.4 여러 결정 히트들의 큰 비율의 결과가 너무 높으면, 결정이 최적화 아래와 같이 다음 희석되어야데이터 수집을위한 샘플. 결정 밀도 준비된 모든 시료에서 효율적인 데이터 수집이 너무 낮 으면 LCP의 MP 결정 농축위한 신뢰할 수있는 방법이 없기 때문에, 그 결정 성장 조건은, 다시 최적화한다. <ol><li> 깔끔한 LCP의 요구량을 제조하여 희석 할 필요가 결정 원래 시료의 LCP 조성물 (동일한 지질 및 침전제)을 모방하여 희석을 위해 사용된다. </li><li> 하나의 주사기에 모든 깔끔한 LCP를 이동합니다. 빈 주사기를 분리하지만, 연결 커플러를 둡니다. </li><li> 미세과 LCP 샘플이 들어있는 주사기에서 바늘을 제거합니다. 커플러를 통해 깔끔한 LCP가 들어있는 주사기에 샘플 주사기를 연결합니다. </li><li> 균일 성이 달성 될 때까지 커플러를 통해 앞뒤로 밀어 주사기의 내용을 섞는다. </li><li> 제 6 반복 조정 시료의 미세 결정 밀도를 다시 평가한다. </li></ol> 8. LCP 인젝터로드차 LCP-SFX 데이터 수집 <ol><li> 샘플과 주사기의 커플러를 분리하고 주사기에 1 &quot;로딩 바늘을 연결합니다. </li><li> LCP 인젝터의 저장소에 샘플의 20 ~ 40 μl를 전송합니다. </li><li> 시료 챔버 (18)에 LCP 인젝터를 삽입 인젝터를 시작 유량을 조정하고 LCP-SFX 데이터를 수집한다. </li></ol> LCP 9. 법인 가용성의 단백질 결정 참고 : 수용성 단백질의 결정의 전달을 위해 같은 LCP와 같은 점성이 높은 매체를, 사용하여 하나가 극적으로 직렬 결정학 실험에서 단백질 소비를 줄일 수 있습니다. 이 단계에서 우리는 LCP에 수용성 단백질의 결정을 통합하는 방법에 대해 설명합니다. 결정은 결정 현탁액의 형태로 함께 통합되어 필요한 경우, 여과 된 기술로 수득 할 수있다. <ol><li> 약 10~40%의 결정 적중률을 보장하기 위해 정지 결정 밀도를 조정합니다. </li><li> 티동부 표준시 7.9 MAG, 9.7 MAG 또는 1 사용 LCP와 침전제 솔루션의 호환성 : 7.9 MAG 1 혼합물 호스트 지질로 9.9 MAG합니다. </li><li> 믹스 ~ 함께 결정 현탁액 25 μL ~ 균질 LCP이 형성 될 때까지 주사기 믹서 호스트 지질의 25 μL. </li><li> 제 8 항에 기술 된 바와 같이 데이터를 LCP 인젝터에 제 6로드에 샘플을 설명하고 수집으로 결정 크기 및 밀도를 평가합니다. </li></ol>

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The authors have no conflicts of interest to disclose.

여기에 설명 된 프로토콜은 LCP 인젝터 표준 LCP-SFX 실험을위한 시료 준비 과정의 일반적인 개요를 제공한다. 미결정 크기에 따라, 우리의 경험을 바탕으로, 전체 데이터 세트를 수집하는데 필요한 최종 미결정 함유 LCP 샘플의 총량은 전형적으로 50 내지 100 μL (초기 단백질 함유 LCP 샘플 25-50 μL 표 1)은 품질 및 밀도. 각 100 μL 기밀 유리 주사기 적절한 상기 LCP에 침전제 용액에도 확산을 위해 완전히 연장 된 문자열 형태의 LCP의 약 7 μl를 수용 할 수 있기 때문에, 주사기 적어도 4-7 시료를 준비해야 각 LCP-SFX 실험. 샘플을 직경 모세관 좁은 20-50 μm의 통해 압출되기 때문에, 시료의 이물질 미립자 물질을 피하기 위해 중요하다. 가끔 LCP에 도입 될 수있는 먼지 및 섬유샘플 또는 침전제 용액 인젝터 모세관 폐색 및 실험 중에 중단 시간을 증가시킬 수있다. 따라서, 샘플을 준비하기 전에 5㎛의 기공 필터를 통해 모든 지질 용액을 필터링하는 것이 중요하다. 선택적으로, 청정실 또는 청정실 휴대용 후드 샘플 제조에 사용될 수있다. 이러한 프로토콜은 MP의 결정화를위한 호스트로서 지질 9.9 MAG (모노 올레)를 사용에 기초한다. 그러나 이들은 9.9 MAG에 한정되지 않고 쉽게 고려 지질 상 거동의 차이를 복용 후 다른 LCP 호스트 지질 또는 지질의 혼합물로 구성 될 수있다. LCP 결정화 의원의 구조의 대부분은 9.9 MAG 15 지금까지 가장 성공적인 대표되는 더불어 멕스 중 하나를 사용하여 얻어졌다. SFX 9.9 MAG 사용의 주요 단점은 데이터 수집 진공에서 수행 될 때 종종 발생하는 18 ° C,보다 냉각시 라멜라 결정상으로의 전이이다. titrati7.9 MAG이 프로토콜의 제 5 절에 기술과에이 문제에 대한 좋은 솔루션을 제공합니다. 우리의 경험에 의하면, 결정은 부작용없이 같은 적정을 견딜. 그러나 7.9 MAG 또는 다른 짧은 체인 MAG의 첨가는 바람직하지 않은 경우, 적정 9.9 MAG로 수행 될 수있다. 이 경우, 진공 상태로 주입하는 동안 LCP의 흐름을 안정화 가스는 덜 안정 샘플 흐름을 갖는 희생 대부분의 샘플에서 결정 지질상의 형성을 방지 할 수있는, 질소, 헬륨로 전환되어야한다. 이 현대 XFEL 및 싱크로트론 소스에 직렬 결정학 데이터 수집에 적합한 넓은 범위에 걸쳐 결정의 유량을 조정할 수 있기 때문에 LCP의 겔형 일관성은 결정 담체 매질로서 사용하기 위해 큰 장점을 갖는다. (C)의 크기 순서에 의해 결정 소비 극적인 감소에 XFEL 펄스 반복율 결과 결정 유량 매칭액체 주입 ompared. LCP는 또한 가용성 단백질 (21)의 결정을 위해, 단지 그것이 성장 MP 결정의 전달을위한 적합한 담체 매체이다. 직렬 결정학 실험을 수행하기위한 도구와 시약의 무기고를 확장, 24 - 여러 대안 점성 결정 캐리어 미디어는 최근 22 도입되었다. 또한, 액정 전달 매체로서 LCP 직렬 결정학 적어도 잘 회절 결정 (24, 25)에 대해, 종래의 싱크로트론 소스에서 입증되었다. 검출기 기술에 대한 X 선 크기의 주문에 의해 강도뿐만 아니라 개선을 향상 싱크로트론 소스의 미래 업그레이드, 일련 결정학 구조 결정에 더욱 접근 가능하고 매력적인 방법을 만들 것입니다. LCP-SFX는 MP 구조 결정에 대한 효능을 입증했다. 여기서, L (예 : 된 GPCR 또는 거대 분자 복합체와 같은) 도전 생물학적 시스템의아니라 단지 가능한 옵션 원자 해상도 구조를 해결하는 경우 ARGE 회절 품질 결정이 성장하기 어려운, LCP-SFX는 매력을 제공 할 수있다. 모든 장점과 함께 즉, MP 결정화 및 결정 납품, 저가 단백질 소비, 방사선 손상의 유무, 실내 온도 데이터 수집, 시간이 해결 연구 26, 27의 가능성없이 결정 수확 요구 사항, LCP-의 행렬로 LCP를 사용하여 SFX는 구조 생물학의 미래에 중요한 역할을한다.

X 선 결정학은 막 단백질 (MPS)의 원자 해상도 구조를 해결하는 현재까지 가장 성공적인 방법이다. 또는, 메소 결정화 또한 지질 입방 상 (LCP)로 알려진 지질 중간상으로부터 결정화는 G 단백질 결합 수용체로서 도전 대상의 고해상도 구조 결정을 활성화 한 MP 결정학의 주요 개발 중 하나 (의 GPCR을 나타낸다 1). LCP 도구와 기술의 최근 발전은 세계 2 주위에 구조 생물학의 큰 커뮤니티에 사용할 수있는이 기술을 만들었습니다. 그러나, 많은 경우에 LCP에 형성 MP 결정은 높은 해상도에서 충분한 신호 (3)를 수득 할 수 있기 전에 샘플이 심한 방사선 손상 및 열화 고통 심지어 가장 진보 된 마이크로 포커스 싱크로트론 빔라인을 사용하기에는 너무 작다. 결정 데이터 수집에 대한 새로운 접근 방식최초의 X 선 자유 전자 레이저 (XFEL)의 시운전으로 활성화되었습니다. 방법은 &quot;파괴하기 전에 회절&quot;의 원칙, 최초의 이론적 4를 도입하고 선형 가속기 코 히어 런트 광원 (LCLS) 3, 하드 XFELs에서 세계의 개척자에서 생물학적 시료에 실험적으로 확인을 기반으로합니다. XFEL 단백질 원자 방사선 손상에 응답하여 이동하기 전에 원시 결정에서 회절 펨토초 기간 내에 수십 고휘도 X 선 펄스를 생성한다. 초기 실험에서, 미세 연속 액체 분사 장치 (5)에 의해 제조 된 수성 스트림의 XFEL 빔 교차점에 공급 하였다. 이 실험 장치는 시리얼 펨토초 결정학 (SFX)로 알려져있다. SFX위한 액체 분사 장치를 사용하는 주요 단점은 결과적으로 전체 데이터 세트의 수집을 위해 정제 된 단백질 밀리그램 수십에서 수백를 필요로 높은 유량이다. EMP으로현저히 감소 된 단백질, 9 - 겔상 LCP 샘플들을 처리 할 수있는 특별한 주입기 (LCP의 microextrusion 인젝터) 6 loying 우리는 성공적 LCP 매트릭스에서 성장 여러 인간의 GPCR의 미세 전달 및 고해상도 구조 (6)를 수득 세트 당 0.3 미만 mg의 소비. 인젝터는 최대 20, 40 또는 100 크리스탈 함유 LCP ㎕의 샘플이 (10000까지 고압의인가에 의해 압출되는 좁은 모세관 (직경 10 ~ 50 μm의)을 보유 할 수있는 저장 이루어져 HPLC (고성능 액체 크로마토 그래피) 펌프로부터의 액체에 의해 구동되는 압력 증폭 스테이지 유압 플런저로부터 PSI). 모세관 노즐을 빠져 LCP의 스트림이 반응성 가스 (통상, 헬륨 또는 질소)를 평행 흐름에 의해 안정화된다. 여기에 우리가 준비하고 샘플을 특성화하기 위해 필요한 단계의 시각적 데모를 제공합니다LCP-SFX의 실험. 자세한 내용은 게시 된 프로토콜 (10)에서 찾을 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 SFX 방식을 사용하여 X 선 데이터 수집 LCP이 단백질의 결정 아데노신 2A 수용체 (11) 및 사용 준비된다. 우리의 프로토콜 XFEL과 싱크로트론 소스에 직렬 결정학에 의해 데이터 수집 LCP를 스트리밍 할 수있는 임의의 인젝터와 호환 있지만, 설명을 위해, 우리는 참고 문헌에 기술 된 LCP 인젝터를 사용합니다. LCP 고밀도 미세 생성 6. 최적화 침전 조건은 높은 처리량 프로토콜이 결정화를 진행하기 전에 12,13 스크리닝에 의해 식별되어야한다. 이 프로토콜의 일반적인 흐름도가도 1에 도시되어있다.

<table><tbody><tr><td>LCP host lipid monoolein (9.9 MAG)</td><td>Nu Chek Prep</td><td>M239</td><td>Hosting lipid for the protein to be crystallized</td></tr><tr><td>LCP host lipid monoolein (9.9 MAG)</td><td>Sigma</td><td>M7765&amp;nbsp;</td><td>Hosting lipid for the protein to be crystallized</td></tr><tr><td>LCP host lipid monopalmitolein (9.7 MAG)</td><td>Nu Chek Prep</td><td>M219</td><td>Hosting lipid for the protein to be crystallized</td></tr><tr><td>LCP host lipid 7.9 MAG</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850534</td><td>Hosting lipid for tiration to avoid lamellar crystal phase (Lc) formation during sample injection</td></tr><tr><td>Purified protein solution concentrated to 20-50 mg/ml</td><td></td><td></td><td>Target protein</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606-1</td><td>Used to dissolve lipids</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337-500ML</td><td>Used to wash syringes</td></tr><tr><td>Eleven 100 &amp;#956;l Hamilton gas-tight syringes without needles</td><td>Hamilton</td><td>7656-01</td><td>For LCP preparation</td></tr><tr><td>Eight syringe couplers</td><td>Formulatrix</td><td>SKU 209526</td><td>For LCP preparation</td></tr><tr><td>LCP-injector loading needle</td><td>Hamilton</td><td>7804-01 point style 3, length 1 inch</td><td>For LCP dispensing and injector loading</td></tr><tr><td>Removable needle</td><td>Hamilton</td><td>7768-01</td><td>For removing precipitant solution</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Parafilm</td><td>PM992</td><td>Used for syringe sealing</td></tr><tr><td>Lint free lens cleaning tissues</td><td>Fisher</td><td>NC9592151</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugal filter tubes, Ultrafree-MC, 0.5 ml, Durapore 5 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>UFC3 0SV 00</td><td>Used for filtering of precipitant solutions and lipids</td></tr><tr><td>Microscope slides, 1 inch x 3 inch&amp;nbsp;</td><td>GoldSeal</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Two wash bottles with fine tips. One filled with milli-Q or distilled water, the other with methanol</td><td>VWR</td><td>89094-640</td><td>These are used to clean the syringes, needles and coupler.&amp;nbsp; Methanol is used first, then water.</td></tr><tr><td>Gloves</td><td>Microflex</td><td>XC-310-L</td><td>For blow drying syringes, needles, ferrules, and couplers</td></tr><tr><td>Safety glasses</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pressurized air cans</td><td>Office Depot (Dust-Off)</td><td>527494</td><td>For syringe cleaning</td></tr><tr><td>Dry block heater with a digital temperature controller</td><td>Fisher</td><td>11-720-10BQ&amp;nbsp;</td><td>Used for thawing lipids</td></tr><tr><td>Benchtop Centrifuge</td><td>Fisher</td><td>05-413-340</td><td>Spinning down solutions</td></tr><tr><td>Clean Room Mini - 12 inch Portable Positive Pressure Hood with HEPA filter</td><td>Sentry Air Systems, Inc.</td><td>SS-112-PCR</td><td>Cleaning sample preparation</td></tr><tr><td>Stereo zoom microscope equipped with a linear polarizer and rotating analyzer&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td>Crystal density check</td></tr><tr><td>UV microscope</td><td>JAN Scientific</td><td>UVEX-P</td><td>Optional, for crystal imaging purposes</td></tr><tr><td>SHG imager</td><td>Formulatrix</td><td>SONICC</td><td>Optional, for crystal imaging purposes</td></tr></tbody></table>

preparation and delivery of protein microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography

막 단백질 (의원)은 세포막 및 기본 약물 표적의 필수 구성 요소입니다. 합리적 약물 설계는 일반적 결정학에 의해 얻어진 정확한 구조적 정보에 의존하고; 그러나 의원은 결정화하기 어렵다. MP 구조 결정에 최근 진행 싱크로트론 소스에서 기존의 결정 데이터를 수집하는 동안 방사선 손상으로 고통 일반적으로 잘 회절 산출 지질 입방 단계 (LCP) 결정화 방법,하지만 종종 작은 결정의 개발에 크게 도움이되고. 차세대 X 선 자유 전자 레이저 (XFEL) 매우 밝은 펨토초 펄스를 생성 소스의 개발이 없거나 무시할 방사선 손상과 미세에서 실내 온도 데이터 수집을 사용할 수있다. 직렬 펨토초 결정학 (LCP-SFX)과 LCP 기술을 조합 한 우리의 최근의 노력은 승 여러 인간 G 단백질 결합 수용체의 고해상도 구조 이어질HICH 구조 결정에 대한 악명 어려운 대상을 나타냅니다. LCP의-SFX 기법에서, LCP는 결정 학적 데이터 수집을위한 XFEL 빔 주사 스트림의 교차점 MP 미결정 모두 성장 및 전달을위한 매트릭스로서 채용된다. 그것은 단지 서브 - 10 μm의 결정을 사용할 수있는 경우 LCP-SFX 실질적 또는 회절의 해상도를 향상시킬 수 있음을 입증되었다 실온에서 작은 결정의 사용은 결함의 축적과 같은 큰 cryocooled 결정과 연관된 다양한 문제들을 극복 할 수있는 경우에는, 높은 mosaicity 및 cryocooling 유물. X 선 소스와 검출기 기술의 미래 발전은 XFELs에서뿐만 아니라, 더 접근 싱크로트론 빔라인에서뿐만 아니라 구현을위한 일련 결정학은 매우 매력적이고 실용적인해야한다. 여기에서 우리는 일련 결정학 실험에 대한 LCP의 준비, 특성화 및 미세 결정의 전달을 위해 상세한 시각 프로토콜을 제시한다.이러한 프로토콜은, 주사기에서 결정화 실험을 검출 및 결정 샘플의 특성, 결정 밀도를 최적화하는 상기 주사 기기로 미결정 라덴 LCP 로딩 및 데이터 수집을 위해 상기 빔에 샘플을 제공하기위한 방법을 포함한다.

작용제의 에르고 타민 8 (PDB ID 4NC3 복잡한 세로토닌 수용체 5-HT 2B : 우리 대표 우리 SFX 데이터를 수집하고 다섯 인간의 GPCR의 고해상도 구조를 해결하기 위해 허용되는 상기 프로토콜에 따라 제조 된 샘플로 얻어진 결과를 설명하는 아래 ) 길항제의 cyclopamine 6 (PDB ID 4O9R)는 복잡한의 이중 기능성 펩티드 리간드 DIPP-NH 2 (7) (PDB ID 4RWD), 안지오텐신 수용체와 복잡한에, δ-오피오이드 수용체와 복잡한에 평활 수용체 (SMO) 차단 ZD7155 9 (PDB ID 4YAY), 및 로돕신 19 (PDB ID 4ZWJ를) 아레스 사이의 복잡한; 및 수용성 단백질이 시험 : 라이소자임 (PDB ID 4ZIX) 및 피코시 아닌 (PDB ID 4ZIZ). 5-HT (2B)은 세로토닌의 다양한 중추 및 말초 생리적 기능을 매개한다. 이 수용체확립 고급 광자 소스 (APS)에서 전통 microcrystallography 해결 cryocooled 구조 LCLS에서 얻어진 실온 구조를 비교함으로써, LCP-SFX 방법을 확인하는 데 사용 하였다. 단백질 미세 100 μL의 LCP 시료 (평균 크기는 약 5 μm의) ~ 총 준비 SFX 데이터 수집에 이용하고, 5HT (2b)의 LCP-SFX 구조가 성공적으로 2.8 Å (도 2)도 8에 해결 하였다. 샘플 준비 및 데이터 수집에 유용한 추가 세부 사항은 표 1에 제공된다. 평활 수용체 (SMO)는 배아 발달 및 종양 성장에 잘 입증 기능을 가진 클래스 F 된 GPCR의 부재와 기형의 cyclopamine의 분자 표적이다. 처음에, 120 × 10 × 5 ㎛의 평균 크기 SMO / cyclopamine 비교적 큰 결정을 수득 한 후 데이터 collecti 사용 하였다싱크로트론 소스에서에 기존의 고니 오 미터 기반의 결정학을 이용하여. 그러나 이들 큰 결정 (2-3도 이상), 아마도 결정 성장 결함의 축적 또는 cryocooling 관련된 영향으로부터 큰 mosaicity 앓고 마이크로 포커스 빔라인 (직경 10 μm의)에서 열악한 회절 제조. LCP-SFX 그러나, 실온에서 5 ㎛의 크기의 크리스탈에서 LCLS 품질의 회절 데이터를 수집 할 수 있었다. 구조는 명확하게 결합 포켓 (6) (도 3)에 cyclopamine의 위치를 식별하는 세 개의 주축을 따라 이방성 3.4, 3.2 및 4.0 Å 해상도에서 분자 여분으로 해결 하였다. μ-아편 유사 수용체 (μ-OR)을 대상으로 모르핀과 같은 알칼로이드 아편은 널리 심한 통증 관리에 사용됩니다. 그러나, 그들의 광범위한 사용은 획득 내성과 중독에 이르게. morphines의 공동 관리δ 오피오이드 수용체 (δ-OR) 길항제에 따라서 혼합 작용제 μ-OR-δ-OR 길항제 및 기능을 갖는 화합물의 탐색을 촉진 상술 부작용을 방지하는 것으로 나타났다. 우리 δ-OR 관능 테트라 펩티드 DIPP-NH 2와 복합체에서 종래 측각기 기반 데이터 수집 전략을 채택 싱크로트론 X- 선 소스에서 3.3까지 회절 cryocooled 결정을 사용하여 초기 회절 데이터를 획득. 이러한 데이터는 펩티드 리간드에 대한 일부 모호한 전자 밀도를 한 것으로 밝혀졌습니다. 이어서, 실온에서 XFEL 회절 데이터를 획득하고, 구조는 리간드와 수용체 (7)에 대한 명확한 밀도를 나타내는 2.7 Å 해상도에서 측정 하였다. 이 구조는 더 이해 오피오이드 수용체 기능 및 선택의 기회를 제공하고 새로운 진통제의 개발을위한 가치있는 통찰력을 제공. (1 AT R) -1 수용체 GPCR은 혈압의 차 레귤레이터로서 기능한다. 우리는 LCP의 길항제 ZD7155 복잡한 1 R AT 결정화. 최적화 된 결정 싱크로트론 소스에서만 ~ 4에 도달하는 최선의 회절 40 × 4 × 4 ㎛의 (3)의 최대 크기에 도달 하였다. 결정화 조건을 변경함으로써 XFEL 방사선을 사용하여 2.9 Å 해상도에서 실온 구조를 얻기 위해 사용 된 작은 결정의 샤워 (10 × 2 × 2 μm의 3)를 수득. 2764739 검출기 이미지의 총 단백질 (9)의 약 0.29 mg의 대응 크리스탈 - 라덴 LCP의 약 65 μL에서 전체 데이터 집합을 수집 하였다. 프레임의 총 수, 457,275은 73,130 프레임 (명중 16 %)을 성공적으로 인덱싱 된 집적있는 17 %의 히트 레이트에 대응하는, 액정 히트로서 확인되었다. 지PCR들은 G 단백질 또는 arrestins 중 하나에 의해 매개되는 두 가지 경로를 통해 신호. 아레스 복잡한에서 GPCR의 구조가 애매 유지했던 반면 이종삼 S G 단백질에 결합 된 β 2 아드레날린 수용체의 구조는 몇 년 전에 20 해결 하였다. 우리는 최장 치수가 25 내지 30 μm의 도달 LCP의 로돕신 아레스 - 융합 단백질의 작은 결정을 수득하지만, 광범위한 최적화에도 불구하고, 오직 싱크로트론 소스에서 ~ 7 Å 해상도 회절. LCP의-SFX 방법을 사용하여, XFEL의 beamtime의 12 시간 이내에, 우리는 18,874 패턴이 성공적으로 인덱싱 및 3.8 Å / 3.8 Å / 3.3 Å (19)의 해상도 한계를 이방성에 통합 된 중 22,262 크리스탈 안타를 수집. 로돕신 - 아레스는 전통적인 방법을 사용하여 구조 결정에 저항 매우 도전적인 단백질 복합체이다. 이 구조의 성공적인 결정의 거대한 잠재력을 보여 주었다LCP의-SFX의 어려운 문제를 해결하는 방법 및이 된 GPCR에 아레스 바이어스 신호의 메커니즘을 검사 할 수있는 독특한 기회를 제공했다. 마지막으로, 지질 상에 성장 된 단백질 결정 막에 부가하여, 샘플 준비 및 전달 방법이 성공적으로 극적 단백질 소비를 줄일 수 있도록 허락, LCP는 결정의 전달을위한 담체 매질로서 사용되는 가용성 단백질 결정으로하도록 하였다 구조 결정에 필요한. 두 모델 단백질 리소자임 및 피코시 아닌의 구조는 각각의 단백질 21 0.1 밀리그램을 사용하여이 방법으로, 각각 1.89 Å 및 1.75 Å 해상도로 해결되었다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> 세로토닌 수용체 (b) </td><td> 평활 수용체 </td><td><strong&gt; δ-오피오이드 수용체 </td><td> 안지오텐신 II 수용체 1 형 </td><td> 로돕신 - 아레스 </td><td> 라이소자임 </td><td> 피코시 아닌 </td></tr><tr><td> PDB ID </td><td> 4NC3 </td><td> 4O9R </td><td> 4RWD </td><td> 4YAY </td><td> 4ZWJ </td><td> 4ZIX </td><td> 4ZIZ </td></tr><tr><td> 전체 샘플 사용 * μL </td><td> (100) </td><td> (83) </td><td> (50) </td><td> (65) </td><td> (75) </td><td> (10) </td><td> (10) </td></tr><tr><td> 사용 된 총 단백질, μg의 </td><td> (300) </td><td> (500) </td><td> (300) </td><td> (290) </td><td> (340) </td><td> (100) </td><td> (100) </td></tr><tr><td> 평균 결정 크기, μm의 </td><td> 5 × 5 × 5 </td><td> &lt;5 </td><td> 5 × 2 × 2 </td><td> 10 × 2 × 2 </td><td> 5 ~ 10 </td><td> 5 × 2 × 2 </td><td> 10 × 10 × 5 </td></tr><tr><td> 타율, % </td><td>3.6 </td><td> 7.8 </td><td> 5.9 </td><td> (17) </td><td> 0.45 </td><td> (40) </td><td> 6.5 </td></tr><tr><td> 총 데이터 수집 시간, 시간 </td><td> (10) </td><td> 8 </td><td> 4.6 </td><td> 6.4 </td><td> (12) </td><td> 0.75 </td><td> 0.67 </td></tr><tr><td> 인덱스 패턴의 수 </td><td> 32819 </td><td> 61964 </td><td> 36083 </td><td> 73130 </td><td> 18874 </td><td> 54544 </td><td> 6,629 </td></tr><tr><td> 공간 그룹 </td><td> C 2 2 2 1 </td><td> P 2 1 </td><td> C (2) </td><td> C (2) </td><td> P 2 1 2 1 2 1 </td><td> P 4 3 2 1 2 </td><td> H 3 2 </td></tr><tr><td> 해상도, Å </td><td> 2.8 </td><td> 3.2 / 3.4 / 4.0 </td><td> 2.7 </td><td> 2.9 </td><td> 3.3 / 3.8 / 3.8 </td><td> 1.89 </td><td> 1.75 </td></tr></tbody></table> 표 대표적인 구조물 샘플 준비 및 데이터 수집 통계 1. 개요는 LCP-SFX 방법을 이용하여 해결. LCP-SFX 실험에 필요한 시료의 양을 결정 회절 품질 결정 밀도, 인젝터 노즐의 직경뿐만 아니라 XFEL 빔 크기, 강도 및 펄스 반복 속도에 의존한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig1.jpg" /> LCP-SFX. 샘플 제조를위한 전형적인 샘플 준비 절차도 1 순서도 기밀 유리 주사기에있는 표적 단백질의 LCP 결정화 시작한다. 결정을 수득 한 후, 결정 LCP 함유 한 주사기로 통합 추가적인 지질으로 적정, absor 할초과 침전제 용액 나. 다음 이전 XFEL 데이터 수집에 대한 다양한 현미경 방법을 사용하여 특징을 결정. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54463/54463fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig2.jpg" /> 도 2의 대표적인 결과의 구조 5-HT 2B 에르고 타민 복잡한한다. (a) 5-HT 2B / 에르고 타민의 미세 결정은 명 시야 현미경을 사용하여 형태 8 군데. 이 그림은 과학에서 저작권 허가 기준 8에서 재사용되고있다. (b)는 미세 5-HT (2B) / 에르고 타민의 교차 편광 현미경 모드 (8)을 사용하여 몇 군데. 이 그림은 저작권과 기준 8에서 재사용 된과학 허가. (c) 상기 LCP-SFX 방법에 의해 얻어진 5-HT 2B / 에르고 타민 구조 만화 표현. 모델에 내장 된 지질은 스틱 표현에 표시됩니다. 리간드는 에르고 타민 분야 표현에 나타낸다. 실선은 대략 막 경계를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54463/54463fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig3.jpg" /> 그림 3. 대표 결과, cyclopamine 복잡한에서 SMO의 구조. 왼쪽 패널은 SMO / cyclopamine의 미세 크로스 편광 현미경 모드 6을 사용하여 몇 군데. 이 수치는 자연 커뮤니케이션에서 저작권 허가 기준 6에서 재사용되고있다. 오른쪽 패널, 만화 representati을LCP의-SFX 방법에 의해 얻어진 SMO / cyclopamine 구조에. 리간드는 cyclopamine 분야 표현에 나타낸다. 실선은 대략 막 경계를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54463/54463fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

We describe procedures for the preparation and delivery of membrane protein microcrystals in lipidic cubic phase for serial crystallography at X-ray free-electron lasers and synchrotron sources. These protocols can also be applied for incorporation and delivery of soluble protein microcrystals, leading to substantially reduced sample consumption compared to liquid injection.

준비 및 직렬 펨토초 결정학에 대한 지질 큐빅 단계에서 단백질 미세 배달

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

preparation-delivery-protein-microcrystals-lipidic-cubic-phase-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.4K 조회수.  University of Southern California. We describe procedures for the preparation and delivery of membrane protein microcrystals in lipidic cubic phase for serial crystallography at X-ray free-electron lasers and synchrotron sources. These protocols can also be applied for incorporation and delivery of soluble protein microcrystals, leading to substantially reduced sample consumption compared to liquid injection.

비디오: Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in their largest dimension, which used to represent a challenge. We present two alternative workflows for the structure determination of protein microcrystals by X-ray crystallography with a particular focus on crystals grown in vivo. The microcrystals are either extracted from cells by sonication and purified by differential centrifugation, or analyzed in cellulo after cell sorting by flow cytometry of crystal-containing cells. Optionally, purified crystals or crystal-containing cells are soaked in heavy atom solutions for experimental phasing. These samples are then prepared for diffraction experiments in a similar way by application onto a micromesh support and flash cooling in liquid nitrogen. We briefly describe and compare serial diffraction experiments of isolated microcrystals and crystal-containing cells using a microfocus synchrotron beamline to produce datasets suitable for phasing, model building and refinement.
These workflows are exemplified with crystals of the Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) polyhedrin produced by infection of insect cells with a recombinant baculovirus. In this case study, in cellulo analysis is more efficient than analysis of purified crystals and yields a structure in ~8 days from expression to refinement.

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

A protocol is presented for X-ray crystallography using protein microcrystals. Two examples analyzing in vivo-grown microcrystals after purification or in cellulo are compared.

단백질 결정의 미세 결정학 및<em&gt; 셀룰로에서</em&gt; 회절

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

연구

생화학

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, &#945;-helical and &#946;-barrel. While &#945;-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, &#946;-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite &#946;-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target &#946;-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

&#946;-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of &#946;-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

화학

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to precisely maneuver the nucleation and crystal growth towards desired sizes of protein crystals. The controlled crystallization is based on sample investigation with in situ Dynamic Light Scattering (DLS) while all visual changes in the droplet are monitored online with the help of a microscope coupled to a CCD camera, thus enabling a full investigation of the protein droplet during all stages of crystallization. The use of in situ DLS measurements throughout the entire experiment allows a precise identification of the highly supersaturated protein solution transitioning to a new phase &#8211; the formation of crystal nuclei. By identifying the protein nucleation stage, the crystallization can be optimized from large protein crystals to the production of protein microcrystals. The experimental protocol shows an interactive crystallization approach based on precise automated steps such as precipitant addition, water evaporation for inducing high supersaturation, and sample dilution for slowing induced homogeneous nucleation or reversing phase transitions.

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Here we present a protocol for controlled production of protein microcrystals. The process uses an automated device allowing controlled manipulation of several crystallization parameters. The protein crystallization is carried-out by controlled and automated addition of crystallization solutions while monitoring and investigating the radius distribution of particles in the crystallization droplet.

사용 하 여 다른 크기와 성장 단백질 결정 자동화 현장에서 동적 산란과 함께 결정 화

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The devices are patterned from epoxy glue using soft lithography and are suitable for in situ X-ray diffraction experiments at room temperature. The sample wells are lidded on both sides with polymeric polyimide foil windows that allow diffraction data collection with low X-ray background. This fabrication method is undemanding and inexpensive. After the sourcing of a SU-8 master wafer, all fabrication can be completed outside of a cleanroom in a typical research lab environment. The chip design and fabrication protocol utilize capillary valving to microfluidically split an aqueous reaction into defined nanoliter sized droplets. This loading mechanism avoids the sample loss from channel dead-volume and can easily be performed manually without using pumps or other equipment for fluid actuation. We describe how isolated nanoliter sized drops of protein solution can be monitored in situ by dynamic light scattering to control protein crystal nucleation and growth. After suitable crystals are grown, complete X-ray diffraction datasets can be collected using goniometer based in situ fixed target serial X-ray crystallography at room temperature. The protocol provides custom scripts to process diffraction datasets using a suite of software tools to solve and refine the protein crystal structure. This approach avoids the artefacts possibly induced during cryo-preservation or manual crystal handling in conventional crystallography experiments. We present and compare three protein structures that were solved using small crystals with dimensions of approximately 10-20 &#181;m grown in chip. By crystallizing and diffracting in situ, handling and hence mechanical disturbances of fragile crystals is minimized. The protocol details how to fabricate a custom X-ray transparent microfluidic chip suitable for in situ serial crystallography. As almost every crystal can be used for diffraction data collection, these microfluidic chips are a very efficient crystal delivery method.

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

This protocol describes in detail how to fabricate and operate microfluidic devices for X-ray diffraction data collection at room temperature. Additionally, it describes how to monitor protein crystallization by dynamic light scattering and how to process and analyze obtained diffraction data.

현장에서 크리스탈 x-선 회절 및 현장에서 직렬 결정학에 대 한 동적 빛 산란에 대 한 미세 칩

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray free electron lasers (XFELs). A series of experiments using the light-driven proton pump bacteriorhodopsin have further established these injectors as a preferred option to deliver crystals for time-resolved serial femtosecond crystallography (TR-SFX) to resolve structural changes of proteins after photoactivation. To obtain multiple structural snapshots of high quality, it is essential to collect large amounts of data and ensure clearance of crystals between every pump laser pulse. Here, we describe in detail how we optimized the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals for our recent TR-SFX experiments at the Linac Coherent Light Source (LCLS). The goal of the method is to optimize extrusion for a stable and continuous flow while maintaining a high density of crystals to increase the rate at which data can be collected in a TR-SFX experiment. We achieve this goal by preparing lipidic cubic phase with a homogenous distribution of crystals using a novel three-way syringe coupling device followed by adjusting the sample composition based on measurements of the extrusion stability taken with a high-speed camera setup. The methodology can be adapted to optimize the flow of other microcrystals. The setup will be available for users of the new Swiss Free Electron Laser facility.

The success of a time-resolved serial femtosecond crystallography experiment is dependent on efficient sample delivery. Here, we describe protocols to optimize the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals from a high viscosity micro-extrusion injector. The methodology relies on sample homogenization with a novel three-way coupler and visualization with a high-speed camera.

X 선 레이저에서 직렬 펨 결정학 시간 해결에 대 한 Microcrystals의 고 점도 압출을 개선

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial crystallography experiments at both synchrotrons and XFELs. The method is based upon an understanding of the protein crystal phase diagram, and how that knowledge can be utilized. The method is divided into three stages: (1) optimizing crystal morphology, (2) transitioning to batch, and (3) scaling. Stage 1 involves finding well diffracting, single crystals, hopefully but not necessarily, presenting in a cube-like morphology. In Stage 2, the Stage 1 condition is optimized by crystal growth time. This strategy can transform crystals grown by vapor diffusion to batch. Once crystal growth can occur within approximately 24 h, a morphogram of the protein and precipitant mixture can be plotted and used as the basis for a scaling strategy (Stage 3). When crystals can be grown in batch, scaling can be attempted, and the crystal size and concentration optimized as the volume is increased. Endothiapepsin has been used as a demonstration protein for this protocol. Some of the decisions presented are specific to endothiapepsin. However, it is hoped that the way they have been applied will inspire a way of thinking about this procedure that others can adapt to their own projects.

The aim of this article is to give the viewer a solid understanding of how to transform their small-volume, vapor-diffusion protocol, for growing large, single protein crystals, into a large-volume batch micro-crystallization method for serial crystallography.

연속 결정학 실험을 위한 Endothiapepsin 결정의 성장 최적화

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Lipidic Mesophases를 사용하여 구조 결정을위한 막 단백질 Crystallizing

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

생물학

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug discovery. To date, X-ray crystallography remains the most successful method for solving three-dimensional protein structures at atomic resolution. With recent advances in serial crystallography, either using X-ray free electron lasers (XFELs) or synchrotron light sources, protein crystallography has progressed to the next frontier, where the ability to acquire time-resolved data provides important mechanistic insights into the behavior of biological molecules at room temperature. This protocol describes a straightforward high-throughput (HTP) workflow for screening crystallization conditions through the use of a 96-well dialysis plate. These plates follow the Society for Biomolecular Screening (SBS) standard and can be easily set up using any standard crystallization laboratory. Once optimal conditions are identified, large quantities of crystals (hundreds of microcrystals) can be produced using the dialyzer. To validate the robustness and versatility of this approach, four different proteins were crystallized, including two membrane proteins.

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

The presented protocol describes a straightforward approach for screening protein crystallization conditions and crystal growth using a 96-well high-throughput dialysis plate. The use of dialyzer tubes for the large-scale growth of microcrystals is also demonstrated for serial crystallography and MicroED applications.

Microdialysis를 통한 High-Throughput Protein Crystallization

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...

Lipidic Bicelles에서 ABC Transporter Membrane Proteins의 결정화

ABCG5/G8 Crystallization in a Lipidic Bicelle Environment for X-Ray Crystallography

ATP-binding cassette (ABC) transporters constitute lipid-embedded membrane proteins. Extracting these membrane proteins from the lipid bilayer to an aqueous environment is typically achieved by employing detergents. These detergents disintegrate the lipid bilayer and solubilize the proteins. The intrinsic habitat of membrane proteins within the lipid bilayer poses a challenge in maintaining their stability and uniformity in solution for structural characterization. Bicelles, which comprise a blend of long and short-chain phospholipids and detergents, replicate the natural lipid structure. The utilization of lipid bicelles and detergents serves as a suitable model system for obtaining high-quality diffraction crystals, specifically to determine the high-resolution structure of membrane proteins. Through these synthetic microenvironments, membrane proteins preserve their native conformation and functionality, facilitating the formation of three-dimensional crystals. In this approach, the detergent-solubilized heterodimeric ABCG5/G8 was reintegrated into DMPC/CHAPSO bicelles, supplemented with cholesterol. This setup was employed in the vapor diffusion experimental procedure for protein crystallization.

저자 스포트라이트: 약물 개발을 촉진하기 위한 ABC 수송체 막 단백질의 이중세포 결정화 설정 

This protocol describes a setup for the crystallization of the sterol transporter ABCG5/G8. ABCG5/G8 is reconstituted into bicelles for hanging-drop crystallization. The protocol does not require specialized materials or substrates, making it accessible and easy to adapt in any laboratory for determining the protein structure through X-ray crystallography.

X선 결정학을 위한 지질 이중세포 환경에서의 ABCG5/G8 결정화

ATP-binding cassette (ABC) transporters constitute lipid-embedded membrane proteins. Extracting these membrane proteins from the lipid bilayer to an ...

준비 및 직렬 펨토초 결정학에 대한 지질 큐빅 단계에서 단백질 미세 배달

요약

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단백질 결정의 미세 결정학 및

β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에

사용 하 여 다른 크기와 성장 단백질 결정 자동화 현장에서 동적 산란과 함께 결정 화

현장에서 크리스탈 x-선 회절 및 현장에서 직렬 결정학에 대 한 동적 빛 산란에 대 한 미세 칩

X 선 레이저에서 직렬 펨 결정학 시간 해결에 대 한 Microcrystals의 고 점도 압출을 개선

연속 결정학 실험을 위한 Endothiapepsin 결정의 성장 최적화

Lipidic Mesophases를 사용하여 구조 결정을위한 막 단백질 Crystallizing

Microdialysis를 통한 High-Throughput Protein Crystallization

X선 결정학을 위한 지질 이중세포 환경에서의 ABCG5/G8 결정화

X선 결정학을 위한 지질 이중세포 환경에서의 ABCG5/G8 결정화