İnsan bağırsak mikrobiyotasında C-glikozit metabolik enzimlerini karakterize etmek için yapısal biyoloji ve analitik kimya yaklaşımları. Protokol. Birincisi, protein üretimi ve saflaştırılması. İfade vektörünün inşası.
NCBI'den GenBank LC422372.1 gen kümesi dizisini elde edin. Genleri modifiye edilmiş bir pET-28a vektörüne klonlayın. Plazmitleri E.coli BL21 DE3 yetkin hücrelere dönüştürün.
Daha sonra bakterileri LB ortamında 37 derecede mililitre kanamisin başına 50 mikrogram ile kültürleyin. Bakteri yoğunluğu OD600 0.6'ya ulaştığında ortama 0.2 milimol IPTG ekleyin. Bakterileri 16 saat boyunca 16 derecede kültürleyin.
Bakteri kültürünü dört derecede 4.000 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve bakteri peletini koruyun. Bakteri peletini Tampon A'da yeniden süspanse edin. Proteinin saflaştırılması.
Bakteriyel resüspanse bir milimol PMSF ekleyin. Bakteri süspansiyonunu ultrasonik bir hücre kırıcı ile parçalayın. Bakteriyel lizatı dört derecede 40 dakika boyunca 48.000 kez g'de santrifüjleyin.
Nikel afinite kromatografisi NTA kolonunu kullanarak süpernatanttaki proteini saflaştırın. Bağlı proteini Tampon B ile bir gradyanda elute edin. Bir sonraki adım için SDS-PAGE'den yüksek UV 280 nanometre absorpsiyonu ve berrak protein bantlarına sahip numuneler toplayın.
Numuneleri Tampon C'ye karşı diyaliz edin. Bir iyon değişim kromatografisi sütunu kullanarak diyaliz proteini saflaştırın. Hedef proteini Tampon C ile kolona bağlayın. Bağlı proteini Tampon D bileşeni ile elute edin. Tampon E ile bir boyut dışlama sütunu kullanarak proteini saflaştırın. Bir sonraki adım için protein örneklerini toplayın.
Protein örneklerini mililitre başına 20 miligrama konsantre edin, alikot edin, hızla sıvı nitrojen ile dondurun. İleride kullanmak üzere 80 derecede saklayın. UV 280 nanometre ile QuickDrop kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün.
Dairesel dikroizm, CD, spektrum veri toplama. Proteinleri bir kez PBS tamponunda, pH 7.4'te mililitre başına 0.2 miligrama seyreltin. Cihaz tarama hızını dakikada 50 nanometreye ve spektral bant genişliğini bir nanometreye ayarlayın.
200 ila 260 nanometre dalga boyu aralığında CD spektral verilerini toplayın. PBS arka planını çıkarın ve üç ölçümden ortalama değeri alın. İki, protein kristalografisi ve yapılandırılmış tayin.
Protein kristali büyümesi ve optimizasyonu. 48 oyuklu kristal plakalar üzerinde protein kristalizasyon kitlerini kullanarak oturma-bırakma yöntemiyle kristalizasyon ilk taramasını gerçekleştirin. Asılı bırakma yöntemini kullanarak protein kristalleşmesini optimize etmek için çökeltici ve protein konsantrasyonu gradyanlarını ayarlayın.
Kristalleri, tam büyümeden sonra 30 dakika boyunca 16 derecede rezervuar tamponu ve hedef bileşikler içeren bir ıslatma çözeltisine aktarın. Kristalleri, %25 gliserol takviyeli kristalizasyon tamponu içeren bir kriyoprotektan çözeltisine aktarın ve veri toplama için hemen sıvı nitrojen içinde saklayın. Protein kristallerinin veri toplanması ve yapılandırılmış tayini.
0.978 angstrom dalga boylarını kullanarak NFPS'nin SSRF'sinin ışın hatlarında X-ışını kırınım verilerinin tamamını toplayın. Kristal kırınım verilerini başlangıçta programın kristalografik veri işleme yazılımını kullanarak işleyin. Otomatik bir veri işleme programı kullanarak aşamalandırma gerçekleştirin.
Otomatik yapı modeli iyileştirme ve optimizasyonu için kristal yapı belirleme yazılımı kullanın. Üç, reaksiyon aktivitesinin izlenmesi ve kinetik parametrelerin belirlenmesi. HPLC ile DgpA/B/C aktivitesinin izlenmesi.
C-glikozit bölünme reaksiyon sistemini, mililitre DgpA / B / C başına 20 mikromol, litre manganez iyonu başına bir milimol, litre NAD başına bir milimol, litre DTT başına 10 milimol ve litre substrat başına 0.1 milimol içeren PBS tamponu, pH 7.4'te birleştirin, puerarin, daidzin, genistin. Pipetleyerek iyice karıştırın ve 37 derecede sekiz saat inkübe edin. Reaksiyonu sonlandırmak için reaksiyon sistemine üç kat daha fazla metanol ekleyin.
Çökeltiyi çıkarmak için reaksiyon çözeltisini 15 dakika boyunca 16.000 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı 0.22 mikrometre filtre membranı kullanarak filtreleyin. Dakikada bir mililitre akış hızında, UV 265 nanometre algılama dalga boylarında ve 10 mikrolitrelik bir enjeksiyon hacminde gradyan elüsyon ile HPLC analizi yapın.
2, 6-diklorofenol indofenol, DCPIP, tahlil ile DgpA aktivitesinin izlenmesi. Litre DCPIP başına 0.8 milimol, litre protein başına 50 mikromol ve litre substrat başına 10 milimol bir kez PBS tamponunda, pH 7.4'te inkübe edin. 20 saatlik reaksiyondan sonra, bir mikroplaka okuyucu kullanarak DCPIP'nin absorbans değişimini 600 nanometrede kaydedin.
Puerarin'in C-glikosidik bağ bölünme reaksiyonu üzerindeki glikozun inhibisyon hızının belirlenmesi. Reaksiyonu, bölüm 3.1'de açıklandığı gibi reaksiyon sistemine farklı glikoz konsantrasyonlarında bir kez PBS tamponunda, pH 7.4'te gerçekleştirin. Reaksiyonu 12 saat boyunca 37 derecede gerçekleştirin.
HPLC kullanarak üretilen ürünlerin kantitatif analizini yapın. Kinetik parametrelerin belirlenmesi. Puerarin konsantrasyonu litre başına 0.01 ila dört milimol arasında ayarlanmıştır ve daidzin ve genistin, DgpA / B / C C-glikozit bölünme reaksiyonunda litre başına 0.01 ila iki milimol arasındaydı.
Reaksiyonu, bölüm 3.1'de açıklanan yönteme göre sekiz saat boyunca 37 derecede gerçekleştirin. Hesaplanan reaksiyon hızını ve substrat konsantrasyonunu Prizma'da bir Michaelise-Menten modeline uydurarak Km ve kcat kinetik parametrelerini türetin. Dört, reaksiyon ara ürününün hazırlanması ve tespiti.
Reaksiyon ara ürününün hazırlanması. 90 mililitrelik bir reaksiyon sistemi ile bölüm 3.1'de açıklanan yöntemlere göre reaksiyonu gerçekleştirmek için substrat olarak daidzin ve genistin kullanın. Hazırlayıcı bir sıvı kromatografi kolonuna sahip hazırlayıcı bir HPLC kullanarak ara ürünü saflaştırın.
Saflaştırılmış ara ürünleri ileride kullanmak üzere vakumlu bir santrifüj yoğunlaştırıcı ile kurutun. LC-MS ile reaksiyon ara ürününün karakterizasyonu. Saflaştırılmış ara ürünlerin bir kısmını, her bir bileşiğin mililitre başına 50 mikrogramda çözeltilerini hazırlamak için metanol içinde daidzin ve genistin reaksiyonlarından çözün.
10 dakika boyunca 13.500 kez g'de santrifüjleyin ve LC-MS / MS analizi için kullanıcıları toplayın. Beş mikrolitrelik bir enjeksiyon hacmi ile LC-MS analizi için HPLC analizinde olduğu gibi aynı gradyan elüsyon programını kullanın. NMR ile reaksiyon ara ürününün karakterizasyonu.
Saflaştırılmış ara ürünlerin bir kısmını, proton ve karbon 13 NMR spektroskopisi için dimetil sülfoksit döteryumlu altıda daidzin reaksiyonundan çözün. NMR spektrumlarını bir proton için 400 megahertz'de bir NMR cihazında kaydedin. NMR spektrumlarını karbon 13 için 175 megahertz'de bir NMR cihazında kaydedin.
Temsili sonuçlar. Genel olarak, protein üretimi ve saflaştırılması, kristalizasyon deneyleri, aktivite deneyleri ve şekil bir'de reaksiyon ürünü yapılarının tanımlanmasını içeren birleşik bir deneysel yaklaşım tasarladık. Spesifik olarak, şekil ikide üç aşamalı bir saflaştırma kromatografisi, iyon değişim kromatografisi ve jel filtrasyon kromatografisi yoluyla yüksek saflıkta proteinler elde ettik.
Kristalizasyon deneylerinde, Şekil 3A'dan D'ye kadar sırasıyla 2.7 angstrom ve 2.1 angstrom çözünürlüğe sahip DgpA'nın kristal yapılarını ve DgpB/C kompleksini belirledik. Daha sonra, şekil 3E'de glikozun DgpA'nın substrat tanıma cebinde anahtar amino asitlerle bir hidrojen bağı ağı oluşturduğunu bulduk. Buna dayanarak, mutantları tasarladık ve şekil 3J'deki kinetik parametreleri kullanarak substrat bölünme aktivitelerini değerlendirdik.
İlginç bir şekilde, O-glikosidik flavonoidlerin ve DgpA/B/C'nin bölünmesi sırasında, şekil 4A ve B'de ara bileşiklerin oluşumunu gözlemledik.Bu ara ürünler, şekil 4C'den H'ye NMR ve LC-MS analizi yoluyla C-glikosidik flavonoidler olarak tanımlandı, bu da DgpA/B/C'nin O-glikozitleri C-glikozitlere dönüştürebileceğini gösteriyor.Sonuç. C-glikozitler metabolizma enzimlerinin yapısını ve fonksiyonel özelliklerini incelemek için kimya ve biyoteknolojinin entegrasyonuna öncülük ettik ve bunun makul ve pratik bir çözüm olduğunu gösterdik. Bu yaklaşım, alandaki araştırma metodolojilerindeki boşlukları doldurur ve farklı metabolik işlevlere sahip diğer genlere kolayca uygulanabilir.
Bu nedenle, diğer bağırsak mikrobiyal fonksiyonel proteinlerinin yapısal ve fonksiyonel özellikleri üzerine gelecekteki çalışmalar için yeni bir referans model de sağlar.
