생체 내 RNA에 결합하는 단백질의 특성화는 RNA의 복잡한 특성과 단백질과의 상호 작용에 영향을 미치는 많은 요인으로 인해 주요 과제로 남아 있습니다. RNA 결합 단백질 또는 RBP-RNA 친화성은 살아있는 세균 세포 내부에서 측정된다. 세포 환경은 RNA와 결과 RBP-RNA 결합의 구조 모두에 영향을 미치기 때문에 생체 내의 친화성을 측정하는 것은 자연 시스템에서 이러한 상호 작용을 이해하는 데 매우 중요합니다.
성공의 비결은 플라스미드의 디자인입니다. 디자인은 델타의 여러 파도를 사용하고 정지 코돈과 프레임 시프트 돌연변이의 삽입을 피해야한다. 바인딩 사이트 카세트를 디자인하여 이 프로토콜을 시작합니다.
각 미니 유전자에는 EagI 제한 부위, 카나마이신 저항 유전자의 5개의 프라임 엔드로부터 40개의 염기, pLac/Ara 프로모터, 리보솜 결합 부위, 8월 mCherry 유전자, 스페이서, RBP 결합 부위, mCherry 유전자의 5개의 최종로부터 80개의 염기, 및 ApaLI 제한 부위가 포함되어 있다. 분석의 성공률을 높이기 위해 각 바인딩 부위에 대해 최소 1개, 2개 및 3개의 베이스로 구성된 스페이서에 대해 3개의 바인딩 사이트 카세트를 설계합니다. 다이제스트의 컬럼 정화를 수행하기 전에 EagI HF 및 아파리를 통해 미니 유전자와 표적 벡터를 모두 이중 소화한다.
mCherry 리포터 유전자, 종기 및 가나마이신 저항 유전자의 나머지 부분을 포함하는 결합 부위 백본에 소화된 미니 유전자를 리게이트합니다. 그런 다음 결찰 용액을 대장균 상위 10개 세포로 변환합니다. Sanger 시퀀싱을 통해 양성 변혁제를 식별한 후 96°C의 정제된 플라스미드를 영하 20도의 우물 형식으로 보관하십시오.
또한 혈당 육로 주식으로 세균 균주를 저장 96 영하 80도에서 잘 형식. 사용자 정의 순서는 끝에 제한 사이트가있는 이중 좌초 DNA 미니 유전자로 정지 코돈이 부족한 필요한 RBP 서열을 한다. 준비된 플라스미드를 이미 RBP mCerulean 플라스미드를 함유한 화학적으로 유능한 세균 세포로 변환합니다.
시간을 절약하기 위해, 관련 항생제와 Luria-Bertani 천을 포함하는 8 개의 레인 플레이트에 8 채널 파이프터를 사용하여 세포를 판화. 식민지는 섭씨 37도에서 16 시간 동안 나타나야합니다. 각 이중 변압제에 대한 단일 콜로니를 선택하고 적절한 항생제로 LB1.5 밀리리터를 포함하는 48 개의 웰 플레이트로 옮길 수 있습니다.
250 RPM에서 흔들리는 섭씨 37도에서 18 시간 동안 세포를 성장시면 됩니다. 글리세롤 주식으로 하룻밤을 저장 영하 80 도 96 잘 접시에 섭씨. 아침에는 로봇을 프로그래밍하여 96개의 웰 플레이트에서 반모공 배지 또는 SPM 의 180 마이크로리터를 따뜻하게 합니다.
유도플레이트를 준비하도록 로봇을 프로그래밍한다. 깨끗한 96 웰 플레이트에서 95 %의 BA와 5 %의 LB로 구성된 SPM으로 우물을 준비하십시오. 우물의 수는 유도제 농도의 원하는 수에 해당한다.
유도체 농도가 가장 높은 유도체 플레이트의 우물에 C4-HSL을 추가합니다. 다음으로, 로봇을 프로그래밍하여 각 고농도 우물에서 0에서 218 나노몰러까지 23개의 낮은 농도로 배지를 연속적으로 희석시 한다. 각 유도제 희석의 부피는 모든 균주에 충분해야 합니다.
하룻밤 균주를 희석하기 위해 로봇을 48 웰 플레이트에 SPM 180 마이크로리터와 박테리아 20 마이크로리터를 혼합하여 10배의 배분으로 희석하도록 프로그래밍합니다. 그런 다음 희석된 용액에서 20마이크로리터를 형광 측정에 적합한 미리 준비된 균질 플레이트로 복용하여 10배의 계수로 다시 희석한다. 이제 로봇을 프로그래밍하여 최종 농도에 따라 희석된 균주와 함께 유도판으로부터 96웰 플레이트에 희석유도자를 첨가한다.
6시간 동안 섭씨 37도에서 96개의 우물판을 흔들어 보냅니다. 이 기간 동안, 30분마다 플레이트 리더기를 통해 595 나노미터의 광학 밀도 또는 OD뿐만 아니라 mCherry 및 mCerulean 형광을 측정하십시오. 정규화를 위해 셀이 첨가되지 않은 SPM의 성장을 측정합니다.
여기에 는 양수 변형에 대한 3차원 플롯이 표시됩니다. 플롯은 원시 OD 수준, mCerulean 형광 및 mCherry 형광을 시간 및 유도기 농도의 함수로 묘사합니다. mCerulean 정상 상태 발현 수준은 양수 및 음수 균주 모두에 대한 각 유도체 농도에 대해 계산되었다.
mCherry 생산 속도는 또한 양수 및 음수 균주 모두에 대한 각 유도기 농도에 대해 계산되었다. mCherry 생산 속도는 두 개의 균주에 대한 두 개의 생물학적 중복을 통해 평균 평균 평균 mCerulean 형광의 함수로 플롯되었다. 피팅 공식을 사용하는 적합 KRBP는 특정 결합 반응을 나타내는 양성 균주에 대해 도시된다.
음수 변형의 경우 KRBP 값이 추출되지 않았습니다. 정규화된 투여량 반응 곡선은 서로 다른 위치에서 10개의 결합 부위로서 2개의 RBP를 기반으로 30개의 다른 균주에 대해 결정되었다. 세 가지 유형의 응답이 관찰되고, 선호도가 높고, 선호도가 낮으며, 친화력이 없습니다.
여기에 표시된 2개의 RBPs를 위한 정량적인 KRBP 결과, MS2 코트 단백질 및 10개의 상이한 결합 사이트 카세트를 가진 PP7 코트 단백질. 4개의 다른 위치에서 돌연변이 결합 부위를 가진 MS2 코트 단백질에 대한 투여량 반응 곡선은 mCherry 생산에 대한 돌연변이 간격의 효과를 보여주기 위해 여기에 도시된다. 테스트된 돌연변이 바인딩 사이트의 시퀀스가 표시됩니다.
단백질-RNA 복합체의 구조를 화학적으로 조사하고 RNA 결합에 의해 영향을받는 mRNA 영역을 시각화하고자 하는 모양과 같은 구조 적 기술을 사용하는 것이 중요하다. 최근에는 이 기술을 높은 처리량 방식으로 사용하여 RBP의 선호도를 동시에 10, 000 바인딩 사이트로 측정했습니다.
