La caracterización de la unión a proteínas al ARN in vivo sigue siendo un desafío importante debido a la naturaleza compleja del ARN y a los muchos factores que afectan su interacción con las proteínas. La proteína de unión al ARN o la afinidad RBP-ARN se mide dentro de las células bacterianas vivas. Dado que el entorno celular afecta tanto a la estructura del ARN como a la unión resultante al RBP-ARN, medir la afinidad in vivo es crucial para comprender tales interacciones en sistemas naturales.
El secreto del éxito está en el diseño de los plásmidos. El diseño debe utilizar varias ondas de delta y evitar la inserción de codones de parada y mutaciones de cambio de marco. Comience este protocolo diseñando el casete del sitio de enlace.
Cada mini gen contiene un sitio de restricción EagI, 40 bases del extremo final principal del gen de resistencia a la kanamicina, el promotor pLac/Ara, el sitio de unión ribosoma, AUG del gen mCherry, un espaciador, un sitio de unión RBP, 80 bases del extremo final de los cinco genes mCherry y un sitio de restricción de ApaLI. Para aumentar la tasa de éxito del ensayo, diseñe tres casetes de sitio de enlace para cada sitio de enlace con espaciadores que constan de al menos una, dos y tres bases. Digerir dos veces los mini genes y el vector objetivo con EagI HF y ApaLI antes de realizar la purificación de columnas de los resúmenes.
Ligar los mini genes digeridos a la columna vertebral del sitio de unión que contiene el resto del gen del reportero mCherry, terminador y un gen de resistencia a la kanamicina. A continuación, transforme la solución de ligadura en Escherichia coli en las 10 células principales. Después de identificar transformantes positivos a través de la secuenciación de Sanger, almacene plásmidos purificados en el formato de 96 pozos a menos 20 grados centígrados.
También almacenar las cepas bacterianas como stocks de glicerol en el formato de 96 pozos en menos 80 grados Celsius. Orden personalizado la secuencia RBP requerida que carece de un codón de parada como un mini gen de ADN de doble cadena con sitios de restricción en los extremos. Transforme los plásmidos preparados en células bacterianas químicamente competentes que ya contienen un plásmido mCeruleano RBP.
Para ahorrar tiempo, vajilla las células usando un pipeteador de ocho canales en placas de ocho carriles que contienen agar Luria-Bertani con antibióticos relevantes. Las colonias deben aparecer en 16 horas a 37 grados centígrados. Seleccione una sola colonia para cada doble transformador y transfiera a 48 placas de pozo que contengan 1,5 mililitros de LB con antibióticos apropiados.
Cultivar las células durante un período de 18 horas a 37 grados Celsius temblando a 250 RPM. Almacene las pernoctaciones como existencias de glicerol a menos 80 grados centígrados en placas de 96 pozos. Por la mañana, programe el robot para calentar 180 microlitros de medio semi-poro o SPM en 96 placas de pozo.
Programe el robot para preparar la placa inductor. En una placa limpia de 96 pozos, prepare pozos con SPM que consta de 95%BA y 5%LB. El número de pozos corresponde al número deseado de concentraciones de inductores.
Añadir C4-HSL a los pozos en la placa inductor que contendrá la mayor concentración de inductores. A continuación, programe el robot para diluir en serie el medio de cada uno de los pozos de mayor concentración en 23 concentraciones más bajas que van de cero a 218 nanomolares. El volumen de cada dilución del inductor debe ser suficiente para todas las cepas.
Para diluir las cepas de la noche, programe el robot para que se diluya por un factor de 10 mezclando 20 microlitros de bacterias con 180 microlitros de SPM en 48 placas de pozo. A continuación, diluir de nuevo por un factor de 10 tomando 20 microlitros de la solución diluida en la placa de tensión pre-preparada adecuada para la medición fluorescente. Ahora programe el robot para añadir el inductor diluido de la placa inductor a las placas de 96 pozos con las cepas diluidas de acuerdo con las concentraciones finales.
Agitar las placas de 96 pozos a 37 grados centígrados durante seis horas. Durante ese tiempo, tome medidas de la densidad óptica u OD a 595 nanómetros, así como de la fluorescencia mCherry y mCerulean a través de un lector de placas cada 30 minutos. Para fines de normalización, mida el crecimiento de SPM sin células añadidas.
Aquí se muestran parcelas tridimensionales para una cepa positiva. Las gráficas representan los niveles de OD crudos, la fluorescencia mCerulean y la fluorescencia mCherry en función del tiempo y la concentración del inductor. Se calcularon los niveles de expresión de estado estacionario de mCerulean para cada concentración de inductor para las cepas positivas y negativas.
La tasa de producción de mCherry también se calculó para cada concentración de inductor para cepas positivas y negativas. La tasa de producción de mCherry se estableció en función de la fluorescencia mceruleana media de más de dos duplicados biológicos para dos cepas. El ajuste KRBP utilizando la fórmula de ajuste se muestra para la tensión positiva que exhibe una respuesta de unión específica.
Para la cepa negativa, no se extrajo ningún valor KRBP. Las curvas de respuesta a dosis normalizadas se determinaron para 30 cepas diferentes basadas en dos PBP como 10 sitios de unión en diferentes ubicaciones. Se observan tres tipos de respuestas, alta afinidad, baja afinidad y sin afinidad.
Aquí se muestran resultados cuantitativos de KRBP para dos RBP, proteína de recubrimiento MS2 y proteína de recubrimiento PP7 con 10 casetes de sitio de unión diferentes. Las curvas de respuesta a la dosis para la proteína de recubrimiento MS2 con un sitio de unión mutada en cuatro ubicaciones diferentes se muestran aquí para demostrar el efecto del espaciado mutante en la producción de mCherry. Se muestra la secuencia del sitio de enlace mutado probado.
Es importante utilizar una técnica estructural como la forma de buscar químicamente la estructura del complejo proteína-ARN y visualizar qué regiones de ARNm se ven afectadas por la unión al ARN. Recientemente, utilizamos esta técnica de una manera de alto rendimiento para medir simultáneamente la afinidad de los RMP a 10.000 sitios de enlace.
