لا يزال توصيف البروتين الملزم للرنا في الجسم الحي تحديا كبيرا بسبب الطبيعة المعقدة للرنا النووي الريبي والعديد من العوامل التي تؤثر على تفاعله مع البروتينات. يتم قياس البروتين ربط الحمض النووي الريبي أو تقارب RBP-RNA داخل الخلايا البكتيرية الحية. منذ البيئة الخلوية يؤثر على كل من هيكل الجيش الملكي النيبالي وما ينتج عنها RBP-RNA ملزمة، وقياس التقارب في الجسم الحي أمر بالغ الأهمية لفهم مثل هذه التفاعلات في النظم الطبيعية.
سر النجاح هو في تصميم البلازميدات. يجب أن يستخدم التصميم عدة موجات من دلتا وتجنب إدخال كودون وقف وطفرات frameshift. ابدأ هذا البروتوكول عن طريق تصميم شريط موقع الربط.
كل جين صغير يحتوي على موقع تقييد EagI ، 40 قاعدة من النهاية الخمسة الرئيسية لجين مقاومة كاناميسين ، ومروج pLac / Ara ، وموقع الربط الريبوسومي ، AUG من جين mCherry ، و spacer ، وموقع ملزم RBP ، و 80 قاعدة من النهاية الخمسة الرئيسية لجين MCherry ، وموقع تقييد ApaLI. لزيادة معدل نجاح المقايسة ، وتصميم ثلاثة أشرطة موقع ملزم لكل موقع ملزم مع الفواصل التي تتكون من واحد على الأقل ، اثنين وثلاث قواعد. مضاعفة هضم كل من الجينات المصغرة والمتجه الهدف مع إيجي HF و ApaLI قبل إجراء تنقية العمود من الهضمات.
Ligate الجينات المصغرة المهضمة إلى العمود الفقري لموقع الربط الذي يحتوي على بقية جين المراسل mCherry ، المنهي وجين مقاومة kanamycin. ثم تحويل حل الربط إلى Escherichia القولونية أعلى 10 خلايا. بعد تحديد التحويلات الإيجابية عبر تسلسل Sanger ، قم بتخزين plasmids المنقى في شكل 96 بئرًا عند ناقص 20 درجة مئوية.
أيضا تخزين السلالات البكتيرية والأرصدة الجلسرين في شكل 96 جيدا في ناقص 80 درجة مئوية. ترتيب مخصص تسلسل RBP المطلوبة تفتقر إلى codon وقف جين مصغرة الحمض النووي تقطعت بهم السبل مع مواقع تقييد في نهايات. تحويل البلازميدات المعدة إلى خلايا بكتيرية مختصة كيميائيا تحتوي بالفعل على بلازميد mCerulean RBP.
لتوفير الوقت، قم بطبق الخلايا باستخدام أنبوب قناة ثمانية على ثمانية لوحات حارة تحتوي على لوريا-بيرتاني أجار مع المضادات الحيوية ذات الصلة. المستعمرات يجب أن تظهر في 16 ساعة في 37 درجة مئوية. حدد مستعمرة واحدة لكل محول مزدوج ونقلها إلى 48 صحون بئر تحتوي على 1.5 ملليلتر من LB مع المضادات الحيوية المناسبة.
تنمو الخلايا على مدى فترة 18 ساعة في 37 درجة مئوية تهتز في 250 دورة في الدقيقة. تخزين الأسهم بين عشية وضحاها كما الجلسرين في ناقص 80 درجة مئوية في 96 لوحات جيدا. في الصباح، برنامج الروبوت لتدفئة 180 ميكرولترات من نصف المسام المتوسطة أو SPM في 96 لوحات جيدا.
برنامج الروبوت لإعداد لوحة محرض. في لوحة نظيفة 96 جيدا، وإعداد الآبار مع SPM تتكون من 95٪ BA و 5٪ LB. ويقابل عدد الآبار العدد المطلوب من تركيزات الحفز.
إضافة C4-HSL إلى الآبار في لوحة مستحث التي سوف تحتوي على أعلى تركيز تحريض. بعد ذلك ، قم ببرمجة الروبوت لتخفيف الوسط بشكل متسلسل من كل بئر من أعلى آبار التركيز إلى 23 تركيزًا أقل تتراوح بين صفر و 218 نانوموللار. حجم كل تخفيف تحريض ينبغي أن تكون كافية لجميع السلالات.
لتخفيف السلالات بين عشية وضحاها، قم ببرمجة الروبوت لتمييعه بعامل 10 عن طريق خلط 20 ميكرولتر من البكتيريا مع 180 ميكرولترات من SPM في 48 لوحة جيدة. ثم تخفيف مرة أخرى من قبل عامل 10 عن طريق اتخاذ 20 ميكرولترات من الحل المخفف في لوحة سلالة معدة مسبقا مناسبة لقياس الفلورسنت. الآن برنامج الروبوت لإضافة المستحث المخفف من لوحة محرض للوحات 96 جيدا مع سلالات مخففة وفقا لتركيزات النهائي.
هز 96 بئر في 37 درجة مئوية لمدة ست ساعات. خلال ذلك الوقت، تأخذ قياسات الكثافة البصرية أو OD في 595 نانومتر، فضلا عن mCherry و المفلورة mCerulean عن طريق قارئ لوحة كل 30 دقيقة. لأغراض التطبيع، وقياس نمو SPM مع عدم إضافة الخلايا.
تظهر هنا هي المؤامرات ثلاثية الأبعاد لإجهاد إيجابي. ترسم الأراضي المستويات الخام OD، مفلورة mCerulean، وفلورسي mCherry كدالة من الوقت والتركيز محفز. تم حساب مستويات التعبير الثابتة الحالة mCerulean لكل تركيز محفز لكل من السلالات الإيجابية والسلبية.
كما تم حساب معدل إنتاج mCherry لكل تركيز محفز لكل من السلالات الإيجابية والسلبية. تم رسم معدل إنتاج mCherry كدالة متوسط mCerulean fluorescence بلغ متوسط أكثر من اثنين من التكرارات البيولوجية لسلالات اثنين. يتم عرض KRBP المناسب باستخدام صيغة التركيب للجهد الإيجابي الذي يظهر استجابة ملزمة محددة.
بالنسبة للسلالات السلبية، لم يتم استخراج قيمة KRBP. تم تحديد منحنيات الاستجابة الجرعة تطبيع ل30 سلالات مختلفة على أساس اثنين من RBPs كما 10 مواقع ملزمة في مواقع مختلفة. يتم ملاحظة ثلاثة أنواع من الاستجابات، وتقارب عالية، وتقارب منخفض، و لا تقارب.
يظهر هنا هي كمية نتائج KRBP لاثنين من RBPs, بروتين معطف MS2 و PP7 مع 10 أشرطة موقع ملزم مختلف. تظهر هنا منحنيات استجابة الجرعة لبروتين معطف MS2 مع موقع ربط متحول في أربعة مواقع مختلفة لإثبات تأثير التباعد المتحول على إنتاج mCherry. يتم عرض تسلسل موقع الربط المُختبر المُتَحور.
من المهم استخدام تقنية هيكلية مثل الشكل تسعى إلى التحقيق كيميائيا في هيكل مجمع البروتينات والرنا تصور المناطق التي تتأثر مرنا من قبل RNA ملزمة. في الآونة الأخيرة، استخدمنا هذه التقنية بطريقة عالية الإنتاجية لقياس تقارب RBPs إلى مواقع الربط 10000 في نفس الوقت.
