RNAの複雑な性質とタンパク質との相互作用に影響を与える多くの要因により、生体内でのRNAに結合するタンパク質の特性評価は依然として大きな課題です。RNA結合タンパク質またはRBP-RNAアフィニティーは、生きた細菌細胞の内部で測定される。細胞環境はRNAとRBP-RNA結合の両方の構造に影響を与えるので、生体内の親和性を測定することは、自然界におけるそのような相互作用を理解するために重要です。
成功の秘訣はプラスミドのデザインにある。設計はデルタのいくつかの波を使用し、停止コドンおよびフレームシフト突然変異の挿入を避けるべきである。バインド サイト カセットを設計して、このプロトコルを開始します。
各ミニ遺伝子には、EagI制限部位、カナマイシン耐性遺伝子の5つの素端から40塩基、pLac/Araプロモーター、リボソーム結合部位、mCherry遺伝子のAUG、スペーサー、RBP結合部位、mCherry遺伝子の5つの素端から80塩基、およびApaLI制限部位が含まれている。アッセイの成功率を高めるために、少なくとも1つ、2つおよび3つの塩基からなるスペーサーを備えた結合部位ごとに3つの結合部位カセットを設計する。小遺伝子と標的ベクターの両方をEagI HFおよびApaLIで二重消化してから、消化器のカラム精製を行う。
消化したミニ遺伝子を、mCherryレポーター遺伝子の残りの部分、ターミネーターおよびカナマイシン耐性遺伝子を含む結合部位バックボーンにリゲートする。次に、ライゲーション溶液を、大腸菌トップ10細胞に変換する。サンガーシーケンシングを介して正の形質転換体を同定した後、精製プラスミドをマイナス20°Cで96ウェル形式で保存します。
また、マイナス80°Cで96ウェル形式でグリセロールストックとして細菌株を保存します。エンドに制限部位を有する二本鎖DNAミニ遺伝子としてストップコドンを欠いた必要なRBP配列をカスタムオーダーする。調製したプラスミドを、RBP mCeruleanプラスミドを既に含む化学的に有能な細菌細胞に変換します。
時間を節約するために、関連する抗生物質とルリア・ベルタニ寒天を含む8レーンプレートに8チャネルピペッタを使用して細胞をプレートします。コロニーは摂氏37度で16時間で表示する必要があります。各二重変性剤のための単一のコロニーを選択し、適切な抗生物質とLBの1.5ミリリットルを含む48ウェルプレートに移す。
250 RPMで摂氏37度で18時間の期間にわたって細胞を成長させます。96ウェルプレートでマイナス80°Cのグリセロール在庫として一晩保存します。午前中には、96ウェルプレートで180マイクロリットルの半細孔媒体またはSPMを暖かくするようにロボットをプログラムします。
インデューサープレートを準備するロボットをプログラムします。きれいな96の井戸の版で、95%BAおよび5%LBから成るSPMと井戸を準備する。ウェルの数は、誘導体濃度の所望の数に対応します。
最高のインデューサー濃度を含むインデューサプレートのウェルにC4-HSLを加えます。次に、最高濃度の井戸のそれぞれから、ゼロから218ナノモルまでの23の低濃度に培地を連続的に希釈するようにロボットをプログラムします。各誘導体希釈の体積は、すべての株に対して十分であるべきである。
一晩の株を希釈するには、48ウェルプレートに180マイクロリットルのSPMと20マイクロリットルの細菌を混合することによって、ロボットを10倍に希釈するようにプログラムします。次に、希釈溶液から20マイクロリットルを蛍光測定に適した事前調製された歪みプレートに取り込んで、10の倍率で再び希釈する。次に、最終的な濃度に応じて希釈された歪みで、インデューサプレートから96ウェルプレートに希釈されたインデューサーを追加するようにロボットをプログラムします。
摂氏37度で96のウェルプレートを6時間振ります。その間、595ナノメートルの光学密度またはODの測定を行い、30分ごとにプレートリーダーを介してmCherryとmCerulean蛍光を測定します。正規化のために、細胞を加えたものなしでSPMの成長を測定する。
ここに示されているのは、正の歪みの3次元プロットです。プロットは、時間および誘導体濃度の関数として生のODレベル、mCerulean蛍光、およびmCherry蛍光を描いている。mCerulean定常式レベルは、正および負の両方の株に対する各誘導体濃度について計算した。
mCherryの生産速度は、正と負の両方の株の各誘導体濃度についても計算した。mCherryの生産速度は、2株に対して2つの生物学的重複を平均した平均mCerulean蛍光の関数としてプロットした。フィッティング式を用いたフィットKRBPは、特定の結合応答を示す正のひずみについて示される。
負のひずみについては、KRBP値は抽出されなかった。正規化された用量応答曲線は、異なる場所で10の結合部位として2つのRMPに基づいて30の異なる株について決定した。3種類の応答が観察され、高い親和性、低親和性、および親和性がない。
ここに示されているのは、2つのRBP、MS2コートタンパク質およびPP7コートタンパク質と10の異なる結合部位カセットの定量的KRBP結果である。4つの異なる場所で変異結合部位を有するMS2コートタンパク質の用量応答曲線は、mCherry産生に対する変異間隔の影響を示すためにここに示されている。テストされた変異結合部位のシーケンスが表示されます。
タンパク質RNA複合体の構造を化学的にプローブし、RNA結合によって影響を受けるmRNA領域を可視化するために、形状シークなどの構造技術を使用することが重要です。最近、この手法を高スループット方式で使用して、RPSの結合部位を10,000個に同時に測定しました。
