이 방법은 단일 뉴런 격리 및 시퀀싱 분야의 주요 장애물을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 특정 인구 또는 사용자 정의 뇌 영역에서 형광으로 표지 된 뉴런의 하위 집단을 수집하는 것과 같은. 이 기술의 주요 장점은 관심의 단일 뉴런이 파편을 오염하지 않고 포획되도록 한다는 것입니다.
그것은 또한 상대적으로 부드러운, 기존의 FACS 정렬의 유체 압력을 실시 하는 경우 신속 하 게 죽는 깨지기 쉬운 신경 유형에 대 한 중요 한. 모세관 풀러를 사용하여 10 내지 15 미크로네 출구 직경을 가진 당겨진 유리 미세 모세 혈관을 준비하여 시작합니다. 미세 한 가위를 사용하여 모세관의 끝을 잘라 원하는 보드 직경을 가져옵니다.
그런 다음 튜브 커넥터를 사용하여 0.2 마이크론 PVDF 멤브레인 주사기 필터와 양방향 튜브 밸브에 0.8 밀리미터 내부 직경의 유연한 실리콘 튜브의 120 ~ 150센티미터 길이를 부착합니다. 차가운 인공 뇌 척수액 또는 ACSF의 500 밀리리터를 준비하고 15 분 동안 에어스톤을 통해 또는 용액이 완전히 지울 때까지 5 %의 이산화탄소 균형 산소를 버블링하여 산소를 공급하십시오. ACSF 100 밀리리터를 포함하는 150밀리리터 비커 3개를 준비합니다.
하나에, 활동 차단제의 칵테일을 추가합니다. 다른 하나에, 밀리 리터 당 1 밀리 그램의 최종 농도에 프로테아제대 연쇄상 구균 분획을 추가합니다. 최종 비커에 FBS를 1%의 최종 농도에 추가하고 에어스톤을 통해 이산화탄소 균형 산소를 5%로 산소화합니다.
마지막으로, 출구 직경이 줄어 있는 세 개의 긴 파스퇴르 파이펫을 화염 위로 굴려 서 십시오. 작은 가위로 두개골을 열고 피질을 손상시키지 않고 미세 포셉을 사용하여 신선한 뇌를 추출하여 안락사 마우스에서 뇌를 해부하십시오. 절제 기간 동안 5%의 이산화탄소 균형 산소에 부착된 에어스톤을 남기고, 차갑고 산소가 공급되는 ACSF에 뇌를 배치합니다.
뇌를 진동 척에 배치하고 관상 또는 처진 부분을 300 미칸 두께로 자른다. 최소 10~50개의 라벨이 부착된 셀을 얻기 위해 필요에 따라 많은 섹션을 수집합니다. 비커 안에 놓인 면 메쉬 슬라이스 홀더에 슬라이스를 넣어 산소가 공급되는 ACSF로 목욕합니다.
액티비티 블로커를 사용하여 ACSF가 포함된 비커로 슬라이스를 이동하고 에어스톤을 사용하여 산소를 부각시키면서 실온에서 15~20분 동안 차단합니다. 프로테제스 용액을 사용하여 ACSF가 포함된 비커로 슬라이스를 이동하여 실온에서 가벼운 소화를 수행합니다. 소화후 실온에서 액티비티 블로커 용액을 사용하여 ACSF를 함유한 비커로 슬라이스를 다시 이동하여 프로테아제를 씻어내라.
거품 산소를 유지합니다. 다음으로 실온에서 1%의 FBS가 포함된 ACSF가 포함된 100mm 페트리 접시를 준비하고 개별 섹션을 마이크로절을 위해 디스크로 이동합니다. 형광 해부 범위하에서, 마이크로 해부 영역 및 최소 10 ~ 50 세포를 갖는 관심층에 미세 집게 쌍을 사용합니다.
파스퇴르 파이펫을 사용하여 ACSF 솔루션에서 약 0.8 밀리리터를 포함하는 2밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 마이크로 해부 된 조각을 이동합니다. 실온에서 마이크로 퍼지 튜브에 해부 된 조직을 적시. 가장 크고 가장 작은 출구 직경으로 끝나는 각 화염 파스퇴기 파이펫으로 약 10 스트로크를 수행합니다.
해리된 세포를 산소ACSF를 함유한 100mm 페트리 접시에 분배하고 세포가 점진적으로 정착할 때까지 5~7분 정도 기다립니다. 해부 현미경하에서 GFP 및 RFP 신호를 관찰한다. 밝은 필드 조명 아래에서 형태를 검사하여 이물질을 식별합니다.
이물질이 거의 없는 세포의 영역이 확인되면 모세관을 사용하여 튜브에 부착하여 튜브 밸브의 끝을 혀로 차단하여 세포를 선택하십시오. 그런 다음 모세관을 세포에 가깝게 배치합니다. 모세관의 블록을 방출하고 모세관 작용을 사용하여 세포를 캡처하기 위해 다시 신속하게 차단합니다.
모세관을 신선한 산소 ACSF로 100mm 페트리 접시로 옮기고 형광 광학 에서 모세관 팁을 관찰하면서 튜브로 부드럽게 날려 세포를 접시에 분배합니다. 100~150개의 세포가 수집될 때까지 수집 절차를 반복하여 이물질과 같은 오염물질이 밝은 필드 차동 간섭 대조 광학에서 최소화되도록 합니다. 마지막으로, 매번 신선한 마이크로 모세관 파이펫을 사용하여 단일 셀을 선택하고 0.5 마이크로리터를 0.5 마이크로리터로 추방하여 프라이머를 함유한 샘플 수집 버퍼 1마이크로리터를 포함하는 0.2 마이크로리터 마이크로 퍼지 튜브로 추방합니다.
마이크로 퍼지 튜브의 파이펫 팁을 깨고 셀이 수집 버퍼에 머물수 있도록 합니다. 마른 얼음에 튜브를 넣어 세포를 동결. RNA 증폭을 위한 처리될 때까지 영하 80도 냉동고에 보관하십시오.
GABAergic 뉴런은 마우스 뇌의 cingulet 피질에서 분리되었다. 수동으로 정렬된 뉴런으로부터 증폭된 RNA는 500개의 베이스 쌍 보다 약간 높은 피크 분포를 가진 크기가 200에서 4, 000의 베이스 쌍 사이를 배회했다. 비드 정화 후, cDNA 라이브러리는 200개 미만의 베이스 쌍과 약 350개의 베이스 쌍에서 피크를 제거하기 위해 구슬을 이용한 2차 정화에 의해 더욱 제한된다.
시퀀싱은 셀당 4.8배 10배, 5위 중앙값6.9배 10회 10회, 셀당 5일 평균 매핑판독을 보였다. UMIs를 사용하여 RNA를 중복한 후, 각 단일 세포는 5번째 중앙값으로 1.0배 또는 1.4배 10배, 세포당 5번째 평균 고유 판독을 가졌다. 각 단세포 외부 RNA 대조컨소시엄에서, RNA의 스파이크는 시료에 첨가된 절대 분자수를 계산하기 위해 내부 대조군으로 사용되었다.
0.92의 경사와 0.94의 조정 된 R 사각형으로 관찰 된 카운트에 입력의 선형 관계가 있었다. 단일 뉴런 당 약 10, 000 유전자의 평균6, 000 개 이상의 유전자를 검출 하는 단일 세포의 95% 이상이 절차를 사용 하 여 검출 되었다. 개발 후, 이 기술은 분자 생물학자가 뚜렷한 잘 특징적인 마우스 피질 인터뉴런의 전사체를 탐구할 수 있는 길을 열어주었으며, 세포 정체성에 대한 코딩을 담당하는 엄선된 유전자 범주를 확인했습니다.
