단일 세포 mRNA 염기서열분석은 단일 세포 수준에서 생물학적 과정을 이해하는 데 널리 사용된다. 멀티플렉스 전략의 출현은 단일 실험에서 여러 샘플의 프로파일링을 허용하여 비용을 크게 절감하고 배치 효과를 피함으로써 증폭을 더욱 확장했습니다. 절차를 시연하는 것은 포스트닥인 웨이 펑과 제 실험실의 기술자인 앤드류 Przysinda입니다.
카운트 후, 배아 일 18.5 심장 챔버에서 분리 된 세포를 5 번 10으로 나누어 다섯 번째 알리쿼트로 나누어 세척 당 신선한 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 샘플당 180마이크로리터의 PBS로 펠릿을 재연하고 부드러운 믹싱을 통해 각 튜브에 앵커 바코드 스톡 솔루션 20마이크로리터를 추가합니다. 얼음에 5 분 인큐베이션 후, 얼음에 추가 5 분 인큐베이션을 위해 부드러운 혼합각 튜브에 공동 앵커 바코드 스톡 솔루션 20 마이크로 리터를 추가 한 다음 세척 당 1 %의 소음부 알부민으로 보충 된 차가운 PBS의 1 밀리리터로 세포를 세 번 세척한 다음 샘플을 40 마이크로 미터 세포 세포 스트레이너를 통해 새로운 튜브로 필터링합니다.
계산 후 칩 B를 칩 홀더에 조립한 다음 사용하지 않은 우물에 50% 글리세롤 용액의 75마이크로리터를 1열의 미사용 우물에 추가하고, 2열의 미사용 우물에 40마이크로리터, 3열의 미사용 우물에 280 마이크로리터를 넣습니다. 교육 칩은 절차를 시연하는 데 사용됩니다. 부드러운 파이펫팅과 마스터 믹스에 세포 현탁액과 뉴클레아제없는 물의 적절한 볼륨을 추가합니다.
생성된 셀 용액의 75마이크로리터를 거품 없이 한 줄로 잘 샘플의 하단 중앙에 추가합니다. 젤 비드를 30초 동안 소용돌이치고, 거품이 없는 2열에서 젤 비드의 하단 중앙에 40 마이크로리터의 비드를 천천히 첨가합니다. 3열에 분할 오일의 측면 벽아래로 280 마이크로리터를 추가합니다.
개스킷을 누르지 않고 칩에 개스킷을 부착하고 개스킷을 적시지 않도록 개스킷을 수평으로 유지합니다. 크롬 컨트롤러에 개스킷으로 조립 된 칩을로드하고 크롬 단일 셀 B 프로그램을 실행합니다. 화면은 트레이닝 칩에 대한 크롬 훈련을 보여주지만 실제 실험을 위해 화면은 크롬 단일 셀 B.프로그램이 완료되면 즉시 칩을 제거하고 개스킷을 폐기합니다.
뚜껑을 다시 접어 45도 각도로 우물을 노출하고 액체 레벨을 확인하여 나막신이 없는지 확인합니다. 천천히 회복의 가장 낮은 지점에서 에멀젼에 젤 구슬 의 100 마이크로 리터를 흡착하고 구슬의 균일성을 확인합니다. 유화 된 구슬을 얼음에 새 PCR 튜브의 벽 아래로 분배하고 역 전사를위해 열 사이클러에 튜브를 배치합니다.
증폭을 위해 cDNA를 준비하려면 실온시 시료에 125마이크로리터의 회수제를 추가하십시오. 불투명한 액체를 관찰해서는 안되며 파이펫팅이나 소용돌이를 피해서는 안됩니다. 튜브 바닥에서 회복제를 천천히 제거하기 전에 60초 동안 기다렸다가 200마이크로리터의 소용돌이 비드 정리 혼합물을 샘플에 추가합니다.
피펫 혼합물을 10번 배양한 후 실온에서 10분 동안 배양합니다. 다음으로 샘플을 높은 위치에 자석에 놓습니다. 용액이 지워지면 상체를 제거하고 펠릿에 80%에탄올200 마이크로리터를 추가합니다.
30초 후에 에탄올을 제거하고 두 번 더 세척을 반복합니다. 마지막 세척 후, 샘플을 간단히 원심분리하고 낮은 위치에 자석에 튜브를 배치하여 샘플이 2 분 이내에 공기 건조 할 수 있도록합니다. 시료가 건조되면 자석에서 튜브를 제거하고 갓 준비된 용출 용액35.5 마이크로리터를 추가합니다.
실온에서 2분 간 인큐베이션한 후, 샘플의 35마이크로리터를 새로운 튜브 스트립으로 옮기기 전에 용액이 지워질 때까지 자석에 샘플을 배치합니다. 지질 기반 바코딩 전략을 사용하여 cDNA 증폭을 위해 35 마이크로리터 cDNA 샘플에 증폭 반응 혼합물을 추가하여 간략하게 원심분리하기 전에 철저한 혼합을 합니다. 스핀의 끝에서, 적절한 cDNA 증폭 절차에 따라 열 사이클러에서 샘플을 배양한다.
선택 시약 120 마이크로리터와 100 마이크로리터의 초순수물을 100마이크로리터의 시료와 파이펫 100마이크로리터에 추가하여 0.6배 선택 시약을 15회 선택합니다. 실온에서 5분 간 인큐베이션한 후 용액이 명확해질 때까지 샘플을 자석위에 놓습니다. 수퍼너티를 1.5밀리리터 로우 바인드 튜브로 이송하여 바코드 된 cDNA 라이브러리 구조를 다중화합니다.
슈퍼나티의 내용이 바코드 된 cDNA와 기본 내용 내생 cDNA를 조립할 때 슈퍼 네이티퍼와 베이스를 모두 저장하는 것을 기억하십시오. 내인성 cDNA를 80%에탄올로 청소하고 40마이크로리터의 용출 완충제로 DNA를 엘로드한 다음 내인성 성적증명서 라이브러리를 준비하기 전에 내인성 cDNA의 품질 관리 검사를 실행합니다. cDNA 농도는 라이브러리 시공 전에 정량화되고 자격을 갖추어야 합니다.
내인성 cDNA 및 바코드 라이브러리를 포함한 건설 된 라이브러리도 시퀀싱 전에 정량화되고 자격을 갖추어야합니다. 시퀀싱 후 바코드 식은 각 단일 셀에서 분석할 수 있습니다. 예를 들어, 이 분석에서 8개의 상이한 샘플에서 세포를 나타내는 한 가지 유형의 바코드를 고유하게 표현한 단일 세포의 8개 그룹이 관찰되었다.
또한 일부 세포는 바코드를 표현하지 않았기 때문에 부정적인 세포로 정의되었으며 다른 세포는 이중을 나타내는 두 개의 서로 다른 바코드를 표현했습니다. 단일 세포를 사용하여 세포 이질성 및 분자 규정은 세포 유형 주석, 신규 및 희귀 세포 유형 식별, 해부학 영역 비교 분석 및 세포 주기 상 분리와 같은 유전자 상측 경로 분석에 의해 평가될 수 있다. 당신이 할 수있는 경우 에멀젼젤 구슬을 이미지하는 것이 도움이됩니다, 이미지는 절차가이 시점까지 성공했는지 여부를 알려줍니다.
샘플 멀티플렉스는 실험을 설계하는 데 큰 유연성을 제공합니다. 이 시연을 본 후, 나는 당신이 당신의 자신의 실험을 시작하는 것에 대해 더 자신감을 가질 수 있기를 바랍니다.
