荧光标记小鼠神经元的单细胞 RNA 序列的人工分选和双体外转录与绝对计数测序 (天后-Seq)

该方法有助于解决单神经元分离和测序领域的主要障碍。例如从用户定义的脑区域收集特定人群或荧光标记神经元的亚组。该技术的主要优点是，它确保捕获感兴趣的单个神经元而不污染碎片。

它也相对温和，这对于脆弱的神经元类型来说很重要，当受到传统 FACS 分拣的流体压力时，这些神经元类型会迅速死亡。首先使用毛细管拉拔器制备直径为 10 至 15 微米的拉玻璃微胶囊。使用细剪刀切割毛细管的尖端，以获得所需的板直径。

然后使用管连接器将一个 120 至 150 厘米长的柔性硅胶管连接到 0.2 微米 PVDF 膜注射器过滤器和双向管阀，内径为 0.8 毫米。通过气石冒泡 5%二氧化碳平衡氧 15 分钟或直到溶液完全清除，准备 500 毫升的冷冻人工脑脊髓液或 ACSF 和氧合。准备三个 150 毫升的烧杯，每个装有 100 毫升的 ACSF。

一是加入一种活动阻滞剂的鸡尾酒。另一方面，将蛋白酶的链球菌分数添加到每毫升一毫克的最终浓度中。到最终烧杯，将FBS加入到1%的最终浓度中，通过气石加入5%的二氧化碳平衡氧氧。

最后，制作三个长茎巴斯特移液器，通过滚动在明火上，减少出口直径。用小剪刀打开颅骨，用细钳拔出新鲜大脑，而不损害皮层，从安乐死小鼠身上解剖大脑。将大脑放在冰冷和含氧的ACSF中，在整个分节期间，留下一个气石附着在5%的二氧化碳平衡氧上。

将大脑放在振动夹头上，在300微米厚度下切割日冕或下垂部分。根据需要收集尽可能多的部分，以获得至少 10 到 50 个标记单元格。将切片放在放在烧杯内的棉网切片架上，以便它们沐浴在含氧 ACSF 中。

将切片用活性阻滞剂将切片移入含有 ACSF 的烧杯中，并在室温下块块 15 至 20 分钟，同时使用 Airstone 冒泡氧气。使用蛋白酶溶液将切片移动到含有 ACSF 的烧杯中，在室温下进行轻度消化。消化后，将切片用活性阻滞剂溶液将切片移动回含有ACSF的烧杯中洗净蛋白酶，在室温下5至10分钟。

继续冒泡氧气。接下来，在室温下准备一个含有ACSF的100毫米培养皿，并在室温下将各个部分移动到磁盘中进行微截。在荧光解剖范围内，使用一对细钳子对具有至少10至50个细胞的微解剖区域和感兴趣层。

使用巴斯德移液器，将微解剖件移动到包含约 0.8 毫升 1%FBS 的 2 毫升微离心管中 ACSF 溶液中。在室温下对微烟管中的解剖组织进行滴定。每个火焰巴斯德移液器以最大开始，以最小的出口直径结束，执行大约 10 次冲程。

将分离的细胞分配成含有含氧ACSF的100毫米培养皿，等待5至7分钟，让细胞逐渐沉淀。在解剖显微镜下观察 GFP 和 RFP 信号。通过检查亮场照明下的形态来识别碎片。

一旦发现有小碎片的细胞区域，使用毛细管并附着在管子上，用舌头阻塞管阀的端接细胞。然后将毛细管靠近细胞。松开毛细管上的块，然后快速再次阻塞，使用毛细管作用捕获细胞。

将毛细管移动到 100 毫米培养皿中，配以新鲜含氧 ACSF，轻轻吹入管中，同时观察荧光下毛细管尖端，将细胞放入培养皿中。重复收集过程，直到收集 100 到 150 个电池，确保在亮场差分干涉对比度光学中污染物（如碎屑）最小。最后，每次使用新鲜的微毛细管移液器，选择一个细胞，并在不超过0.5微升中将它排出0.2微升微烟管，其中包含一个微升的样品收集缓冲液和底像。

断开微烟管中的移液器尖端，以确保细胞留在收集缓冲器中。将管子放在干冰上，冷冻细胞。存放在零下80摄氏度的冰柜中，直到处理RNA扩增。

GABAergic神经元从小鼠大脑的银骨皮层分离。从人工排序的神经元中放大的RNA大小在200到4000个碱基对之间，峰值分布略高于500个碱基对。珠子纯化后，cDNA库被第二轮纯化所限制，使用珠子消除小于200个碱基对的碎片，并在大约350个基对的峰值。

排序显示每个单元格的平均映射读取数为 4.8 倍 10 至第 5 中位数，或 6.9 倍 10 到 5 的平均映射读取。使用 UMI 重复去除 RNA 后，每个单个细胞的 1.0 倍 10 到第 5 中位数，或 1.4 倍 10 到 5 的平均唯一读取每个细胞。在每个单细胞外部RNA控制联合体中，RNA的峰值被用作内部控制，以计算添加到样品中的分子的绝对数量。

有输入与观测计数的线性关系，斜率为 0.92，调整后的 R 平方为 0.94。使用这个程序，每个单个神经元平均检测出大约1万个基因，超过95%的单细胞检测出6000多个基因。该技术开发后，为分子生物学家探索不同特征的小鼠皮质内维龙的转录组铺平了道路，并确定了负责编码细胞特性的精选基因类别。