Name: single-cell rna-seq of defined subsets of retinal ganglion cells
Uploaded: 2017-05-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
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우리는 샘플을 준비하고 취급하는 데 도움을 준 Jennifer Bair와 Einat Snir, Iowa Institute for Human Genetics를 인정하고 싶습니다.

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	<li>Austin, C., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Cell+Fate+in+the+Vertebrate+Retina.">Specification of Cell Fate in the Vertebrate Retina.</a> Neural Cell Specif. 3, 139-143 (1995).</li><li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neuronal+Organization+of+the+Retina.">The Neuronal Organization of the Retina.</a> Neuron. 76 (2), 266-280 (2012).</li><li>Rodieck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The First Steps in Seeing. , (1998).</li><li>Chiu, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+at+whole+population+and+single+cell+levels+reveals+somatosensory+neuron+molecular+diversity.">Transcriptional profiling at whole population and single cell levels reveals somatosensory neuron molecular diversity.</a> Elife. 3, e04660 (2014).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nat. Neurosci. 19 (2), 335-346 (2016).</li><li>Trapnell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+cell+types+and+states+with+single-cell+genomics.">Defining cell types and states with single-cell genomics.</a> Genome Res. 25 (10), 1491-1498 (2015).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Schmidt, T. M., Do, M. T. H., Dacey, D., Lucas, R., Hattar, S., Matynia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanopsin-Positive+Intrinsically+Photosensitive+Retinal+Ganglion+Cells:+From+Form+to+Function.">Melanopsin-Positive Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells: From Form to Function.</a> J. Neurosci. 31 (45), 16094-16101 (2011).</li><li>Eberwine, J., Miyashiro, K., Kacharmina, J. E., Job, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+classes+of+mRNAs+that+are+targeted+to+neuronal+dendrites.">Local translation of classes of mRNAs that are targeted to neuronal dendrites.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 98 (13), 7080-7085 (2001).</li><li>Darmanis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+human+brain+transcriptome+diversity+at+the+single+cell+level.">A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (23), 7285-7290 (2015).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nat. Neurosci. 18 (1), 145-153 (2015).</li><li>Poulin, J. F., Zou, J., Drouin-Ouellet, J., Kim, K. Y. A., Cicchetti, F., Awatramani, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+midbrain+dopaminergic+neuron+diversity+by+single-cell+gene+expression+profiling.">Defining midbrain dopaminergic neuron diversity by single-cell gene expression profiling.</a> Cell. Rep. 9 (3), 930-943 (2014).</li><li>Gross, A., Schoendube, J., Zimmermann, S., Steeb, M., Zengerle, R., Koltay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+Single-Cell+Isolation.">Technologies for Single-Cell Isolation.</a> Int. J. Mol. Sci. 16, 16897-16919 (2015).</li><li>Lovatt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+in+vivo+analysis+(TIVA)+of+spatially+defined+single+cells+in+live+tissue.">Transcriptome in vivo analysis (TIVA) of spatially defined single cells in live tissue.</a> Nat Methods. 11 (2), 190-196 (2014).</li><li>Qiu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+RNA-Seq:+Technical+feasibility+and+reproducibility.">Single-neuron RNA-Seq: Technical feasibility and reproducibility.</a> Front. Genet. 3 (124), 1-8 (2012).</li><li>Subkhankulova, T., Yano, K., Robinson, H. P. C., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grouping+and+classifying+electrophysiologically-defined+classes+of+neocortical+neurons+by+single+cell,+whole-genome+expression+profiling.">Grouping and classifying electrophysiologically-defined classes of neocortical neurons by single cell, whole-genome expression profiling.</a> Front. Mol. Neurosci. 3 (10), 1-11 (2010).</li><li>Fuzik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+electrophysiological+recordings+with+single-cell+RNA-seq+data+identifies+neuronal+subtypes.">Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes.</a> Nat. Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isolated+retinal+preparation+to+record+light+response+from+genetically+labeled+retinal+ganglion+cells.">An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells.</a> J. Vis. Exp. (47), e2367 (2011).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+differences+among+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells.">Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 29 (2), 476-482 (2009).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+Bistratified+Intrinsically+Photosensitive+Retinal+Ganglion+Cells+in+the+Mouse.">Structure and Function of Bistratified Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells in the Mouse.</a> J Comp Neurol. 519 (8), 1492-1504 (2011).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cone+pathway+influence+on+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cell+subtypes.">Differential cone pathway influence on intrinsically photosensitive retinal ganglion cell subtypes.</a> J Neurosci. 30 (48), 16262-16271 (2010).</li><li>Clontech Laboratories I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SMARTerTM Ultra Low RNA Kit for Illumina&#174; Sequencing. , (2013).</li><li>Trombetta, J. J., Gennert, D., Lu, D., Satija, R., Shalek, A. K., Regev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+RNA-Seq+libraries+for+next+generation+sequencing.">Preparation of single-cell RNA-Seq libraries for next generation sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 4 (22), 1-17 (2014).</li><li>Ecker, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanopsin-expressing+retinal+ganglion-cell+photoreceptors:+Cellular+diversity+and+role+in+pattern+vision.">Melanopsin-expressing retinal ganglion-cell photoreceptors: Cellular diversity and role in pattern vision.</a> Neuron. 67 (1), 49-60 (2010).</li><li>Schmidt, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Role+for+Melanopsin+in+Alpha+Retinal+Ganglion+Cells+and+Contrast+Detection.">A Role for Melanopsin in Alpha Retinal Ganglion Cells and Contrast Detection.</a> Neuron. 82 (4), 781-788 (2014).</li><li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Types+of+Retinal+Ganglion+Cells:+Current+Status+and+Implications+for+Neuronal+Classification.">The Types of Retinal Ganglion Cells: Current Status and Implications for Neuronal Classification.</a> Annu. Rev. Neurosci. 38, 221-246 (2014).</li><li>Goetz, J. J., Trimarchi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+Profiling+of+Developing+and+Mature+Retinal+Neurons.">Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons.</a> J. Vis. Exp. , e3824 (2012).</li><li>Trimarchi, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Heterogeneity+of+Developing+Retinal+Ganglion+and+Amacrine+Cells+Revealed+through+Single+Cell+Gene+Expression+Profiling.">Molecular Heterogeneity of Developing Retinal Ganglion and Amacrine Cells Revealed through Single Cell Gene Expression Profiling.</a> J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).</li></ol>

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우리의 프로토콜은 신속하고 사용하기 쉬운 가이드를 통해 표본에 거의 손상을주지 않으면 서 높은 수준의 서열 분석을 위해 확인 된 형태 학적 분류의 단일 세포를 준비하는 방법을 보여줍니다. 본 원고에서 본질적으로 감광성 망막 신경절 세포는 형태 학적으로 특성화되고 분리되고 RNA-Seq에 대해 준비된다. 망막 처리 도중 세포 응력이 발생할 수 있습니다. 이러한 이유로 우리는 4 시간 이상 사용하지 않으면 각 조직을 대체합니다. 우리는 전기 생리학 장비를 사용하여 이들 세포에서 기록하고 그들의 반응을 모니터함으로써 세포의 상태를 평가할 수 있으며, 이는 세포가 건강하다는 것을 보장합니다. 우리의 프로토콜은 65 %의 성공률을 제공하는 23 개 샘플 중 15 개에서 성공적인 cDNA 라이브러리를 생성 할 수있었습니다. 또한 우리의 세포가 발현하는 유전자의 평균 수는 2,316 ~ 10,353 건으로 평균 5,683 건으로 서열 데이타의 질이 뛰어났습니다FPKM 값이 0이 아닌 유전자. 이 수치는 뉴런의 다른 연구에서 발견 된 유전자 수치와 유사하며, 우리의 데이터 또한 좋은 품질임을 보여줍니다. 우리가 이러한 특정 뉴런에 대해이 프로토콜을 성공적으로 수행 한 동안이 기술에 대한 사소한 수정안을 여러 가지 다른 응용 프로그램에 적용 할 수 있다는 점에 유의해야합니다. 별도의 마우스 모델 내에서 Fluorescence-activated Cell Sorter (FACS)를 사용하여 우리는 중추 신경계로부터 GFP 마커로 분류 된 작은 세포 집단 (1,000-25,000)을 분리했습니다. 이 집단의 RNA를 분리하고이 RNA의 1 μL (12 ng / μL 이하)를 사용하여 단계 6.1에서 역전사를 시작했습니다. 이 단계 후에 프로토콜에 대해 수행해야하는 유일한 조정은 7.4 단계에서 발생하며,이 시점에서 더 적은 PCR주기를 채택 할 수 있습니다. 초기 샘플에 g가 포함 된 경우 19 사이클을 사용했습니다.10,000 세포보다 더 많은 양을 가지고 있으며, 이것은 좋은 품질의 cDNA 라이브러리를 생산한다는 것을 발견했다. 예를 들어, 세포 샘플은 FACSorted 모집단으로부터 준비되었고, 표현 된 유전자의 수는 12,340-14,052이고, FPKM 값이 0이 아닌 평균 13,265 개의 유전자가있다. 이 기술은 형광 기자가있는 다양한 마우스 모델에 적용 할 수 있습니다. 이 개정안으로 인해 연구진은 형광 리포터 마우스를 사용할 수있는 세포 집단을 연구하여 신경 다양성 분야에서 연구를 확장 할 수있었습니다. 두 번째 조정은 형태학이 아니라 기능성을 기반으로 세포를 프로파일 링 할 수 있습니다. 이 프로젝트는 형질 전환 모델을 사용하지만이 기술은 알려진 분자 식별자가없는 뉴런에 적용될 수 있습니다. 예를 들어, 현재 27 개의 망막 신경절 세포의 기능적 아형이 30 개 이상 있으며, 그 중 극히 일부만 고유 한 마커를 가지고 있습니다. 이 기법이미 세포 충진을위한 전기 생리 기기를 사용하고 있으며, 패치 클램핑을 사용하여 스파이크 패턴에 기초하여 각 세포의 기능적 반응 프로파일을 확인할 수있다. 광 유발 스파이크 기록을 사용하여 망막 뉴런의 분류를 세포 분리 전에 결정할 수 있었다. 이 기술은 망막 신경절 세포에서 작동하지만 다른 망막 신경 세포를 검사하기 위해 확장 될 수 있습니다. 그러나이 프로토콜을 사용하여 망막 양극성 또는 무 건성 세포를 내핵 세포층에 입력하는 경우, 예를 들어 세포의 접촉을 피하기 위해 전극의 끝 부분에 일정한 양의 압력을가하도록주의해야합니다 전극은 신경절 세포층과 내부 plexiform 층을 통과한다. 내핵 층 내의 망막 뉴런의 경우, 세포 녹음 전에 망막 부분을 준비하는 것이 오염을 일관되게 피하는 데 가장 효과적 일 수 있습니다. 각 세포는 다음과 같이 cla 다음에 기술 된대로 분리되고 준비됩니다.분류 단계. 또한, 우리는 뉴런 연구에이 프로토콜의 사용을 제안하지만,이 기술은 형질 전환 모델의 사용을 통해 형태 학적으로 특성화되거나 분리 될 수있는 모든 세포 유형에 적용될 수 있습니다. 이 기술은 또한 이전에 준비된 cDNA 라이브러리로 작동하도록 수정할 수 있습니다. 우리는 과거에 마이크로 어레이 하이브 리다이 제이션을 위해 생성했습니다. 개별적으로 준비된 라이브러리로, 50-150ng 범위의 cDNA 양으로 시작하여 단계 8.4에서 프로토콜을 시작합니다. 더 높거나 낮은 농도는 시도가되지 않았지만 효과가있을 수 있습니다. DNA 비드를 사용하여 cDNA를 정제 한 다음 태깅 (tagmentation)과 PCR 증폭을 수행합니다. 우리는이 조정을 마이크로 어레이 하이브 리다이 제이션 ( microarray hybridization) 29 와 같은 라이브러리 준비물의 cDNA로 테스트했으며 RNA-Seq에 대한 태그 라이브러리를 성공적으로 생산했습니다. 지느러미이 프로토콜은 유도 된 Pluripotent Stem Cell (iPSCs)의 세포 집단 유도의 성공 여부를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 재 프로그램 된 다 능성 세포의 분화 뒤에있는 원동력은 세포 유형을 유도하여 서로 독립적으로 발달하는 전사 인자에 대한 이해에 달려있다. iPSC를 특정 세포 운행으로 유도하는 것은 선택적으로 세포 유형을 생성하는 데 사용할 수 있기 때문에 신경원 다양성을 연구하기위한 새로운 방법입니다. 이 프로토콜은이 모델로부터 분화 된 세포들 사이의 다양성의 질을 평가하기 위해 적용될 수 있습니다. 앞서 언급했듯이, 망막 신경절 세포의 30 개 이상의 기능적 하위 유형이 있으며 iPSC에서 기능적 RGC를 생성하기위한 많은 노력이있어 왔습니다. 우리의 경우에는 ipRGCs 인 RGC의 아형 (subtypes)에 대한 마커의 확인은 연구원이 RGC의 다양한 아형을 생산할 때 프로토콜의 성공 여부를 평가할 수있게합니다. 세포 유형의 평가이 뉴런들 사이에서이 프로토콜로부터 이익을 얻고,이 모델 시스템이 즉시 이용 가능 해짐에 따라 아 유형 특이적인 마커에 대한 지속적인 연구를위한 도구로 사용될 수 있습니다. 본 원고에서는 transcriptomic analysis를위한 단일 세포의 분리와 준비를위한 간단한 기술을 설명한다. 또한 프로토콜을 편집하여이 기술을 다양한 범위의 목표를 염두에두고 여러 실험에 사용할 수있는 방법을 제안합니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 Trombetta et al. 24 를 사용하여 저 입력 RNA-Seq에 대한 권장 키트 지침을 조정합니다. 주요 차이점은이 프로젝트의 요구에 가장 잘 부합하도록 선택한 세포 분리 및 다양한 용적 변화입니다. 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 망막 조직에서 세포를 분리하는 것임을 강조하는 것이 중요합니다. 이것이 프로토콜 durin의 요점입니다.g 대부분의 오류가 발생할 수 있으며 가장주의 깊은주의를 기울여 수행해야합니다. 세포질의 손실은 mRNA 분자의 심각한 고갈을 초래할 수있는 반면 오염의 양은 사용 불능 샘플을 초래할 수 있습니다. 이 단계는 시료를 정확하게 취급했는지 ​​확인하기 위해 실험에서 실험까지 동일한 개인에 의해 조심스럽게 수행되어야합니다. 요약하면,이 프로토콜은 고품질 RNA-Seq을위한 세포의 분류, 분리 및 준비 기술을 설명합니다. 이것은 단일 셀에서 데이터의 품질을 최적화하는 비교적 효율적이며 비교적 저렴한 방법입니다. 이 기술은 다목적이며 다양한 연구에 적용하기 위해 최소한으로 수정할 수 있습니다.

뉴런의 다양성은 중추 신경계, 특히 척수 망막에서 관찰되며 망막 전구 세포 1 , 2 , 3 의 한 집단에서 유래 한 1 개의 신경교 세포와 6 개의 신경 세포 유형으로 구성된 고도로 전문화 된 조직이다. 세포의 많은 아형들은 기능적으로, 형태 학적으로, 그리고 유 전적으로 분류 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표는 세포 유형의 유전 적 다양성을 식별 가능한 기능적 및 / 또는 형태 학적 특성에 연결하는 것입니다. 세포의 분류를 위해 많은 유전자가 확인되었지만 많은 하위 유형은 전체 인구의 작은 부분을 대표하므로 특성화되지 않고 계속됩니다. 이러한 특정 아형 내에서의 유전자의 동정은 망막 내에서의 연결의 다양성에 대한 더 큰 이해를 가능하게 할 것이고, 다른 곳에서 신경 세포의 다양 화를 밝힐 수도있다. 부더구나, 단세포 연구는 새로운 세포 유형의 발견을 허용하며, 이는 전체 인구 중 낮은 수치로 인해 간과되었을지도 모르는 4 , 5 , 6 , 7 . 단일 세포 transcriptomics의 이점 중 하나는 특정 세포 아형을 정의하는 고유 마커 또는 마커의 조합을 발견 할 수 있다는 것입니다. 이것들은 다른 조작을 위해 그 세포 유형에 대한 유전자 접근을 얻기 위해 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 photopigment melanopsin을 표현하는 망막 신경절 세포의 하위 집합의 세포 유형 특정 유전자를 특성화하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 망막 신경절 세포를 나타내는 멜라닌 신 (melanopsin)을 발현하는 세포에서 형광 마커를 사용하면 알려진 유전자의 발현으로 인해 이들 세포가 함께 모이기 때문에 이들 세포를 연구 할 수 있습니다. 흥미롭게도,이 세포 popu의 다섯 가지 알려진 아형이 있습니다마우스 망막 8에서 . 따라서, 각 유형의 세포에서 RNA를 분리하기 위해, 우리는 세포 분리 전에 각 아형을 확인하기 위해 형질 전환 모델 내에서 확립 된 형태 학적 분류를 사용했다. 이 기술은 조직 해리가 필요없는 세포의 특성화와 망막에서의 직접적인 분리를 가능하게합니다. 조직 해리없이 세포 내에서 스트레스 반응을 일으키고 절단 된 수상 돌기로 인한 오염을 유발할 수 있습니다. RNA-Seq 방법이 계속 발전함에 따라 지난 몇 년 동안 수많은 새로운 기술이 밝혀졌습니다. 이 도구를 사용하면 4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13 번 문제에 접근하면서 최대의 셀 획득 및 비용 효율성을 극대화 할 수 있습니다. 그러나,이 기술은 우수한 디딤돌이었으며, 여전히이 프로토콜이 해결할 수있는 많은 장애물이 있습니다. 첫째, 현재의 많은 절차는 해리 된 조직으로부터 세포를 분리하고, 세포 분류를 결정하기 위해 주성분 분석 또는 사후 (post-hoc) 계층 적 클러스터링을 사용하려고 시도한다. 이러한 유형의 도구를 사용하여 하위 유형을 분류하면 신뢰할만한 결과를 얻을 수 없으며 기능성 세포 유형에 대한 유전 적 표지의 상관 관계에 대해이 데이터의 유효성을 검사하는 새로운 방법을 강요 할 수 있습니다. 다른 프로토콜에서 해리에 대한 요구 사항은 때때로 조직 손상을 초래할 수 있으며, 신경 프로세스가 절단되어 mRNA의 잠재적 손실을 초래할 수 있습니다. 또한, 해리 세포 준비에서 스트레스 반응은 이러한 세포의 transcriptomes 14 영향을 시작할 수 있습니다. 이 프로토콜은 격리 이전에 기능 세포 유형을 결정함으로써 이러한 문제를 극복하고, h망막 조직을 손상시키지 않으면 서 세포의 증식. 한 기술은 2014 년에 도입 되었고 생체 내 전 사체의 생체 내 분석으로 구성되었습니다 15 . 이 기술은 조직에 대한 기계적 파괴를 최소화하면서 전 사체의 검사를 허용하지만 매우 특이적인 기자 마우스를 사용하지 않고 전 사체를 검사하기 전에 조직 내 특정 세포 유형을 분류하는 능력이 부족합니다. 우리의 프로토콜은 특정 리포터를 필요로하지 않습니다. 왜냐하면 우리는 세포 충전 및 전기 생리학을 이용하여 격리 전에 세포를 특성화하기 때문입니다. 이 이전 프로토콜의 또 다른 한계는 특정 파장이 광활성 요소를 여기시키는 데 필요하다는 것인데, 우리 프로토콜은 형광 리포터와 형광 염료의 사용을 허용하고 있습니다.이 리포터와 형광 염료는 쉽게 사용할 수 있거나 각 실험실별로 개별적으로 선택할 수 있습니다. 아직도, 다른 실험실은 electr의 2 가지의 방법을 결혼했다세포 다양성 연구를위한 생리학 및 전이 학. 분리 이전에 세포의 기능을 특성화하기위한 패치 - 클램프 기록의 사용은 해리 된 뉴런 16에서 수행 되었고, 어떤 경우에는 이러한 연구를 위해 마이크로 어레이 분석 17 을 사용하기도했다. 이러한 접근법에서 동일한 합병증이 발생합니다. 조직 분해 또는 이용 가능한 프로브에 대한 시료의 하이브리드 화에 의존하는 마이크로 어레이 기술의 사용이 필요하기 때문입니다. 가장 최근의 진보 중 하나는 전체 뇌 조각에서 세포를 이해하기 위해 패치 클램프 녹음과 RNA-Seq 기술을 결합한 기술인 Patch-Seq의 개발이었습니다. 이 기술은 여기에 제시된 프로토콜과 유사하지만, 우리의 접근 방식은 조직이 세포의 건강을 유지하기 위해 그대로 유지된다는 것을 다시 한번 주목하는 것이 중요합니다. 여기서는 최적화를위한 프로토콜을 제시합니다.이는 RNA-Seq을 사용하여 높은 판독 깊이와 매핑 범위를 얻기 위해 고품질의 단일 세포 라이브러리를 생성합니다.

<table><tbody><tr><td>Ames&#039; Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1420-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconate</td><td>Spectrum Chemical</td><td>PO178</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Hydrazide</td><td>Invitrogen</td><td>A10442</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Worthington Biochemical&amp;nbsp;</td><td>LS005273</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Worthington Biochemical&amp;nbsp;</td><td>LS002592</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (35 mm diameter)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmologic scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>#5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Shaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-687-708</td><td></td></tr><tr><td>Glass Micropipette</td><td>Sutter</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter</td><td></td><td>P-1000 horizontal pipette puller</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-2F</td><td></td></tr><tr><td>Flexible tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-171</td><td></td></tr><tr><td>TCL lysis buffer</td><td>Qiagen</td><td>1031576</td><td>Lysis Buffer 1</td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free Water</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL PCR tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30124359</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol, Pure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>Ethanol</td></tr><tr><td>Analog Vortex Mixer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02215365</td><td>Vortex</td></tr><tr><td>Mini Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>RNA magnetic beads</td></tr><tr><td>MagnaBlot II Magnetic Separator</td><td>Promega</td><td>V8351</td><td>Magnetic stand</td></tr><tr><td>1.5 mL MCT Graduated Tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit</td><td>Clontech</td><td>634888</td><td>Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification</td></tr><tr><td>10x Lysis Buffer</td><td></td><td></td><td>Lysis Buffer 2</td></tr><tr><td>5x Ultra Low First-strand Buffer</td><td></td><td></td><td>Buffer 1</td></tr><tr><td>3&#039; SMART-Seq CDS Primer II A</td><td></td><td></td><td>Primer II</td></tr><tr><td>SMART-Seq v4 Oligonucleotide</td><td></td><td></td><td>Oligonucleotide</td></tr><tr><td>SMARTScribe Rverse Transcriptase</td><td></td><td></td><td>Reverse Transcriptase (RT)</td></tr><tr><td>2x SeqAmp PCR Buffer</td><td></td><td></td><td>PCR Buffer</td></tr><tr><td>PCR Primer II A</td><td></td><td></td><td>PCR Primer</td></tr><tr><td>SeqAmp DNA Polymerase</td><td></td><td></td><td>DNA Polymerase</td></tr><tr><td>Mastercycler pro S</td><td>Eppendorf</td><td>950030020</td><td>Thermocycler</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>DNA magnetic beads</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>HS Bioanalyzer Chips &amp;amp; Reagents</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Qubit HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32851</td><td>For the calculation of sample concentrations</td></tr><tr><td>Qubit Assay Tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Sample Preparation Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>Reagents for Tagmentation and Index Coupling</td></tr><tr><td>TD Buffer</td><td></td><td></td><td>Buffer 2</td></tr><tr><td>ATM</td><td></td><td></td><td>Tagmentation Mix</td></tr><tr><td>NT Buffer</td><td></td><td></td><td>Tagmentation Neutralizing Buffer</td></tr><tr><td>NPM</td><td></td><td></td><td>PCR Master Mix</td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td>Indices for Tagmentation</td></tr><tr><td>N501</td><td></td><td></td><td>White 1</td></tr><tr><td>N502</td><td></td><td></td><td>White 2</td></tr><tr><td>N701</td><td></td><td></td><td>Orange 1</td></tr><tr><td>N702</td><td></td><td></td><td>Orange 2</td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td>For completing sequencing of samples</td></tr></tbody></table>

single-cell rna-seq of defined subsets of retinal ganglion cells

세포 유형별 마커의 발견은 세포 기능과 세포 이질의 기원에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 최근 뉴런의 다양성에 대한 이해를 높이기 위해 발현이 세포의 여러 하위 집단을 정의하는 유전자를 확인하는 것이 중요합니다. 망막은 중추 신경계의 다양성 연구를위한 훌륭한 모델로, 여러 주요 세포 유형으로 구성되어 있습니다. 각 주요 부류의 세포에 대한 연구는 이러한 개체군의 동정을 용이하게하는 유전자 마커를 산출했다. 그러나, 세포의 여러 하위 유형이 각각의 주요 망막 세포 클래스 내에 존재하며, 이들 아형의 유형 중 일부는 형태 학적 또는 기능적 특징으로 특징 지어졌지만 유전 적 마커를 가지고있다. 개별 망막 아형에 대한 유전 적 마커에 대한 지식은 특정 시각 기능과 관련된 뇌 표적의 연구와지도 작성을 가능하게하고 유전자 네트워크에 대한 통찰력을 제공한다.세포 다양성을 유지하라. 아형의 유전 적 표지자를 확인하는 데 사용되는 현재의 방법은 서열 분석에 따른 세포 유형의 분류와 같은 단점을 가지고있다. 이는 데이터 분석에 대한 도전 과제이며 클러스터에 동일한 기능의 셀이 포함되도록하기 위해 엄격한 검증 방법이 필요합니다. 우리는 분리 및 시퀀싱 이전에 세포의 형태 및 기능을 확인하여 하위 유형별 마커를 쉽게 식별 할 수있는 기술을 제안합니다. 이 기술은 비 신경 세포 유형뿐만 아니라 사소한 변형이있는 희귀 한 세포 집단까지 확장 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 우수한 품질의 데이터를 제공하며, 많은 라이브러리가 단일 셀에 대해 2,000 만 건 이상의 읽기 깊이를 제공합니다. 이 방법론은 Single-cell RNA-Seq이 제시하는 장애물 중 많은 부분을 극복하고 직접적이고 매우 효율적인 방법으로 세포 유형을 규명하고자하는 연구자에게 적합 할 수 있습니다.

세포 유형은 염료 주입에 따라 쉽게 분류됩니다. 그림 1 은 형광 추적 충전 전후의 GFP + RGC의 예를 보여줍니다. 이 세포는 유전자 변형 라인 ( 그림 1A )에서 GFP의 표현에 따라 확인되었습니다. 견고한 씰이이 셀의 소마 (soma) 위에 미세 팁의 인발 유리 전극으로 형성되었습니다. 아형을 특성화하기 위해, 형광 염색약은 체세포에 주입되어 모든 관련 공정을 채웠다 ( 그림 1B ). M4 ipRGC의 분류는이 세포가 매우 큰 세포를 가지고 있으며 그 과정이 내부 plexiform 층의 ON 하위 세포 내에서 종결된다는 관찰을 통해 가능하게되었습니다 ( 그림 1C ). 고립 된 망막 제제에서 식별 할 수있는 계층화의 차이를 보여주는 예로 M1 (OFF-stratifying), M3 (bistratified), M4 (on-stratifying) ipRGC를 형광 추적 장치로 고정시키고, ON과 OFF 서브 라미네이의 공 초점 이미징을 수행 하였다 ( 그림 1D ). 공 촛점 이미징을 통한 수상 돌기의 시각화는 세포가 형광 추적자 (Schmidt and Kofuji 2009, 2010, &amp; 2011)로 채워질 때 수상 돌기가 고정되지 않은 시험관 조직 에서 보이는 것과 매우 유사합니다. 단일 세포의 cDNA 라이브러리 올리고 d (T) 프라이머의 사용은 mRNA의 선택적 역전사 및 증폭을 허용한다. 각 세포로부터 cDNA 라이브러리를 생성하고 증폭시킨 후, 생물학적 분석기 칩을 사용하여 라이브러리의 품질과 크기를 평가했다. 이 분석의 결과는 이상적인 cDNA 얼룩이 좋은 샘플에서 0.5-2 Kb임을 보여줍니다 ( 그림 2A ). 일부 샘플은 300 bp 이하의 밴드 또는 얼룩을 보여줍니다. sug이러한 라이브러리의 품질이 좋지 않음을 확인하십시오 (문제 해결을 위해 표 1 참조). 양질의 생체 분석기 트레이스의 예는 300bp 이하의 DNA 밴드가 거의 없거나 500bp와 2Kb 사이의 견고한 얼룩을 보여줍니다 (그림 2B). 빈 컨트롤 레인은 각각 35 &amp; 10380bp의 낮은 쪽과 높은 쪽 마커를 표시해야하며 변동이없는 안정된 기준선을 표시해야합니다. 그림 2B 와 2C 에서 볼 수 있듯이 다양한 라이브러리가 우수한 데이터를 생성 할 수있어 뛰어난 판독 깊이와 높은 매핑 속도를 제공합니다. 예상되는 크기의 cDNA 라이브러리가있는 샘플 만이 꼬리표 부착으로 옮겨 져야합니다 (문제 해결을 위해 표 1 참조). 낮은 입력 tagmentation은 시퀀싱을위한 고품질 샘플을 준비합니다. 이 프로토콜은 소량의 시작 물질로 tagmentation에 최적화되어 있습니다.<html> 엘. 더 낮은 양은 적절하게 증폭되지 않고 더 높은 양은 완전히 단편화되지 않기 때문에 단지 250 pg가 성공적인 tagmentation을 위해 가장 잘 작동합니다. tagmentation 및 PCR 증폭 / 샘플 청소를 완료 한 후, 샘플을 다시 bioanalyzer 칩에서 분석했습니다. 이 시점에서 이상적인 cDNA 얼룩은 0.2-1 Kb이어야합니다 ( 그림 3A ). 추적은 두 가지 크기 ( 그림 3B ) 사이에서 부드럽게 균등하게 분포해야합니다. 이 추적은 레인 1의 샘플에 해당합니다. 그림 3C 는 불완전한 태깅을 보여 주며 쉽게 해결할 수 있습니다 (문제 해결을 위해 표 1 참조). 우리는 샘플에 대한 데이터 분석을 수행하여이 프로토콜이 우수한 판독 깊이의 샘플을 생성하고 종종 샘플 당 1,200 만 건의 읽기를 능가하는 것으로 나타났습니다. 평균 69.1 % 매핑; 5,000 개 이상의 유전자를 발현한다. <html> /55229fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 : Melanopsin을 발현하는 ipRGCs 및 형태 학적 특성에서 GFP 발현에 기초한 RGCs 유형의 동정. ( A ) 전체 마운트 망막 준비에 IR-DIC를 사용하여 시각화 망막의 신경절 세포 레이어. ( B ) 동일한 준비는 GFP - 표현 ganglion 세포를 식별 epifluorescence (~ 480 nm의)에서 시각. ( C ) 패치 - 클램프 기록을 목표로하고 형광 추적기로 채워진 GFP 발현 세포. 세포는 매우 큰 소마 크기와 ON 층별 수상 돌기를 기반으로하는 M4 ipRGC로 확인 될 수 있습니다 25 , 26 . ( D ) IPL (M1)의 ON 및 / 또는 OFF 하위 부작용, IPL (M4)의 ON 하위 망막 및 IPL (M3)의 ON 및 OFF 부작용 모두에서 이미지화 된 ipRGC 수상 돌기의 공 초점 이미지. IR-DIC : 적외선 차동 간섭 대비..jove.com / files / ftp_upload / 55229 / 55229fig1large.jpg &quot;target =&quot;_ blank &quot;&gt;이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55229/55229fig2.jpg" /> 도표 2 : Bioanalyzer 자취를 가진 cDNA 도서관 질의 분석. ( A) 역전사, 증폭 및 정제 된 여러 샘플에 대한 Bioanalyzer 출력 예. 레인 1 ~ 3은 이상적인 DNA 얼룩을 보여 주며 대다수의 DNA는 300bp보다 큽니다. 이 범위의 스미어가있는 라이브러리는 일관된 탁월한 시퀀싱 데이터를 제공하여 세포 당 평균 5,683 개의 유전자를 나타냅니다. 레인 4는 성공적으로 처리되지 않아 cDNA가 생성되지 않은 샘플을 나타낸다. 성공적인 제어 레인은 일정한 기준선과 35 및 10,380 bp에서 2 개의 깨끗한 최고점을가집니다. ( B ) 약 2Kb 정도의 높은 강도의 cDNA를 가진 성공적인 생물 분석기 추적의 예. 이것 이야말로<html> mear는 레인 1의 샘플에 해당한다. ( C ) 500bp 주위의 cDNA 중심의 성공적인 바이오 분석기 트레이스의 예. 이 추적은 레인 3의 샘플에 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55229/55229fig2large.jpg" target="_blank">해당합니다.이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55229/55229fig3.jpg" /> 그림 3 : Tagmented Samples 0.2와 2 Kb 사이의 강한 얼룩. ( A ) tagmentation, 증폭, PCR clean-up 후에 대표적인 bioanalyzer 산출물. ( B ) (A)의 레인 1에 해당하는 성공적으로 꼬리표를 붙인 표본의 추적. ( C ) 불완전한 태미 네이션 (tagmentation)을 갖는 샘플에 대한 트레이스의 예로서, 약 1Kb의 피크 강도에 의해 클리어된다.&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 문제 </td><td> 가능한 원인 </td><td colspan="2"> 해결책 </td></tr><tr><td> 단계 3.3) GΩ 씰을 형성 할 수 없음 </td><td> 세포 표면이 충분히 깨끗하지 못합니다. </td><td colspan="2"> 정압을 사용하여 추가 청소 </td></tr><tr><td> 단계 3.3) 세포가 수축 / 사망하는 것처럼 보임 </td><td></td><td colspan="2"> 새로운 피펫을 준비하고 새 세포를 목표로하십시오. </td></tr><tr><td> 단계 3.4) 수상 돌기의 터미널 위치를 결정할 수 없음 </td><td> Alexafluor는 세포 전체에 퍼지기에 충분한 시간이 없거나 Alexafluor의 농도가 충분히 높지 않습니다. </td><td colspan="2"> 카메라의 게인과 노출 시간이 충분히 긴지 확인하십시오. 수상 돌기를 시각화하기 전에 추가로 5 분 기다립니다. 수상 돌기가 여전히 보이지 않으면 높은 Alexafluor집중. </td></tr><tr><td> 단계 4.1) 모든 세포질을 흡인 할 수 없음 </td><td></td><td colspan="2"></td></tr><tr><td> 단계 5.5) 8 분 후에 상등액이 맑지 않다. </td><td></td><td colspan="2"> 부드럽게 자성 분리기에있는 동안 전체 솔루션을 두 번 pipette, 그리고 또 5 분 앉아 </td></tr><tr><td> 단계 5.5) 피펫 팅 중에 펠렛이 분산 됨 </td><td> 샘플이 자석에서 너무 멀리 있습니다. </td><td colspan="2"> 모든 pipetting 동안 튜브를 자기 분리 장치에 보관하십시오. 용액을 제거하고 5 분 동안 구슬을 다시 펠렛에 넣습니다. </td></tr><tr><td> 단계 5.7) 5 분 후 샘플은 광택이 나타남 </td><td> EtOH의 최대 양이 제거되지 않았습니다. </td><td colspan="2"> 건조 중에 샘플을 계속 모니터하십시오. 매 2 분마다, P10 피펫을 사용하고 튜브 바닥의 모든 EtOH를 제거하십시오 </td></tr><tr><td> 단계 8.9) 재수 화 전에 펠렛에 균열이 있음 </td><td></td><td colspan="2"> 샘플 재 확보 허용비율이 2가 아닌 총 4 분 동안 (단계 8.10) </td></tr><tr><td> 단계 8.11) 소량의 비드를 상등액 </td><td></td><td colspan="2"> 전체 샘플을 다시 튜브로 꺼내고 1 분 동안 자성 분리기에 놓습니다. 부드럽게 피펫 펠렛을 피하십시오 </td></tr><tr><td> 단계 8.12) DNA 번짐이 일치하지 않고 형광 배율이 지속적으로 변경됩니다 </td><td> HS 칩의 농도가 너무 높습니다. </td><td colspan="2"> 검체의 농도를 확인하고 1 - 10 ng / μL 사이에서 희석하십시오. 재사용 bioanalyzer </td></tr><tr><td> 단계 8.12) 저 분자량 스미어 </td><td> RNA 분해 </td><td colspan="2"> 수거 후 즉시 세포를 플래시해야합니다. 이 cDNA 라이브러리 폐기 </td></tr><tr><td> 단계 8.12) 제어 레인의 마커 기저 변동 </td><td> 오염 또는 오래된 시약 </td><td colspan="2"> DNA 마커를 버리고 Bioanalyzer 실행을 위해 새 튜브를 사용하십시오. </td></tr><tr><td> 단계 8.12) DNA 번짐 없음 </td><td> 세포를 추방하지 못함 </td><td colspan="2"> 약간 큰 팁으로 새 바늘 잡아 당기기 </td></tr><tr><td></td><td> RNA 비드 실패 </td><td colspan="2"> 구슬이 사용 전에 완전히 재현되었는지 확인하고 샘플을 자성 분리기에 놓기 전에 부화 시키도록하십시오 </td></tr><tr><td> 단계 8.12) 약한 DNA 번짐 </td><td> 증폭이 충분하지 않다. </td><td colspan="2"> 더 많은 PCR주기 사용 </td></tr><tr><td> 단계 8.12) 500bp-2Kb 범위 외의 DNA 번짐 </td><td></td><td colspan="2"> 0.5 이하 및 2 Kb 초과의 DNA 얼룩은 오염 가능성이 있습니다. 샘플 삭제 </td></tr><tr><td> 단계 8.12) DNA 추적에 규칙적으로 간격을 둔 스파이크 </td><td> 샘플의 오염 </td><td colspan="2"> 항상 신선한 장갑을 착용하고 헹굼을 위해 새로운 에탄올을 만드십시오. 필터 팁은 항상 사용되어야합니다. </td></tr><tr><td> 9.3 단계) 형광 분석기에서 시료 농도를 검출 할 수 없음 </td><html><td></td><td colspan="2"> 검출 수준 이하의 표본은 표본을 만들기에 너무 적은 DNA를 가지고 있으므로 사용할 수 없습니다 </td></tr><tr><td> 단계 10.10) 10 분 후에 샘플이 건조하지 않음 </td><td> 과량의 EtOH를 계속 제거한다. </td><td colspan="2"> 샘플을 더 오래 보관할 수있게하고, 매분마다 점검하십시오. </td></tr><tr><td> 단계 10.13) 스미어가 2Kb로 기울어 짐 </td><td> 불완전한 조각화 </td><td colspan="2"> 0.2 ng / μL가 아닌 0.15 ng / μL의 농도로 시료를 다시 희석하십시오. 꼬리표 재실행 </td></tr><tr><td> 10.13 단계) 도말이 200bp로 기울어 짐 </td><td> DNA 입력이 너무 적습니다. </td><td colspan="2"> 샘플을 덜 희석하고 농도를 0.4 ng / μL로하십시오. 꼬리표 재실행 </td></tr><tr><td></td><td> Tagmentation 반응이 너무 깁니다. </td><td colspan="2"> tagmentation 반응 시간을 8 분으로 단축 </td></tr><tr><td> 단계 10.13) 약한 얼룩 </td><td> 부적절한 DNA 증폭 </td>2 &quot;&gt; 시료를 0.4 ng / μL의 농도로 희석하고 tagmentation을 다시 실행하십시오 </td></tr><tr><td> 단계 11.2) 최대 수득 가능한 풀 농도는 5 nM 미만이다 </td><td></td><td colspan="2"> 현저하게 낮은 농도를 가진 표본을 확인하고 새로운 희석액으로 표백을 재실행하십시오. </td></tr></tbody></table> 도표 1 : 의정서에있는 잠재적 인 방해를위한 해결책 그리고 제안. 이 표에는이 프로토콜 동안 발생할 수있는 잠재적 인 어려움과이를 접할 수있는 단계가 나열되어 있습니다. 이 표에는 이러한 문제에 대한 가능한 원인과 문제 해결에 도움이되는 해결책이 나와 있습니다.

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Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

여기에서, 우리는 단클론 성 전 사체의 단리 및 후속 특성 규명을 위해 연결 세포 유형을 분류하기위한 조합 접근법을 제시한다. 이 프로토콜은 성공적인 RNA 시퀀싱 (RNA-Seq)을위한 샘플 준비를 최적화하고 세포 다양성의 강화 된 이해를 위해 특별히 고안된 방법을 설명합니다.

망막 신경절 세포의 정의 된 서브 세트의 단일 세포 RNA-Seq

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

single-cell-rna-seq-of-defined-subsets-of-retinal-ganglion-cells

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K 조회수.  Iowa State University.  여기에서, 우리는 단클론 성 전 사체의 단리 및 후속 특성 규명을 위해 연결 세포 유형을 분류하기위한 조합 접근법을 제시한다. 이 프로토콜은 성공적인 RNA 시퀀싱 (RNA-Seq)을위한 샘플 준비를 최적화하고 세포 다양성의 강화 된 이해를 위해 특별히 고안된 방법을 설명합니다. 

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An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

유전적으로 망막 신경절 라벨 셀에서 라이트 응답을 기록하기 위해 절연 망막 준비

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

연구

신경과학

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

개발하고 성숙한 망막 신경 세포의 단일 세포 프로 파일링

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

Wholemount 쥐의 망막에서 면역 조직 화학 및 칼슘 이미징 방법

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

유동 세포 계측법에 의한 일차 망막 신경절 세포 (RGCs)의 분리

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

생체공학

Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies revealing novel paradigms in vascular biology. Applying these methods to models of vascular development requires the optimization of cell isolation techniques from embryonic and postnatal tissues. Cell yield, viability, and purity all need to be maximal to obtain accurate and reproducible results from next-generation sequencing approaches. The neonatal mouse retinal vascularization model is used by researchers to study mechanisms of vascular development. Researchers have used this model to investigate mechanisms of angiogenesis and arterial-venous fate specification during blood vessel formation and maturation. Applying next-generation sequencing techniques to study the retinal vascular development model requires optimization of a method for the isolation of retinal endothelial cells that maximizes cell yield, viability, and purity. This protocol describes a method for murine retinal tissue isolation, digestion, and purification using fluorescence-activated cell sorting (FACS). The results indicate that the FACS-purified CD31+/CD45- endothelial cell population is highly enriched for endothelial cell gene expression and exhibits no change in viability for 60 min post-FACS. Included are representative results of next-generation sequencing approaches on endothelial cells isolated using this method, including bulk RNA sequencing and single-cell RNA sequencing, demonstrating that this method for retinal endothelial cell isolation is compatible with next-generation sequencing applications. This method of retinal endothelial cell isolation will allow for advanced sequencing techniques to reveal novel mechanisms of vascular development.

This protocol describes a method for the isolation of murine postnatal retinal endothelial cells optimized for cell yield, purity, and viability. These cells are suitable for next-generation sequencing approaches.

차세대 염기서열분석을 위한 뮤린 망막 내피 세포의 분리

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

발생학

Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq

Powerful next generation sequencing techniques offer robust and comprehensive analysis to investigate how retinal gene regulatory networks function during development and in disease states. Single-cell RNA sequencing allows us to comprehensively profile gene expression changes observed in retinal development and disease at a cellular level, while single-cell ATAC-Seq allows analysis of chromatin accessibility and transcription factor binding to be profiled at similar resolution. Here the use of these techniques in the developing retina is described, and MULTI-Seq is demonstrated, where individual samples are labeled with a modified oligonucleotide-lipid complex, enabling researchers to both increase the scope of individual experiments and substantially reduce costs.

Here, the authors showcase the utility of MULTI-seq for phenotyping and subsequent paired scRNA-seq and scATAC-seq in characterizing the transcriptomic and chromatin accessibility profiles in retina.

scRNA-Seq 및 scATAC-Seq 를 이용한 망막 유전자 발현 및 크로마틴 접근성의 다중화 분석

Powerful next generation sequencing techniques offer robust and comprehensive analysis to investigate how retinal gene regulatory networks function during ...

Longitudinal In Vivo Imaging of Retinal Cells with Tailored Adeno-Associated Virus Serotypes via Confocal Scanning Laser Ophthalmoscopy

The dynamic nature of retinal cellular processes necessitates advancements in gene delivery and live monitoring techniques to enhance the understanding and treatment of ocular diseases. This study introduces an optimized adeno-associated virus (AAV) approach, utilizing specific serotypes and promoters to achieve optimal transfection efficiency in targeted retinal cells, including retinal ganglion cells (RGCs) and M&#252;ller glia. Leveraging the precision of confocal scanning laser ophthalmoscopy (CSLO), this work presents a non-invasive method for in vivo imaging that captures the longitudinal expression of AAV-mediated green fluorescent protein (GFP). This approach eliminates the need for terminal procedures, preserving the continuity of observation and the well-being of the subject. Furthermore, the GFP signal can be traced in AAV-infected RGCs along the visual pathway to the superior colliculus (SC) and lateral geniculate nucleus (LGN), enabling the potential for direct visual pathway mapping. These findings provide a detailed protocol and demonstrate the application of this powerful tool for real-time studies of retinal cell behavior, disease pathogenesis, and the efficacy of gene therapy interventions, offering valuable insights into the living retina and its connections.

This protocol describes the use of adeno-associated virus (AAV) vectors for cell-specific labeling and in vivo imaging using a confocal scanning laser ophthalmoscope (CSLO). This method enables the investigation of different retinal cell types and their contributions to retinal function and disease.

The dynamic nature of retinal cellular processes necessitates advancements in gene delivery and live monitoring techniques to enhance the understanding ...

Isolating Murine Retinal Ganglion Cells Using Fluorescence-Activated Cell Sorting

Source: Chintalapudi, S. R., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/55785">Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates the procedure for isolating murine primary retinal ganglion cells (RGCs) by using flow cytometry. This method allows for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

형광 활성화 세포 분류를 사용한 쥐 망막 신경절 세포 분리

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee. 
1. Preparation of ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Quantification of Retinal Ganglion Cell Somas Following Cauterization-Induced Ocular Hypertension 

<a href='https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/63442/full-circle-cauterization-limbal-vascular-plexus-for-surgically'>Source: Lani-Louzada, R., et al.&#160; Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents. J. Vis. Exp. (2022).</a>This video demonstrates the quantification of retinal ganglion cells from chemically fixed rat retinas subjected to full-circle cauterization of the limbal vascular plexus. The process includes permeabilization, antibody staining, and nuclear counterstaining, followed by visualization under an epifluorescence microscope to assess the impact of elevated intraocular pressure on retinal ganglion cell viability.

Source: Lani-Louzada, R., et al.&#160; Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents. J. Vis. Exp. ...