이 작품은 지원 K12 HD068322 (SCM)에 의해; R01 CA179921 및 P51 OD011092 (AVM); 그리고 수상 14PRE20320014 미국 심장 협회 (SB)에서.

참고: BSL-2 조건 하에서이 프로토콜에서 설명 하는 모든 절차를 수행 합니다.
 1. KSHV 재고 준비 <ol><li>준비 TNE 버퍼: ddH 2 O 292.24 mg EDTA를 해산, 225 mL를 가져오고 pH 8에 조정. DdH 2 O 605.7 mg Tris를 녹이, 225 mL을 고 pH 8에 조정. EDTA와 트리 스 솔루션을 결합, 4.38 g NaCl을 추가, 500 mL를 최종 볼륨을 조정, 필터링, 소독 및 4 ° C .에서 저장</li>
	<li>문화 KSHV 긍정, 5% CO 2 RPMI 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 약 1 제 보충에 플러스 37 ° C에 습도 인큐베이터에서 EBV 부정적인 기본 유출 림프 종 셀 선 BCBL-1 mL 당 10 6 셀 x 1.2.</li>
	<li>KSHV 생산을 유도 하기 위해 신선한 매체와 문화 1:2 분할 및 20 ng/mL의 최종 농도에 Phorbol Myristate 12 13-아세테이트 (PMA)을 추가 하 고 5 일에 대 한 문화를 품 어. 대신, 나트륨 낙 산 염 (NaB, 0.1 m m) 용균성 바이러스 성 복제를 유도 하기 위해 3 일에 대 한 세포 치료.</li>
	<li>바이러스 성 입자를 수확, 먼저 작은 셀을 신선한 튜브 supernatants 전송 실 온에서 5 분에 대 한 300 x g에서 표면에 뜨는 문화 원심.</li>
	더 명확히 세포질 파편의 전송을 피하기 상쾌한 <li>4에서 10 분 동안 2500 x g에서 원심 ° c. 
	참고:로 명확한 문화 supernatants의 여과 살 균 0.45 μ m 필터를 수행할 수 있습니다 통해 고속 원심 분리에 대안. 우리는 여과;를 사용 하 여 titer에 상당한 드롭 관찰 따라서, 우리가 일상적으로 수행 두 번째 원심 분리 단계 대신.</li>
	<li>다음, 6 ultracentrifuge 튜브에서 표면에 뜨는 명확히 문화의 약 30 mL와 TNE 버퍼에서 25% 자당 해결책의 5 mL을 오버레이.</li>
	<li>원심 분리기 튜브 진공에서 4 ° C에서 2 시간에 대 한 75000 x g에서 균형.</li>
	<li>문화 표면에 뜨는 가만히 따르다, 가능한 만큼 상쾌한 및 자당 솔루션을 제거 하려면 각 튜브의 오 점 그리고 TNE 버퍼의 150 µ L에 표시 되지 않을 수 있습니다 바이러스 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>수영장 모든 resuspended 바이러스, 잘, 그리고 동결-80 ° C .에서 25 µ L aliquots</li>
</ol> 2. E 6와 E7 유 두 종 바이러스 유전자 EC의 변환 참고: 우리는 일상적으로 기본 적 성장을 위한 표준 조직 배양 플라스 크를 사용 그러나, EC의 불만족 성장을 가져온 경우 다음 상업 문화 플라스 크를 사용 하 여 고려해 야 합니다.
<ol><li>문화 기본 인간의 피부 microvascular 또는 림프 EC 5% 플러스 37 ° C에 습도 인큐베이터에서 CO 2 EC 성장 매체에서 (EGM; EC 기저 매체 [EBM] EGM-2 BulletKit [FBS, 포함 된 보충을 포함 날린, 인간 섬유 아 세포 성장 인자-B, 혈관 EC 성장 인자, 인슐린 같은 성장 인자-1, 아 스 코르 빈 산, 인간 상피 성장 인자, 항생제, 및 헤 파 린]) 약 50% 합류 하 T75 셀 문화 플라스 크에.</li>
	<li>변환, 문화 PA317 LXSN 16E6E7 세포 37 ° C에 습도 인큐베이터에서 24 , 35 플러스 5% CO 2 DMEM 10 %FBS에 제 보충에 T150 셀 문화 플라스 크 들은 약 90% 합칠 때까지. 다음 매체의 16 mL에서 밤새 품 어.</li>
	<li>Centrifuging 300 x g 실 온에서 5 분에 의해 PA317 매체를 명확히.</li>
	<li>명확히 PA317 매체의 12 mL와 EC 문화와 오버레이 셀에서는 EGM를 제거 하 고 4 헤에 대 한 품 어 
	참고: Centrifuging 16 mL 5 분 결과 명확히 상쾌한의 12 mL의 주의 후속 제거에 의해 방해 하지 소형 펠 릿에 대 한 300 x g에서 조절된 하는 매체의. 그러나, 필요한 경우 기본 EC 문화 PA317 LXSN 16E6E7 셀의 전송 (포장 셀 라인은 신속 하 게 자라 다 EC), 다음 전송 되기 전에 0.45 μ m 필터를 통해 바른된 상쾌한의 여과 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>밤새 품 어 고 신선한 EGM PA317 매체의 6 mL.</li>
	<li>Refeed EC 12 mL와 함께 신선한 EGM 추가 48 헤 알을 품고 고</li>
	<li>EC, 하위 문화 매체를 제거 없이 양이온, PBS의 12 mL로 씻어 여 상업 효소 분리 솔루션 (예를 들어, TrypLE)의 3 개 mL를 추가 그리고 3 분 동안 37 ° C에서 품 어</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 실 온에서 5 분에 대 한 300 x g에서 원심. 결과 셀 펠 릿 신선한 EGM에서 resuspend와 3 x T75 플라스 플라스 크 당 12 mL EGM의 최종 볼륨을 균등 하 게 나눌.</li>
	<li>E6 및 E7 불리고 EC에 대 한 선택, 두 구절, 후 transduced EC 수 있습니다 감염에 대 한 도금 또는 액체 질소에서 냉동에 대 한 200 µ g/mL의 최종 농도에 G418 추가.</li>
</ol> 3. KSHV로 불리고 EC의 감염 <ol><li>감염 전날에 위에서 설명한 대로 상업 효소 분리 솔루션을 사용 하 여 효소 소화에 의해 EC 수확. EGM의 1 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 셀의 5 µ L를 사용 하 여 준비 Trypan 블루에서 1/10 희석. hemocytometer를 사용 하 여 라이브 셀 및 씨앗 10 5 라이브 셀 6 잘 플레이트에 잘 당 EGM의 2 mL x 2.5.</li>
	<li>감염의 날, EGM 제거 잘, 당 3 mL PBS의 칼슘과 마그네슘을 가진 세포를 씻어 고 다음 추가 2 mL EBM. 
	참고: 그것은 필수적 이다 감염, 동안 EGM 보다 EBM을 사용 하도록 EGM에서 헤 파 린을 바이러스 성 입자의 바인딩 및 대상 적의 후속 감염 억제</li>
	<li>KSHV, 세포를 감염 시킬 각 음을 5 ~ 20 µ L 바이러스 주식을 추가 하 고 소용돌이를 섞어 접시. 모의 감염 된 세포 각 잘 하는 같은 TNE 버퍼 양의 추가.</li>
	<li>실 온에서 30 분 400 x g에서 격판덮개 원심 고 90 분 동안 37 ° C에서 번호판을 품 어</li>
	<li>연구의 목표는 조사 초기 이벤트 동기 바이러스 감염, 예를 들면에 드 노 보 감염 초기 이벤트를 요구 하는 경우이 시점에서 바이러스 inoculum을 제거 합니다. 린스 및 2 mL와 함께 셀 refeed 신선한 EGM. 그렇지 않으면, 2 mL EGM 추가 하 고 밤새 문화를 품 어.</li>
	<li>감염 후 다음 매일 2 mL EGM 셀 하루 refeed.</li>
	<li>셀은 약 90% 합칠 때 위에서 설명한 대로 상업 효소 분리 솔루션을 사용 하 여 효소 소화에 의해 수확 후 총 통과 번호와 통로 지적 T75에 3 개의 우물에서 셀 풀 감염 된 후.</li>
	<li>모의 및 KSHV-감염 된 EC 어느 시간에 세포 실험에 사용 하거나 수 액체 질소에서 냉동 두 개 이상의 더 많은 구절에 대 한 1:3 분할으로 확장. 
	참고: e 6와 E7 불리고 EC의 분할와 마찬가지로 모의 KSHV 감염 세포의 유지 보수 문화 분할 해야 합류 (85 ~ 90%)에 도달 하기 전에.</li></ol>
 4. 면역 형광에 의해 KSHV 감염 확인 참고: KSHV 대기 시간 관련 핵 항 (라-1/ORF73)의 감염의 신뢰할 수 있는 양적 측정을 제공 합니다. 안티-라 나 항 체는 상용.
<ol><li>얼룩, 전날 플레이트 두 웰 스와 모의 또는 KSHV-감염 된 EC 1 x 10 5에서 24-잘 접시에 각각 당 세포 1 mL EGM에서에서 잘 하 고 밤새 품 어.</li>
	<li>세척 셀 두 번 500 µ L PBS 플러스 칼슘과 magniseum의. 30에 대 한 세척 락 플랫폼에 s.</li>
	<li>외부 ventillated 연기 후드, 실 온에서 15 분 동안 4 %paraformaldehyde 500 µ L로 세포 수정.</li>
	<li>셀 워시 버퍼 (0.1% 트라이 톤 X-100 플러스 PBS 플러스 양이온에 0.02% 염소 혈 청)의 500 µ L로 세 번 세척.</li>
	<li>실 온에서 30 분 동안 세척 버퍼에서 2% 염소 혈 청의 500 µ L로 세포를 차단.</li>
	<li>셀 워시 버퍼의 500 µ L로 세 번 세척.</li>
	<li>라벨의 모의 또는 KSHV-감염 된 200 µ L의 1 차적인 항 체와 EC 1시 10분 희석 한 잘로커에 실 온에서 30 분 동안 세척 버퍼에 0. 워시 버퍼만의 200 µ L에서 나머지 두 개의 우물을 품 어.</li>
	<li>셀 워시 버퍼의 500 µ L로 세 번 세척.</li>
	<li>로커에 실 온에서 30 분 동안 세척 버퍼에서 이차 항 체 희석 1: 100의 200 µ L로 모든 4 개의 우물을 라벨.</li>
	<li>셀 워시 버퍼의 500 µ L로 세 번 세척.</li>
	<li>각 잘 하려면 중간 포함 DAPI를 탑재 하는 coverslip 20 µ L을 적용 하 고 거꾸로 형광 현미경을 사용 하 여 얼룩을 평가.</li>
	<li>적어도 200 셀에서 라 나 긍정적인 핵의 수를 계산 하 여 KSHV에 감염 된 세포의 백분율 감염을 확인 합니다. 재조합 KSHV Bac16 또한 GFP의 표현 위한 문화의 관찰을 통해 감시 될 수 있다 감염.</li>
</ol>

없음입니다.

발암 circumvents36는 유기 체 내에서 중요 한 보호 하는 다단계 프로세스입니다. KS 병 변 진정한 sarcomas에 만성 염증의 스펙트럼을 따라 존재, KSHV에 의해 중재 특정 pathophysiological 프로세스의 변환9를 지 원하는 셀 문화 모델에 몇 가지 연구를 실시 해야 합니다. 그것은 접촉 금지 및 앵커리지 종속 성장, 고기 세포 변화의 지표로 쉽게 개발 하지 않습니다 주목 해야한다 기본 EC 또는 EC telomerase의 외 인 식으로 불후의 감염 다음. 따라서, 여기에 설명 된 KS의 생체 외에서 모델 KS 종양 microenvironment의 모든 측면을 하거나 explanted KS 셀의 동작 정리 하지 않습니다, 하는 동안 그것은 감염에 의해 유도 된 호스트 세포 유전자 발현에 변화를 공부 하 고 적합 KS tumorigenesis 기여할 KSHV
첫 번째 유전자 발현 연구 여기 설명 된 문화 시스템을 사용 하 여 프로 파일링 KSHV 감염 세포25의 변형 된 표현 형에 참여자로 수용 체 티로신 키 니 아 제 c-키트를 확인 했다. SiRNA를 사용 하 여 c-키트 표현의 허물고 또는 c-키트는 지배적인 부정적인 구문 또는 티로신 키 니 아 제 억제 물 STI 571 (Imatinib)를 사용 하 여 신호 억제 KSHV 매니페스트의 변형 능력 foci 형성 연장 후의 손실에 의해 방해 감염 된 세포의 문화입니다. Imatinib의 후속 임상 평가 전염병 KS47,,4849를 가진 환자에서이 약의 효능을 입증 했다. 다른 잠재적인 치료 표적도 확인 되었습니다, heme oxygenase-126,50, CXCR727, 그리고 베타 아드레날린 수용 체28, 모두의 성장 또는 변화에 있는 역할을 포함 하 여 EC 생체 외에서. 이러한 유전자 표현 패턴 기본 EC 뿐만 KS 생 검 조직이이 시스템의 생리 적인 관련성을 확인 하 고 KS 치료제25,26, 전 임상 모델의 값을 밑줄에 확인 51,,5253,54,55.
E6/E7 변환 시스템의 또 다른 힘은 그의 확장 된 수명 불후 주 EC 활성화에 비해 연령과 KSHV의 결과의 비교 평가 위한 모의 감염 제어 통과 일치 하는 셀의 장기적인 유지 관리 감염입니다. E 6와 E7 합류 (85 ~ 90%)에 도달 하기 전에 문화를 분할 하는 것이 중요 불리고 EC의 통행의 수를 최대화 하려면 유의 중요 하다. 또한, 이러한 세포 시간의 연장된 기간에 대 한 혈 청 무료 조건을 용납. 기본 EC 급속 하 게 성장 인자 철수 시 프로그램 된 세포 죽음을 받아야 하며 따라서 수 없습니다 교양 혈 청 또는 재조합 성장 요인56,57없이 오랜 기간 동안. 이 의존은 autocrine 신호 경로 전체 변환 전에 KSHV 감염 세포 또한 성장 인자 철수 (미 출판 시 프로그램 된 세포 죽음을 받게 될 것 이다로 파악 하 고 공부 하 고, 어려운 KSHV 감염에 의해 유도 된 관측)입니다. 그러나,이 모델에서 E6 및 E7 단백질의 존재 성장 인자 철수 다음 프로그램 된 세포 죽음을 방지 하 고 장기 (예를 들어, 48 h)에 대 한 허용 낮은 혈 청 또는 혈 청 무료 중간25,26 문화 , 28.
KS는 만성 염증 및 세포 변환의 기능으로 복잡 하 고 특이 한 질병 이다. 새로운 치료 전략에 대 한 임상 필요 훌륭합니다, 그리고 여기에 설명 된 셀 문화 모델 속성이 고유한 약 대상 후보자의 평가 허용 하는.

Kaposi 육 종 (KS)은 고급 면역 억제1의 설정에서 가장 일반적으로 발전 하는 다중 초점 angioproliferative 종양, 점 막, 피부 및 내장 사이트에 영향을 미치는. 4 개의 역학 양식 설명: 클래식, 일반적으로 지중해와 중동 유산;의 노인 들에 영향을 미치는 나태 한 형태 의원 성, 장기 이식; 다음 면역 억제 약물과 치료 결과 전염병, 에이즈-정의 암; 그리고 발병, 아프리카에서 풍토 성 지역에서 아이 들에 있는 일반적인 HIV 독립적인 형태. 에이즈의 치료에 대 한 효과적인 조합 방지 retroviral 약물 regimens의 도래와 함께 전염병 KS 훨씬 덜 일반적으로 개발 도상국에서 진단 이다. 그러나, 임상 적극적인 지방 병 및 전염병 양식 많은 아프리카 국가2,,34진단된 암 중 가장 일반적으로 남아 있습니다. 따라서, KS의 치료에 대 한 효과적인 병 인 대상 약물의 식별은 연구 우선권 이다.
조직학, EC 근원의 스핀 들 세포 불연속 혈관 네트워크5를 형성 하는 의하여 광범위 한 하지만 비정상적인 neovascularization KS 병 변 특징 이다. 이러한 비정상적인 혈관 ("혈관 슬릿") 그들의 독특한 색깔 장애를 주는 적혈구의 넘쳐 흐름을 수 있습니다. 또한, 병 변 수많은 백혈구 (림프 톨, 대 식 세포, 및 플라스마 세포) 만성 염증의 특성을 포함 합니다. KS 병 변 면역 재구성 다음의 회귀, KS 하이퍼 증식 병 변 및 진정한 종양6,,78,9의 기능을가지고 제안 설명 하고있다.
KS herpesvirus (KSHV), KS의 원인이 되는 대리인 199410에서 확인 되었다. 그때 많은 체 외에서 세포 배양 모델 개발 되었습니다 이후 병 인 연구를 활성화 하려면 셀을 포함 하 여 explanted 종양 생 검 재료와 기본에서 또는 telomerase를 표현 EC 감염 KSHV 생체 외에서11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. 현재 사용 가능한 모델의 아무도 완벽 하 게 KS 종양 microenvironment이 하지만 모든 KSHV 감염의 pathobiology의 우리의 이해에 귀중 한 지식을 공헌 했다. 다른 알려진된 tumorigenic 인간 herpesvirus 엡 스타인-바 바이러스 (EBV), 달리 KSHV 않습니다 하지 쉽게 변형 문화 드 노 보 감염19,20,21, 다음에 셀 그러나 22., microvascular 또는 림프는 E6 혼합의 기본 인간의 EC를 시험 하 여이 한계를 극복 하 고 인간 유 두 종에서 E7 유전자 입력 KSHV23,24 감염 전에 16 . 이러한 외 인 oncogenes의 표현은 극적으로 retinoblastoma 단백질 및 p5323,24의 저해를 추가 제공 하 여 일부에 KSHV에서 생체 외에서 의 변형 잠재력을 증가 한다. 이 EC 변환 방법은 키 변경 호스트를 식별 하기 위해 여러 실험실 세포 유전자 발현에 KSHV 감염에 의해 유도 된다 고 KS 세포 생존과 확산25,26 촉진을 나타나는 수 있다 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. 여기에 설명 된 프로토콜 간단 하 고 매우 재현, 그리고 나이 고 통과 일치 KSHV 감염 EC 및 모의 감염 컨트롤까지 1 차 셀 이상 경작 될 수 것입니다 생성 귀 착될 것 이다 종양 메커니즘 KSHV에 의해 고용의 수사에 대 한 허용. 프로토콜 기본 유출 림프 종 세포 선 BCBL-1, E6/E7 불후 EC에서에서 KSHV에 매우 취약도 야생 타입의 생산을 위한 메서드가 포함 되어 있지만 감염 재조합 BACmid KSHV BAC1630파생. BAC16의 준비에 대 한 프로토콜은 설명 되어33,34.

<table><tbody><tr><td>BCBL-1 cells</td><td>NIH AIDS Reagent Program</td><td>3233</td><td></td></tr><tr><td>PA317 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2203</td><td></td></tr><tr><td>Neonatal dermal microvascular endothelial cells</td><td>Lonza</td><td>CC-2505</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 Basal Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>anti-KSHV LANA/ORF 73</td><td>Advanced Biotechnologies</td><td>13-210-100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;Express, no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS with calcium and magnesium</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus

Kaposi 육 종 (KS) KSHV, 내 피 세포 (EC)의 감염에 의해 시작 되 고 면역 억제의 설정에서 가장 자주 개발 확산 스핀 들 세포의 구성 된 특이 한 종양 이다. 연구의 십 년간에 불구 하 고 KS의 최적의 치료 남아 가난 하 게 정의 하 고 임상 결과 리소스 제한 설정에 특히 유리한 되지 않습니다. KS 병 변은 병 적인 신생, 만성 염증 및 발암에 의해 구동 됩니다 하 고 다양 한 생체 외에서 세포 문화 모델 이러한 프로세스 연구 개발 되었습니다. 그래서 EC 계보 세포 제공 스핀 들 세포 선구자의 가장 적합 한 생체 외에서 서로게이트 KS 내 피 기원, KSHV에 감염 된 세포에서 발생 합니다. 그러나, EC 수명이 제한 된 생체 외에서 때문에 그리고 KSHV에 의해 고용 되어 종양 메커니즘은 tumorigenic 다른 바이러스의 그들 보다, 그것은 어려운 되었습니다에서 변환의 과정을 평가 하기 위해 또는 telomerase 불후 적 따라서, 소설 EC 기반 문화 모델 쉽게 변환 KSHV 감염 다음을 지 원하는 개발 되었다. 인간 papillomavirus 유형 16의 E6 및 E7 유전자의 소성 식 확장된 문화의 나이 및 통로 일치 모의 및 KSHV-감염 된 EC에 대 한 허용 하 고 진정으로 변환의 개발을 지원 합니다 (즉, tumorigenic) 표현 형에 감염 된 세포 배양 . KS의 세공 및 높은 재현성이 모델 임상 설정으로 번역에 대 한 높은 잠재력을 가진 몇 가지 필수적인 신호 통로의 발견을 촉진 했다.

기본 EC의 형태는 고전적인 "자갈 돌"로 설명 하 고이 형태는 유 두 종 바이러스 E6, E7 유전자 (그림 1A)의 표현에 의해 수정 되지 않습니다. 혼자 E6 및 E7 유전자의 표현; 변형 된 표현 형을 유도 하지 않습니다. 따라서, 셀 문의 억제에 취약 하 고 문화에 합류에 도달 시 분할 하는 것을 중단 됩니다. 그러나 셀 증식 하 고 합류 trypsinization와 낮은 밀도, 모의 감염 컨트롤 사용을 위한 연령 및 통행 일치 문화의 유지 보수에 대 한 허용에 replating을 regrow.
KSHV와 E6/E7 불리고 EC의 감염 KS 병 변 (그림 1B)에 "스핀 들 세포" 표현 형의 연상은 문화에 극적인 형태 변화를 발생 합니다. 변형 된 형도는 매니페스트 부분에 접촉 금지의 손실에 의해 셀 부드러운 천 (그림 2)에서 경작된 후 합류 (그림 1C)와 앵커리지에 관계 없이 성장 때 KSHV, 감염 시 유발 됩니다. 접촉 금지 및 발암 중 엑스트라 세포 매트릭스 상호 작용 (앵커리지)에 대 한 의존도 두 세포 변환36의 특징 중. 그것은 주 EC 또한 KSHV 감염에 취약 하며, 주 EC 시스템 elucidating 바이러스-호스트 상호 작용 및 그 결과의 다양 한 측면에 대 한 매우 귀중 한 되었습니다 해야 합니다. 이러한 연구는 문학에서 잘 표현 하 고 몇 가지 예제는 여기 인용37,38,39,40,,4142,43 ,44.
Immunofluorescent 얼룩 KSHV에 감염 된 세포의 스핀 들 형태는 라 나-1/ORF73 (그림 3A와 3B, 빨간색) 바이러스 성 단백질의 식이와 관련 된 방법을 보여 줍니다. KSHV 감염 된 문화 도달 되도록 잘 당 추가 하는 바이러스의 볼륨을 조정 한다 주식에 바이러스의 농도 준비 사이 다 것입니다, &#62; 하나 또는 두 개의 구절 내에서 90% 감염. 직렬 통로와 감염의 비율 100% 접근 것 이다 하 고 문화 (약 20 구절) 동안 유지 됩니다. Paracrine 영향의 연구, 의도 또는 인접 한 감염 되지 않은 세포는 컨트롤 (예를 들어, 면역 형광 검사 연구 관심사의 다른 단백질을 포함)로 서 필요한 경우 바이러스의 낮은 금액을 사용할 수 있습니다. 감염 된 문화 또한 용균성 바이러스 성 단백질의 표현을 지원 하지만, KS 병 변에서 관찰은, 셀 문화에만 소수의 저절로 용균성 재 (그림 3B, 녹색)를 받게 될 것 이다. KSHV-BAC16, GFP와 태그는, 감염 한 세포는 또한 스핀 들 형태 (그림 3C 와 3D) 개발. KSHV-BAC16을 사용 하면 순차적으로 희석 집중된 바이러스 재고와 세포를 감염 하 고 흐름 cytometry30을 사용 하 여 48 시간 게시물 감염에 GFP 식에 대 한 셀을 평가 하 여 바이러스 titers는 얻을 수 있습니다.
재조합 및 WT 바이러스에 대 한 재고 준비에 바이러스 성 게놈 수 있습니다. 또한 KSHV DNA 수준; 부 량 PCR 뒤 감염 된 세포에서 DNA를 정화 하 여 측정할 수 그러나, 하나는 모든 게놈 전염 성45가정 하지 한다. KSHV 용균성 사이클의 경우, 바이러스 재 활성화에 의해 달성 될 수 있다 재 활성화의 효율성은 낮은23BCBL-1 셀, 위에서 설명한 대로 에이전트 유도와 EC를 자극. 용균성 주기 또한 KSHV transactivator 단백질 ORF5046EC의 변환에 의해 유도 될 수 있다. KS, 자연 스러운 표현과는 안정적인 잠재성 감염11,16의 유지 보수에도 불구 하 고 시간이 지남에 E6/E7 표현 EC 감소 KSHV 용균성 유전자의 화학 유도의 다른 세포 문화 모델 결과와 일치 .
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54828/54828fig1.jpg"> 
그림 1: 모의-의 형태 및 KSHV 감염 적 중요 한 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 (A) 모의 감염 EC monolayers 전시 클래식 자갈 돌 모양입니다. KSHV 유전자의 행동 없이 이러한 셀 변환 되지 않습니다 및 따라서 분할 중단 되며 전시 문화에 합류에 도달 접촉 금지. (B) KSHV에 감염 된 세포, 반면, KS 스핀 들 세포의 연상 길쭉한 "스핀 들 세포" 형태를 개발합니다. 이 패널 5 일에 KSHV에 감염 된 세포의 형태를 보여줍니다 PI 합류에 도달. (C)에 KSHV에 감염 된 세포, 호스트 세포 유전자 발현에 광범위 한 변화 KSHV 감염 세포 통로 없이 교양 쌓이면 세포 변환 이어질. 이러한 조건 하에서 KSHV 감염 세포 확산 도달 셀의 다층된 foci의 개발을 선도 하는 합류 후에 계속. 두이 일 14에 KSHV에 감염 된 세포의 형태를 보여줍니다 PI, 9 일 포스트 합류에 대 한 교양. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54828/54828fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54828/54828fig2.jpg"> 
그림 2: 앵커리지 독립적인 성장. 현상은 세포는 일반적으로 기판, anoikis 라는 프로세스와 접촉의 손실 다음 apoptotic 세포 죽음을 받 다. (A) 때 E6/E7 불리고 모의 감염, EC는 변환 되지 않습니다, 부드러운 천에 식민지를 형성 하지 않는다 그들은 2 주 동안 경작. (B) KSHV 감염 EC는 바이러스 변형, anoikis에 고 소프트 한 천에서 식민지를 형성할 것 이다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54828/54828fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54828/54828fig3.jpg"> 
그림 3: 바이러스 성 단백질 식의 데모. (A) 스핀 들 형태학 KSHV 감염 다음 분명 하다 (40 X 확대). (B) Immunofluorescent (A)에 표시 된 같은 필드의 얼룩에 스핀 들 형태는 표현의 바이러스 대기 시간 단백질 ORF73 (레드)와 관련 된 하는 방법을 보여 줍니다. 감염 된 세포 뿐만 아니라, 바이러스 프로 표현 하는 세포의 작은 백분율에 의해 증명 용균성 바이러스 성 복제를 지원cessivity 요소 (녹색) ORF59입니다. (A와 B 참조26에서 수정) KSHV BAC16 바이러스 (C)에 감염 된 세포의 스핀 들 형태학은 식 GFP (D)의 연관 (20 배 확대). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54828/54828fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi 육 종 (KS) 종양 바이러스 인간 herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV) 감염에 의해 유도 된 종양 이다. 여기에 설명 된 내 피 세포 문화 모델은 공부는 KSHV 호스트 셀 변환 메커니즘 적합 합니다.

공부 하는 Kaposi 육 종 Herpesvirus에 의해 세포 변환에 대 한 생체 외에서 모델

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

8.3K 조회수.  University of Minnesota Medical School. Kaposi 육 종 (KS) 종양 바이러스 인간 herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV) 감염에 의해 유도 된 종양 이다. 여기에 설명 된 내 피 세포 문화 모델은 공부는 KSHV 호스트 셀 변환 메커니즘 적합 합니다.

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Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative tumor of vascular endothelial cells and produces rare B cell lymphoproliferative diseases in the form of pleural effusion lymphomas (PEL) and some forms of multicentric Castleman's disease.3-5 Only 1-5% of cells in KS lesions actively support lytic replication of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), the etiological agent associated with KS, and it is clear that cellular factors must interact with viral factors in the process of oncogenesis and tumor progression.6,7 Identifying novel host-factor determinants which contribute to KS pathology is essential for developing prognostic markers for tumor progression and metastasis as well as for developing novel therapeutics for the treatment of KS.8 The accompanying video details the methods we use to identify host cell gene expression programs altered in dermal microvascular endothelial cells (DMVEC) after KSHV infection and in KS tumor tissue.9 Once dysregulated genes are identified by microarray analysis, changes in protein expression are confirmed by immunoblot and dual labeled immunofluorescence. Changes in transcriptional expression of dysregulated genes are confirmed in vitro by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validation of in vitro findings using archival KS tumor tissue is also performed by dual labeled immunochemistry and tissue microarrays.8,10 Our approach to identifying dysregulated genes in the KS tumor tissue microenvironment will allow the development of in vitro and subsequently in vivo model systems for discovery and evaluation of potential novel therapeutic for the treatment of KS.

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Host cell factors play a critical role in the establishment and maintenance of Kaposi's sarcoma (KS). We outline methods to identify host cell factors altered in KSHV-infected DMVEC cells, and in KS tumor tissue. Cellular genes altered by virus will serve as potential target(s) for novel therapeutics.

Kaposi의 육종 - 관련 Herpesvirus (KSHV)에 의해 유도된 유전자를 식별 Dysregulated

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

연구

면역학 및 감염병학

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

모델 Herpesvirus의 Lytic 복제의 해부 호스트 바이러스 상호 작용

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR&#945;, etc.). We are able to model and study a human-like disease in our mouse model, by transplanting bone marrow cells previously infected with a retrovirus expressing the oncogene of interest. Replication-defective retrovirus encoding a human oncogene and a marker (GFP, RFP, antibiotic resistance gene, etc.) is produced by a transient transfection protocol using 293T cells, a human renal epithelial cell line transformed by the adenovirus E1A gene product. 293 cells have the unusual property of being highly transfectable by calcium phosphate (CaPO4), with up to 50-80% transfection efficiency readily attainable. Here, we co-transfect 293 cells with a retroviral vector expressing the oncogene of interest and a plasmid that expresses the gag-pol-env packaging functions, such as the single-genome packaging constructs kat or pCL, in this case the EcoPak plasmid. The initial transfection is further improved by use of chloroquine. Stocks of ecotropic virus, collected as culture supernatant 48 hrs. post-transfection, can be stored at -80&deg;C and used for infection of cell-lines in view of transformation and in vitro studies, or primary cells such as mouse bone marrow cells, that can then be used for transplant in our mouse model.

This technique demonstrates an efficient way to prepare replication-defective retroviral stocks encoding a human oncogene, and subsequently used for induction of myeloproliferative disease in the mouse model.

293T 세포의 과도 Transfection하여 복제 - 결함이 레트로 바이러스의 생산

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

생물학

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1). Herpes keratitis is currently the leading cause of both cornea-derived and infection-associated blindness in the developed world. Typical presentation of herpes keratitis includes infection of the corneal epithelium and sometimes the deeper corneal stroma and endothelium, leading to such permanent corneal pathologies as scarring, thinning, and opacity 1.
Corneal HSV-1 infection is traditionally studied in two types of experimental models. The in vitro model, in which cultured monolayers of corneal epithelial cells are infected in a Petri dish, offers simplicity, high level of replicability, fast experiments, and relatively low costs. On the other hand, the in vivo model, in which animals such as rabbits or mice are inoculated directly in the cornea, offers a highly sophisticated physiological system, but has higher costs, longer experiments, necessary animal care, and a greater degree of variability. 
In this video article, we provide a detailed demonstration of a new ex vivo model of corneal epithelial HSV-1 infection, which combines the strengths of both the in vitro and the in vivo models. The ex vivo model utilizes intact corneas organotypically maintained in culture and infected with HSV-1. The use of the ex vivo model allows for highly physiologically-based conclusions, yet it is rather inexpensive and requires time commitment comparable to that of the in vitro model.

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

In this video article we describe the use of a new ex vivo model of acute herpes simplex virus type I corneal epithelial infection.

급성 상피 헤르페스의 예 VIVO Organotypic 각막 모델은 바이러스 종류 나 감염을 단순

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1).  Herpes keratitis is currently the leading ...

신경과학

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

인간 유방 상피 세포에 있는 종양원성 변환의 시험관 내 평가

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

암 연구학

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes during initial entry and establishes a primary infection in the epithelium, which is followed by latent infection of neurons. After reactivation, viruses can become evident at mucocutaneous sites that appear as skin vesicles or mucosal ulcers. How HSV-1 invades skin or mucosa and reaches its receptors is poorly understood. To investigate the invasion route of HSV-1 into epidermal tissue at the cellular level, we established an ex vivo infection model of murine epidermis, which represents the site of primary and recurrent infection in skin. The assay includes the preparation of murine skin. The epidermis is separated from the dermis by dispase II treatment. After floating the epidermal sheets on virus-containing medium, the tissue is fixed and infection can be visualized at various times postinfection by staining infected cells with an antibody against the HSV-1 immediate early protein ICP0. ICP0-expressing cells can be observed in the basal keratinocyte layer already at 1.5 hr postinfection. With longer infection times, infected cells are detected in suprabasal layers, indicating that infection is not restricted to the basal keratinocytes, but the virus spreads to other layers in the tissue. Using epidermal sheets of various mouse models, the infection protocol allows determining the involvement of cellular components that contribute to HSV-1 invasion into tissue. In addition, the assay is suitable to test inhibitors in tissue that interfere with the initial entry steps, cell-to-cell spread and virus production. Here, we describe the ex vivo infection protocol in detail and present our results using nectin-1- or HVEM-deficient mice.

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

단순 포진 바이러스 1 형과 쥐 표피의 생체 감염

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

모델링 성상 세포종 병인<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 대뇌 피질의 성상이나 조건, 유전자 조작 쥐에서 신경 줄기 세포를 사용하여

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

KSHV 감염 세포에서 특정 유전자 제품의 시투 혼성화 (FISH) 및 면역 형광 (IF)의 정량형 형광

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

형광 현미경으로 여러 세대 이상 라이브 포유류의 세포에 플라스미드 복제 모니터링

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable model for tracing tumor progression and angiogenesis simultaneously in a visual and sensitive manner. Bioluminescence imaging displays its unique superiority in living imaging due to its advantages of high sensitivity, strong specificity, and accurate measurement. Presented here is a protocol to establish a tumor-bearing mouse model by injecting a Renilla luciferase-labeled murine breast cancer cell line 4T1 into the transgenic mouse with angiogenesis-induced Firefly luciferase expression. This mouse model provides a valuable tool to simultaneously monitor tumor progression and angiogenesis in real-time by dual bioluminescence imaging in a single mouse. This model may be widely applied in anti-tumor drug screening and oncology research.

This protocol describes the establishment of a tumor-bearing mouse model to monitor tumor progression and angiogenesis in real-time by dual bioluminescence imaging.

종양 진행 및 혈관 신생의 이중 생물 발광 이미징

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable ...