저자는 촬영에 도움을 음성 녹음, 그림에 대한 M. Borczyk, 바이러스 생산을위한 A. Trąbczyńska, 유전자형에 대한 M. Ziókowska 및 A. Mirgos에 대한 M. Steczkowski에게 감사의 말씀을 전합니다. KR은 K. Deisseroth에서 CaMK 프로모터의 제어하에 형광 단백질 mCherry을 표현하는 재조합 아데노 관련 바이러스 (rAAV)의 종류 선물을 인정합니다. 이 프로젝트는 유럽 연합 (EU)에 의해 재정 CEPT ​​인프라를 사용하여, 조직의 구조와 기능, 신경 생물학, 실험 생물학의 Nencki 연구소의 센터의 동물 모델 및 연구소의 실험실의 핵심 시설에서 수행 한 - 유럽 지역 개발 기금 내를 2,007에서 2,013 사이의 운영 프로그램 &quot;혁신 경제&quot;. 이 작품은 국립 과학 센터에서 보조금에 의해 지원되었다 : 소나타 비스 2012 / 05 / E / NZ4 / 0299​​6, 하모니아 2013 / 08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013 / 08 / W / KR과 소나타 비스 2014 NZ24 / 00691 / 14 / E / NZ4 / 00172 RC에

아래에 설명 된 모든 실험 절차는 실험 생물학의 Nencki 연구소, 과학 폴란드어 아카데미에서 현지 윤리위원회에 의해 승인되었다. 참고 : 관련 동영상의 장면 중 일부는 가속된다. 속도 계수는이 장면에 표시됩니다. 1. 수술 준비 <ol><li> 오토 클레이브에 액체와 면봉을위한 모든 도구, 유리 용기를 소독. 비용 소비 장갑을 사용합니다. 수술 테이블, 정위 프레임과 70 % 에탄올 모든 주변 지역을 청소합니다. 모든 살균 장비에 대한 멸균 공간을 만들기 위해 무균 수술 패드를 사용합니다. 작은 조각으로 gelfoam을 잘라 및 멸균 식염수를 흡수. 참고 : 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따르면, 에탄올 멸균이나 높은 수준의 소독제도 아니다. 그것은 단지 이전에 멸균 표면 세정 / 탈지 화제로서 사용되어야한다. </li><li> 일에 동물을 넣어전자 유도 챔버 / 분 2 L의 5 % 이소 플루 란 레벨 및 산소의 흐름을 설정한다. 이 절차는 약 3 분 정도 소요됩니다. </li><li> 유도 챔버에서 동물을 가져 가라. 동물이 완전히 진정되었는지 확인하기 위해 꼬리 또는 발가락 핀치를 사용합니다. </li><li> 정밀 트리머가 눈까지 (귀 사이) 머리의 뒤쪽에서 머리를 면도 사용. </li><li> 정위 프레임에 동물을 배치하고 귀 막대 머리를 안정. </li><li> 1.5 %의 이소 플루 란과 0.3 L / 분 산소 마취 수준을 설정합니다. </li><li> 눈 연고를 적용합니다. </li><li> 각각, 염증, 통증 및 감염을 예방하기 Tolfedine (4 ㎎ / ㎏) Butomidor (2 밀리그램 / kg) 및 Baytril (5 ㎎ / ㎏)을 동물에 피하 주입한다. </li><li> 뇌 부종을 방지하기 위해 덱사메타손과 동물의 근육 (0.2 ㎎ / ㎏)을 주입한다. 주 : 덱사메타손 피하 주사 또는 복강 내 근육의 손상을 방지 할 수있다. </li><li> (S)를 이용하여 피부를 닦아Betadine와 terile 면봉은 70 % 에탄올 하였다. </li><li> 장갑을 변경하고 70 % 에탄올로 스프레이. 참고 : 멸균 필드를 터치하지 않는 일회용 장갑을 사용하는 동안. 단지 무균 수술기구 및 멸균 면봉의 팁 동물을 터치합니다. </li></ol> 2. 두개골 창 외과 <ol><li> 집게로 피부를 들어 올려 마이크로 가위가 눈의 앞 지점에 비스듬히 다음 머리의 기본을 따라 수평으로 피부를 절개하고 사용. 피부 플랩을 제거합니다. </li><li> 과도한 출혈과 통증을 방지하기 위해 골막에 멸균 면봉으로 리도카인 연고를 적용합니다. </li><li> 골막을 제거하기 위해 멸균 면봉이나 메스를 사용합니다. 멸균 면봉와 두개골을 건조. </li><li> 멸균 된 바늘을 사용하여 그들을 고정하고 치과 용 시멘트와의 접촉을 방지하기 위해 피부의 가장자리에 밀도 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 적용합니다. 접착제가 마를 때까지 기다립니다. </li><li> t 이상 멸균 3mm의 커브 글라스를하다lambdoid 봉합에 전방 그는 두개골. RSC에서 커버 슬립을 중심 좌표 : AP, 브레 그마 -2.8; ML은 멸균 된 바늘로 두개골 표면을 긁어서 0 표 커버 슬립의 가장자리를 정수리. 70 % 에탄올로 멸균 용기에 다시 커브 글라스를 넣습니다. </li><li> 3mm 직경의 원형 윤곽을 소경으로 버어 고속 치과 드릴을 사용한다. 멸균 식염수에 담근 면봉와 뼈 먼지 드릴링 사이트를 청소합니다. 가끔 출혈을 중지하고 뼈를 청소 gelfoam을하고 면봉을 사용합니다. </li><li> 드릴링 사이에서 부드럽게 뼈 원을 터치하고 이동성을 확인하여 미세 집게로 뼈의 두께를 확인합니다. 뼈 봉합의 지역에 두꺼운 있음을 알아 두셔야합니다. 뼈 원 모바일이며 뼈의에도 얇은 층 주상에 남아있는 경우 드릴링 중지. 식염수 담근 면봉에 남아있는 모든 뼈 먼지의 작동 필드를 청소합니다. </li><li> 드릴 CIR을 포함, 시추 지역에 멸균 생리 식염수를 삭제CLE. 조심스럽게 부드럽게 한 다음 미세 집게와 함께 뼈 원을 올립니다 단단히 위쪽으로 들어 올려 뼈를 제거합니다. 경질의 손상을 방지하기 위해 그것을 해제하는 동안 뼈 원을 왜곡하지 않도록주의하십시오. </li><li> 조심스럽게 출혈을 멈추게하기 위해 경질에 멸균 생리 식염수에 담가 gelfoam을 적용 할 수 있습니다. 모든 출혈이 완전히 중지 될 때까지 기다립니다. 조심스럽게 응고 과정을 방해하지 gelfoam을 제거합니다. 참고 :이 시점에서 출혈이 깊은 것을 입증 할 수 있도록 봉합 영역이 매우 혈관이다. 출혈이 완전히 중지하는 것은 충분한 시간 동안 기다릴 필요하다. 얼음에 배치하여 냉각 식염수 젖은 gelfoam을 유지하는 것이 도움이된다. </li></ol> 3. 바이러스 감염 <ol><li> 정위 타워에 주입 펌프를 부착하고 컨트롤러를 연결합니다. </li><li> 주사기에 35G 바늘을 삽입합니다. 그것을 소독 에탄올로 주사기 10 번 세척 및 멸균 식염수 10 회 전자의 흔적을 제거하는thanol. 주사기에서 공기 방울을 제거합니다. 펌프에 주사기를 삽입합니다. 참고 : 다른 소독제를 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> (10 ~ 12 PFU 권장) rAAV2 / 1 mCherry 준비의 단일 투여 량을 해동 얼음에 보관하십시오. 바이러스 솔루션과 주사기를 입력합니다. </li><li> 브레 그마에 바늘을 중앙에 다음 조심스럽게 다음 좌표를 사용하여 해마에 삽입 : AP -2, ML +/- 1.0, DV -1. 이 좌표는 개두술의 가장자리 근처에 위치한다. 조직 안정화를 위해 5 분 동안 기다립니다. </li><li> 50 NL / 분의 속도로 rAAV2 / 1 mCherry 용액 0.7 μl를 주입한다. 바이러스가 완전히 흡착하는 10 분을 기다립니다. 조심스럽게 바늘을 제거합니다. 출혈이 발생하는 경우 gelfoam을 함께시킨다. 반대측 사이트와 반복합니다. </li></ol> 4. 두개골 창 주입 <ol><li> 드릴 원 프레임의 경질의 상단에 살균, 건조 커브 글라스를 놓습니다. forc와 커브 글라스를 잡고분기 EPS 부드럽게 경질을 평평하고 커브 글라스을 가지고 &#39;두개골 표면에 가까운 가장자리. 참고 : 커브 글라스가 응고와 출혈이 다시 시작을 방해하는 것이 가능하다. 이런 경우, 커브 글라스를 올려 알코올, 건조에 배치 2.9 단계로 복귀. </li><li> 멸균 된 바늘이 커브 글라스 가장자리에 짙은 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 적용 사용하면 두개골에 첨부합니다. 접착제가 마를 때까지 기다립니다. </li><li> 두개골의 앞 부분에있는 고정 바 (M2 너트 또는 사용자 정의 만든 디자인)을 놓습니다. 바의 가장자리에 걸쳐 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 적용합니다. 접착제가 마를 때까지 기다립니다. <ol><li> 세션 이미징 동안 두개골 윈도우의 수평 위치를 사용하는 위치에 고정 줄​​을 놓습니다. 창에서 가능한 한 멀리 떨어져 배치합니다. 이 윈도우에 너무 가깝게 배치되는 경우, 맞춤형 홀더를 연결 바 나사 촬상 과정 대물위한 걸림돌 포즈 것이다. </li></ol></li><l난&gt; 치과 아크릴을 준비하고 유리 주위의 두개골 표면에 적용됩니다. 이 창 주위 분화구 형상을 형성하는 것이 도움이된다. 그것은 물 목적으로 이미징 나중에 적용 물 공동을 생성합니다. </li><li> 두개골 창 주위의 분화구를 강화, 운영 영역, 피부 가장자리, 고정 줄​​의 나머지 부분을 덮고, 치과 아크릴과 모자를 만듭니다. 치과 시멘트가 경화 될 때까지 기다립니다. </li><li> 정위 프레임에서 동물을 제거하고 회수 챔버에 넣어. </li><li> 생리 기능을 관찰하면서 동물이 수술에서 회복까지 기다립니다. </li><li> 48 시간 동안 수술 후 진통제 (카프로 펜, 10 ㎎ / ㎏) 및 항생제 치료 (baytril, 5 ㎎ / ㎏)을 적용합니다. </li></ol> 5. 이미지 <ol><li> 전원을 현미경, 사파이어 레이저 : 티를 시작합니다. 이 실험에 사용 된 시스템은 두 개의 광자 레이저, OPO 시스템과 이중 하나로 이루어질의 PMT를 구비한다. </li><li> induc에서 동물을 넣어기 챔버 마취를 유도한다. </li><li> 현미경 가스 마취 마스크 유도 챔버와 장소에서 동물을 제거합니다. 0.3 L / 분의 산소 유량과 1.5 %의 이소 플루 란 농도를 감소시킨다. </li><li> M2 나사 (또는 다른 사용자 정의 시스템)와 사용자 정의 현미경 프레임에 동물을 고정합니다. 두개골 창을 수준. 주 : 특정 맞춤 프레임 나은 결과 (개선 된 헤드 안정성 만성 실험 기간 동안 다수의 세션에서 일정한 위치)를 제공하지만 현미경 제조업체 헤드 고정 시스템을 사용하는 것이 가능하다. </li><li> retrosplenial 피질의 측면 중 하나에 위드 현미경 설정 및 낮은 배율 목표 중심 뷰를 사용하고, 커버 슬립의 표면에 초점을 맞 춥니 다. </li><li> 분화구 모양의 아크릴 우물에 물 방울을 적용합니다. 장거리 침수 목표로 전환합니다. 물 메 니스 커스 콘 때까지 두개골 창으로 목표를 이동시편과 목표를 nects. </li><li> 두 광자 설정으로 전환하고 가장 낮은 줌을 사용하여 바닥에 시편 위로를 스캔 시작합니다. 뇌경막의 교차점 높은 비 특정 신호의 섬광으로 볼 수 있습니다. </li><li> 전체 동적 범위를 커버하기 위해 형광 세포에서의 신호 강도에 따라 두 채널 (GFP 및 mCherry)의 현미경 취득 설정을 조정한다. </li><li> (다른 세포로부터 분리 된 수지상 나무) 적절한 신경을 찾은 후 가장 낮은 줌과 5 미크론의 Z-거리 만 GFP의 filterset를 사용하여 초기 검사를 수행합니다. </li><li> 스캔 한 스택의 최대 투사를 구하여 (반전 색상을 사용하여) 주석을 위해 그것을 인쇄 할 수 있습니다. </li><li> 원하는 형태 세부 이미지에 수의 값으로 줌을 설정합니다. 이미지 기준으로 최대 투사를 사용하여 GFP 및 mCherry 채널의 전체 수지상 나무. </li></ol>

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저자 (KL, MR, KR)은 특허에 대한 권리를이 조에서 사용되는 홀더 프레임 (PL410001을) 보류가 있습니다.

현재 논문에서 우리는 두개골 창을 통해 RSC에서 시냅스 입력과 시냅스 대상의 생체 내 이미징에서 동시에 두 광자를위한 프로토콜을 제시한다. 주입 절차는 몇 가지 주요 단계로 구성되어 있습니다. 첫째, 동물 깊이 마취 및 정위 프레임에 고정되어, 다음 RSC를 통해 두개골이 표시된 원형 라인을 따라 드릴 원형 뼈를 제거하여 얇게된다. 출혈이 중지되면 rAAV2 / 1 mCherry는 해마에 주입하고, 커버 유리 천공 영역 위에 두개골에 고정된다. 마지막 고정 막대가 헤드에 고정되며, 동물은 48 시간 동안 회수 챔버에 배치된다. 약 2~3주 바이러스 발현에 필요한 후, RSC는 가시화 될 수있다. 촬상 프로토콜은 다음과 같은 단계를 포함한다. 첫째, 동물은 마취 현미경으로 고정된다. 다음 위드 현미경을 사용하여 설정되어 초점 시스템이다 SWI이광자 모드 tched 관심있는 채널 (GFP 및 mCherry)이 가시화된다. 발표 기술은 앞에서 설명한 프로토콜을 통해 주요 개선을 제공합니다. 표준 방법에서, 라벨의 한 종류가 검출 될 수있다. 그것은 이미지 지역 축삭 돌기 및 수지상 나무에 사용될 수 있지만 장거리 연결을 연구 할 수 없었다. 두 형광 단백질을 결합함으로써 우리는 사전 및 시냅스 요소를 동시에 추적 할 수있었습니다. 이 추정 시냅스 연결의 생체 모니터링에서 장기를 할 수 있습니다. 설명 된 절차에 최적의 결과를 얻기 위해서는, 여러 중요 단계에 주목하는 것이 중요하다. 염증의 원인과 두개골 윈도우의 투명성을 손상시킬 수 단계 2.8에서 경질에 손상을 뼈 원을 해제하는 동안. 단계 2.9 또는 절차의 다른 단계에서의 출혈 부족 정지 혈액 accumulat 초래창 아래 이온 크게 시야를 감소시킨다. 바이러스를 주입 한 후에는 주사 부위에서 조직 내로 주입하는 바이러스 위해 바늘을 제거하기 전에 적어도 10 분 동안 기다리는 것이 중요하다. 이 바늘 제거시 바이러스의 외피 불필요한 감염의 가능성을 제한한다. 바이러스 성 형질의 영역은 뇌 조직의 사후 조직 학적 분석을 조사해야한다. 니들 트레이스를 따라 임의의 셀 mCherry 발현은 피해야한다. 표준 복구 시간 3 주입니다. 바이러스가 시냅스 돌기 안정 표현에 도달하고 두개골 윈도우 완전히 치유와 안정을 위해이 기간은 충분하다. 동물은 단일 케이지 메이트로 두개 창 임플란트의 제거를 방지하기 위해 보관되어야한다. 확대 케이지의 사용은 금속 바아를 쳐서 두개 창 우연한 손상을 방지하기 위해 고려 될 수있다. 양해 각서 (MOU)의 안정적 정착현미경 자체는 필수적이다. 호흡 운동을 포함한 모든 머리의 움직임은, 얻어진 이미지의 품질에 상당한 감소의 원인이 될 수 있습니다. 또한, 대물 수평 두개 창을 배치 윈도우의 전체면에 대해 동일한 포커스를 취득 가능 문제를 제한하는 것도 유용하다. 해결 등뼈와 튼스에 대한 명확한 기준이 적용되어야한다. 일반적 튼스은 선행 섬유 7보다 적어도 3 배 더 큰 직경의 축삭 부종으로 정의된다. 등뼈는 주먹코 머리를 포함하는 수지상 축에서 명확하게 구별 돌출부로 정의됩니다. 얇고, 짧고, 버섯, 분기 쪽의 인구에 또한 부문은 3 수있다. 인해 이광자 현미경 비교적 불량한 축 해상도, 광축을 따라 돌출 쪽의 분석은 3을 피해야한다. 분명히 사후 immunolabeling 기능 튼스 및 등뼈를 구별하기 위해,사전 및 시냅스 마커 7을 식별하기 위해 수행 될 수있다. 제시된 프로토콜은 우리의 실험의 설계에서 가장 유리한 것으로 입증되었지만, 상이한 실험 목적에 맞게하기 위해 수정할 수있다. 때로는 대신 이소 플루 란의 (예 케타민-xylasine 등) 주사 마취를 사용하는 것이 더 적합하지만, 적절히 다른 균주, 나이 및 성별 생쥐 사이 약물 감수성에 유의 차에두고 용량을 조절하는 것이 중요하다. 이 버 대신 드릴링 구면 하나 책략가를 사용할 수 있지만, 경질의 손상의 위험을 증가시킬 수있다. 멸균 식염수 성공적 인공 뇌척수액 (ACSF)로 대체하지만, 제조 및 동작 동안 항상 살균을 유지하는 것이 중요 할 수있다. ACSF는 준비 후 3-4주 안정이고, 어떤 오염이 시간 이전에 발생하는 경우 즉시 폐기해야합니다. 다른 머리 fixati기기 이광자 현미경 웨이크 마우스를 관찰 할 가능성을 포함하여, 실험 설계에 따라 적용될 수있다. 다른 방법으로,이 또한 한계가있다. 이광자 현미경 경질 표면으로부터 500 ㎛의 깊이에 뇌 조직의 시각화를위한 최대 허용한다. 깊은 뇌 구조의 검사에 대한 추가 수정을 적용해야합니다. 우리 프로토콜 RSC 점유율에 접근 할 수 있지만, 우수한 시상 동 아래 숨겨진 구조의 일부가 여전히 액세스 할 수 없습니다. 이광자 현미경의 분해능은 특정 시냅스의 식별뿐만 아니라 돌기 쪽의 상세한 형태 학적 분석을 위해 충분하지 않다. 이러한 상호 전자 현미경과 같은 추가 방법은 의심 구조의 존재를 확인하기 위해 적용되어야한다. 비교적 어려운 수술 기법이라고 언급하는 것이 중요하며 RECO 아니다미경 운영자 mmended. 제시된 기법은 실험의 넓은 범위에서 적용 할 수있다. 이것은 이광자 현미경 액세스 다른 뇌 영역의 조사를 위해 변형 될 수있다. 그것은 생리 학적 및 병리학 적 상태인지 과정을 포함하고 노화 또는 신경 및 정신 상태의 진행의 다양한 동안 축삭과 수상 돌기 변경을 동시에 모니터링 할 수 있습니다. 그것은 정확하게 정의의 연결 부분 집합에서 발생하는 예측을 시각화하는 세포 특이 적 프로모터의 사용을 할 수 있습니다. 또한, 깨어 동물 행동 실험 프로토콜에 맞게 조정될 수있다. 또한, 칼슘 또는 pH- 민감성 단백질뿐만 아니라 신경 세포 형태를 가시화하기 위해 뇌에서 발현 될 수 있지만, 또한 세포 활성 및 기능의 변화. 방법의 다른 가능한 변형 mCherry 발현 다른 rAAV 혈청의 사용이다. 키메라 2/1 혈청 형 홍보ovides 충분히 빠른 시작 (2-3 주)와 주사 부위에서 강력한 식입니다. mCherry 수준은 초기 발병 후 최소 12 주 동안 안정적으로 유지하고 더 역행 라벨은 우리의 실험에서 검출되지 않았다. 역행 표시를 얻기 위해, 상이한 혈청 형은 예 rAAV9로서 사용될 수있다. 촬상 세션은 적어도 24 시간의 간격을 마취 후 동물의 적절한 회복을 허용하기 위해 권장하지만에서 임의의 주파수에서 수행 될 수있다. 적절하게 적용하는 경우,이 기술은 수 개월에 걸쳐 동일 영역의 복수의 촬상 세션을 수행 할 수 있습니다. 장기간 실험 (6 개월 이상)의 경우, Cre 호텔 /에 loxP 시스템 floxed GFP 마우스 라인에 AAV 벡터로 전달되는 재조합 효소와 함께 사용할 수있다.

이광자 현미경 살고 동물 행동에서 뇌 활동의 관찰 혁명. 1990 년 출시 이후 빠르게 인기를 얻고 지금은 생체 내 1,2에서 뇌 활동의 다양한 측면의 검토를 향해 가장 흥미롭고 혁신적인 접근 방법의 하나로서 구현된다. 이러한 애플리케이션 및 신경 세포의 형태 (칼슘 수준 지표 또는 즉각적인 초기 유전자의 발현을 사용하여, 예), 혈류 측정, 신경 활성을 포함한다. 실험실의 증가는 생체 뇌 영상을위한 새로운 표준으로 과학 세계 기술을 구현, 두 광자 현미경을 사용합니다. 표준 접근법은 뇌 창 주입 배럴 또는 마우스 뇌의 시각 피질 3 이상 (커버 유리 피복 두개의 원형 구멍)를 포함한다. 다음으로, 실험 프로토콜에 따라 각서SE 시간 걸쳐 4,5- 뇌 신경 활성 및 형태의 변화를 모니터링 할 수 있도록 시각화 행동 훈련 일련 겪는다. 두 경우 모두 개두술은 봉합을 횡단하지 않고 정수리 뼈에 영향을 미친다. 주로 기술의 주요 단점은 배럴 또는 시각 피질로 쉽게 접근 대뇌 피질에 제한된 응용 프로그램입니다 것으로 생각된다. 다른 지역에 걸쳐 두개골 창 주입으로 인해 과도한 출혈 및 / 또는 공간 방해로 어려움을 많이 포즈. 본 논문에서는 생체 현미경 (6)의 두 광자에 대한 관심의 또 다른 가능한 영역과 retrosplenial 피질 (RSC) 위의 두개골 윈도우의 주입을 제안한다. RSC는 공간 기억 형성을 담당 뇌 회로의 중요한 소자이다. 해부학, RSC는 대뇌 피질, 해마, 시상 영역 (7)를 연결하는 신경 네트워크의 일부입니다. 그것은이다주로 이러한 공간 학습 및 소등과 탐색 공간 (6)과 같은 행동의 범위에 포함했다. 신경 세포의 형태 학적 변화를 시각화하기 위해 우리는 thy1 발기인에서 녹색 형광 단백질 (GFP)를 발현하는 형질 전환 마우스 라인을 사용합니다. 이러한 쥐, GFP는 이광자 현미경 8을 사용 피질 축삭 돌기 명확한 시각화를 허용 뇌 신경 세포의 약 10 %에서 발현된다. 우리가 제안하는 또 다른 혁신은 RSC로 돌출 된 뇌의 깊은 구조로 신경 세포 특이 camkii 프로모터 (9)에서 적색 형광 단백질 (mCherry)를 코딩하는 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청 형 2/1 (/ 1 rAAV2)의 주입입니다 해마 등. Thy1-GFP 마우스의 해마에서 rAAV2 / 1 mCherry의 발현은 hippocampo-cortica의 사전 및 시냅스 요소를 동시에 시각화 할 수 있습니다난 10 시냅스. 단백질이 축삭 터미널에 충분한 수준에 도달 할 mCherry의 rAAV 중심의 표현은 2~3주이 필요합니다. 이 기간은 개두술 회복에 필요한 통상의 시간과 일치한다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Drug&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>5-2% pre-operative</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>1.5-2% during surgery</td></tr><tr><td>Dexametasone</td><td>Scan Vet</td><td>Dexasone 2mg/ml</td><td>0.2 mg/kg intramuscular</td></tr><tr><td>Baytril</td><td>Bayer</td><td>2.50%</td><td>5 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Tolfedine</td><td>Vetoquinol</td><td>4%</td><td>4 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Butomidor</td><td>Richter Pharma</td><td>10 mg/ml</td><td>2 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>KRKA-Polska</td><td>Rycarfa 50mg/ml</td><td>10 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>Jelfa</td><td>Lignocainum</td><td>topically</td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>Jelfa</td><td>20 mg/g</td><td>topically</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Surgery&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Ethicon</td><td>Spongostan dental; REF MS0005</td><td></td></tr><tr><td>Eye ointment</td><td>Dedra</td><td>Lubrithal</td><td>topically</td></tr><tr><td>CA glue</td><td>Pelikan Daniel</td><td>20G Huste</td><td></td></tr><tr><td>Dental acrylic</td><td>SpofaDental</td><td>Duracryl Plus</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic frame</td><td>Stoelting</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tool&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverglass</td><td>Harvard Apparatus</td><td>HSE-64-0720</td><td>3 mm diameter</td></tr><tr><td>Dental drill</td><td>Sigmed</td><td>Keystone KVet</td><td></td></tr><tr><td>Fixation bar</td><td>Custom made</td><td>N/A</td><td>M2 or M3 screw nuts could be used</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Renex</td><td>PN-7B-SA</td><td></td></tr><tr><td>Micro scissors</td><td>Falcon</td><td>BM.183.180</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>KOZO</td><td>XTL6445T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Imaging&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Holder frame</td><td>Custom made</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Two-photon microscope</td><td>Zeiss</td><td>Upright Axio Examiner Z1</td><td>Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Virus</td><td>gift from K. Deisseroth</td><td></td><td>Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter</td></tr></tbody></table>

simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Thy1-GFP 기자 마우스에서 신경 세포의 일부에서 GFP의 발현은 대뇌 피질의 수상 돌기 및 RSC에서 지역 축삭 돌기의 생체 내 이미징에 있습니다. 그림 1a는 눈에 보이는 여러 GFP 양성 수상 돌기 이미지의 스택의 최대 투사를 보여줍니다. 세포체는 동맥에 의해 가려한다.도 1b는도 1a에 표시된 수지상 분기의 단일면 확대 이미지 (디지털 줌 3 배)를 보여줍니다. 수지상 형태 (쪽, filopodia)의 세부 사항은 명확하게 볼 수 있습니다. GFP 채널 대역 방출 500-550 nm의 필터를 사용하여 획득된다. 지느러미 해마에 rAAV2 / 1 mCherry의 주입은 RSC에 종료 해마 축삭과 시냅스 부 튼스의 시각화 할 수 있습니다. 이러한 단자 mCherry 채널 (대역 방출 570-610 nm의 필터)로 검출 할 수있다. 그림 1. RSC 신경과 RSC에 해마 돌기의 생체 내 두 광자 영상에서 두 채널입니다. (A) RSC의 단편 (반전 된 색상에 표시된 이미지)에서 GFP 발현 세포의 개요. 낮은 배율 (0.7 배 디지털 줌)에서 찍은 100 μm의 두께 스택의 도시 최대 투영합니다. GFP 채널에서 높은 배율 (배 디지털 줌)에서 취득한 (B) (A)에 나타낸 단편의 단일 광학면. mCherry 취득 설정을 사용하여 (C) (A)에 나타낸 싱글 광학면 단편. 검출 필터에 대한 자세한 내용은 프로토콜을 참조하십시오. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53528/53528fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

simultaneous-two-photon-vivo-imaging-synaptic-inputs-postsynaptic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

11.4K 조회수.  Nencki Institute of Experimental Biology. This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

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Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

특정 기능 내장 신호를 결합하여 네크로의 마이크로 도메인과 투 광자 영상에서 뉴런의 대상 라벨링

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

연구

신경과학

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

살아있는 마우스에 있는 등도 해마 CA1의 세로 2 광자 화상 진찰

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

행동분석학

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Thy1를 사용 하 여 기본 Somatosensory 피 질에서 신경 활동을 이미징-GCaMP6s 유전자 변형 쥐

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

마우스 뇌 슬라이스에 장거리 입력의 광유전학 자극을 위한 Vivo intracerebral 입체 전착성 주사

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

경동공 이광자 마우스 망막의 생체 내 이미징

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

<a href='https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61970/transpupillary-two-photon-in-vivo-imaging-of-the-mouse-retina'>Source: Wang, Z., et al.&#160;Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp.&#160;(2021).</a>This video demonstrates a technique for in vivo retinal imaging using two-photon microscopy. Anesthetized mice are prepared for imaging by securing their heads, Applying eye lubricant, and placing a coverslip over the eye. Retinal ganglion cells (RGCs) expressing fluorescent proteins are first visualized using epifluorescence for alignment. Finally, two-photon imaging is employed, allowing for high-resolution visualization of RGCs.

Source: Wang, Z., et al.&#160;Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp.&#160;(2021).This video demonstrates a technique ...

동시에 두 광자

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