Name: simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex
Uploaded: 2016-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות מ Steczkowski להקלטות קול, מ Borczyk עבור ציורים, א Trąbczyńska לייצור וירוס, מ Ziókowska עבור genotyping וא Mirgos לסיוע בעבודת המצלמה. KR מכיר מתנה סוג של וירוס adeno הקשורים רקומביננטי (rAAV) המבטאים חלבון פלואורסצנטי mCherry בשליטת היזם CaMK מ ק דייזרות. פרויקט זה בוצע במתקני הגרעין של מעבדה של מודלים בבעלי חיים המעבדה של מבנה רקמות ותפקוד, מרכז לנוירוביולוגיה, Nencki המכון לביולוגיה ניסויית, עם השימוש בתשתית CEPT במימון האיחוד האירופי - קרן האירופית לפיתוח אזורי בתוך התכנית התפעולית &quot;כלכלה חדשנית&quot; עבור 2007-2013. עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של הלאומית למדע מרכז: סונטה Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02,996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00,861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00,691 ל KR וסונטה Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 RC

כל הפרוצדורות המתוארות להלן אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית במכון Nencki לביולוגיה ניסויית, פולנית האקדמיה הלאומית למדעים. הערה: החלק מן הקלעים של הווידאו הקשור מואץ. גורם מהירות מותווה בסצנות אלה. 1. ניתוח הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את כל הכלים, מיכלי זכוכית עבור נוזלים צמר גפן ב החיטוי. יש להשתמש בכפפות אפשר לוותר עליהן. נקו את שולחן הניתוחים, מסגרת stereotaxic וכל האזור שמסביב עם אתנול 70%. השתמש כרית כירורגית סטרילית ליצור מרחב סטרילי עבור כל הציוד המעוקר. חותכים gelfoam לחתיכות קטנות להשרות אותם מלח סטרילית. הערה: על פי המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה, אתנול אינו מהווה sterilant ולא חיטוי ברמה גבוהה. זה אמור לשמש רק כסוכן ניקוי / defatting על משטחים מעוקרים בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את החיה הדואר בתא האינדוקציה ולהגדיר את רמת isoflurane עד 5% ו זרימת חמצן 2 ליטר / דקה. הליך זה צריך לקחת כ -3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את החיה מתוך חדר האינדוקציה. השתמש צובט זנב או הבוהן על מנת להבטיח כי בעל החיים הוא מסומם לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש גוזם מדויק לגלח את השיער מהחלק האחורי של הראש (בין האוזניים) עד העיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את החיה בתוך מסגרת stereotaxic ולייצב את הראש עם ברי אוזניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיוון דרגת הרדמה isoflurane 1.5-2% ו -0.3 ליטר / דקה חמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל את משחת עיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את תת עורי חיה עם Tolfedine (4 מ&quot;ג / ק&quot;ג), Butomidor (2 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ו Baytril (5 מ&quot;ג / ק&quot;ג) כדי למנוע דלקת, כאב וזיהום, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את לשריר חיה עם Dexamethasone (0.2 מ&quot;ג / ק&quot;ג) כדי למנוע נפיחות במוח. הערה: אפשר להזריק תת עורי Dexamethasone או intraperitoneally למנוע נזק לשרירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את העור באמצעות sצמר גפן terile בבטאדין ואחריו אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את הכפפות ולרסס אותם עם אתנול 70%. הערה: בעת שימוש בכפפות חד פעמיות אין לגעת שדה סטרילי. גע החיה היחידה בקצות מכשירי ניתוח סטרילי ספוגיות סטרילי. </li></ol> כירורגיה 2. חלון גולגולתי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את העור עם מלקחיים באמצעות מספרי מייקרו לחתוך את העור בצורה אופקית לאורך בבסיס הראש ולאחר מכן באלכסון עד לנקודת החזית בין העיניים. הסר את דש העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל משחה לידוקאין עם ספוגית סטרילית על קרום העצם כדי למנוע דימום וכאב מוגזם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש צמר גפן סטרילי או אזמל כדי להסיר את קרום העצם. לייבש את הגולגולת עם צמר סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט סטרילית להחיל דבק cyanoacrylate צפוף על קצות העור לשתק אותם ולמנוע ממגע במלט שיניים. חכו הדבק להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נח coverglass 3 מ&quot;מ סטרילית על tהוא גולגולת קדמית אל תפר lambdoid. מרכז את coverslip ב RSC קואורדינטות: AP, גבחת -2.8; ML, גבחת 0. סמן את הקצוות coverslip ידי מגרד את פני הגולגולת עם מחט סטרילית. שים את coverglass בחזרה לתוך המיכל סטרילית עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מקדח שיניים במהירות גבוהה עם בר קוטר קטן לשרטט מעגל בקוטר 3 מ&quot;מ. נקה את הקידוח מעפר העצם עם מטליות טבולות תמיסת מלח סטרילית. השתמש gelfoam ו מטליות כדי לעצור את הדימום מדי פעם ולנקות את העצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין לבין הקידוח לבדוק את עובי העצם עם מלקחיים בסדר על ידי נגיעת מעגל העצם בעדינות ובדיקת הניידות שלה. זכור כי העצם עבה על האזור של התפר. עצור את הקידוח כאשר מעגל העצם הוא נייד ורק בשכבה אחידה, דקה של עצם נשארת על ההיקף. נקה את השדה התפעולי של כל אבק העצם הנותרים עם מטליות טבלו מלוחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרוק את תמיסת מלח סטרילית על אזור הקידוח, המכסה את CIR קדחCLE. בזהירות לחטט מעגל העצם עם מלקחיים בסדר ואז בעדינות אך בתקיפות להסיר את העצם על ידי הרמתו כלפי מעלה. היזהר שלא להטות את מעגל העצם כשאני מרים אותה כדי למנוע נזק אפשרי הדורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להחיל את gelfoam ספוגה תמיסת מלח סטרילית על הדורה כדי לעזור לעצור את הדימום. חכו עד שכל הדימום נעצר לחלוטין. מוציאים בזהירות את gelfoam לא להפריע בתהליך הקרישה. הערה: אזור התפר הוא vascularized מאוד, כך את הדימום בנקודה זו עלולה להתברר עמוק. זה חיוני כדי לחכות מספיק זמן הדימום להפסיק לחלוטין. זה עוזר לשמור על gelfoam המלוח ספוג מקורר על ידי הצבתו על קרח. </li></ol> 3. הזרקת וירוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף משאבת עירוי למגדל stereotactic ולחבר את הבקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את מחט 35G לתוך המזרק. שטוף את המזרק 10 פעמים עם אתנול לעקר אותו 10 פעמים עם תמיסת מלח סטרילית כדי להסיר עקבות של דוארthanol. הסר בועות אוויר מן המזרק. הכנס את המזרק לתוך המשאבה. הערה: יש לשקול שימוש בחומרי חיטוי אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר מנה בודדת של הכנה מרמת rAAV2 / 1 mCherry (10 12 pfu מומלץ) ולשמור אותו על קרח. מלאו את המזרק עם פתרון וירוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכז את המחט על גבחת ואז בעדינות להכניס לתוך ההיפוקמפוס באמצעות הקואורדינטות הבאות: AP -2, ML +/- 1.0, DV -1. נקודות ציון אלה יהיו ממוקמים ליד קץ craniotomy. מתן 5 דקות עבור הרקמות לייצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 0.7 μl של פתרון mCherry מרמת rAAV2 / 1 בשיעור של 50 nl / min. חכה 10 דקות עבור הווירוס לספוג באופן מלא. הוצא בעדינות את המחט. כתם עם gelfoam אם הדימום מתרחש. חזור עם האתר הנגדי. </li></ol> 4. גולגולתי חלון השרשה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את coverglass סטרילי, מיובשים על גבי הדורה בפריים מעגל קדח. החזק את coverglass עם forceps לשטח ההדור בעדינות ולהביא coverglass &#39;קצוות קרובים לפני שטח הגולגולת. הערה: יתכן כי coverglass משבש את הקריש ואת קורות חיים הדימום. אם זה המקרה, להרים את coverglass, למקם אותו באלכוהול, יבש ולחזור לשלב 2.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט סטרילית להחיל את דבק cyanoacrylate צפוף בשולי coverglass לצרף אותם אל הגולגולת. חכו הדבק להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בר קיבעון (אגוז M2 או עיצוב בהתאמה אישית) בחלק הקדמי של הגולגולת. החל את דבק cyanoacrylate על הקצוות של הבר. חכו הדבק להתייבש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את בר קיבעון בעמדה שתאפשר מיקום האופקי של החלון גולגולתי במהלך ההדמיה הפגישה. מניח אותו כמו רחוק ככל האפשר מן החלון. אם היא ממוקמת קרוב מדי אל החלון, הבר ואת הבורג חיבורו עם בעל מחוייט עלול להוות מכשול עבור המטרה במהלך תהליך ההדמיה. </li></ol></li><li&gt; הכן את אקריליק שיניים ולהחיל אותו על פני הגולגולת מסביב לכוס. זה מועיל כדי ליצור צורת מכתש דמוי סביב החלון. זה ייצור חלל עבור מים מיושמים מאוחר הדמיה במטרת המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור כובע עם אקריליק השיניים, המכסה את שאר השטח המבצעי, קצות עור, בר קיבעון, חיזוק המכתש סביב החלון גולגולתי. חכה מלט השיניים להתקשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החיה מן המסגרת stereotaxic והכניס אותו לחדר התאוששות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכו החיה להתאושש מהניתוח תוך שמירה על תפקודים פיזיולוגיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל שיכוך כאבים שלאחר הניתוח (carprofen, 10 מ&quot;ג / ק&quot;ג) וטיפול אנטיביוטי (Baytril, 5 מ&quot;ג / ק&quot;ג) במשך 48 שעות. </li></ol> הדמיה 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את טי: ספיר לייזר, כוח את המיקרוסקופ. המערכת השתמשה בניסוי זה מצוידת ליזר שני פוטונים, מערכת OPO ו PMT Gaasp הכפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את החיה inducתא tion ולגרום הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החיה מן חדר האינדוקציה ומכניס את מסכת גז ההרדמה מתחת למיקרוסקופ. להקטין את זרימת החמצן 0.3 L / min ואת ריכוז isoflurane ל 1.5-2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן החיה למסגרת מיקרוסקופ המותאם אישית עם בורג M2 (או אחר מערכת מותאמת אישית). אזנו את החלון גולגולתי. הערה: אפשר להשתמש במערכת קיבוע הראש של מיקרוסקופ היצרן, למרות המסגרת המותאמת אישית המסוימת נותנת תוצאות טובות יותר (יציבות ראש משופרת, מיצוב קבוע בפגישות מרובות במהלך ניסוי כרוני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בהגדרות מיקרוסקופ widefield ומרכז המטרה בהגדלה נמוכה הנוף על אחד הצדדים של קליפת retrosplenial ולהתמקד אותו על פני השטח coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל טיפה של מים לתוך הבאר אקריליק דמוי מכתש. Switch to טבילה אובייקטיבי מים למרחקים ארוכים. הזז את המטרה לעבר החלון גולגולתי עד con המניסקוס מיםnects הדגימה ואובייקטיבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור להגדרות שני הפוטונים ולהתחיל סריקה העליון הדגימה למטה באמצעות זום הנמוך ביותר. המעבר של דורה מאטר יהיה גלוי כמו בוהק של אות גבוהה שאינו ספציפית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הגדרות הרכישה מיקרוסקופ בשני הערוצים (GFP ו mCherry) על פי עוצמת האות מתאי ניאון כדי לכסות את הטווח הדינמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מציאת נוירון מתאים (עם העץ הדנדריטי להפריד תאים אחרים) לבצע סריקה ראשונית רק באמצעות GFP filterset עם זום z למרחקים הנמוך של 5 מיקרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג השלכה מרבית של ערימת סרוקים ולהדפיס אותו על הערות (באמצעות צבעים הפוכים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדר זום לערך שיאפשר לתדמית פרטי מורפולוגיים הרצויים. תמונת העץ הדנדריטי כולו בערוצי GFP ו mCherry באמצעות הקרנה מרבית כמדריך. </li></ol>

<ol>
	<li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neocortical+neurons+through+a+chronic+cranial+window.">Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).</li><li>Chow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+and+compartmental+regulation+of+dendritic+growth+in+mature+cortex.">Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex.</a> Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).</li><li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+and+storage+of+spatial+information+in+the+retrosplenial+cortex.">Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).</li><li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superficially+projecting+principal+neurons+in+layer+V+of+medial+entorhinal+cortex+in+the+rat+receive+excitatory+retrosplenial+input.">Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input.</a> J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Couey, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+inhibitory+circuitry+as+a+mechanism+for+grid+formation.">Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation.</a> Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).</li><li>Miyashita, T., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+projections+from+the+hippocampus+to+the+retrosplenial+cortex+in+the+rat.">GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat.</a> European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).</li></ol>

המחברים (KL, MR, KR) יש זכויות פטנט (PL410001) עבור מסגרת מחזיק בסעיף זה.

במאמר הנוכחי אנו מציגים פרוטוקול עבור שני הפוטונים סימולטני in vivo הדמיה של תשומות הסינפטי מטרות postsynaptic ב RSC דרך חלון גולגולתי. הליך ההשתלה להשתרע על פני כמה שלבים עיקריים. ראשית, החיה בהרדמה עמוקה וקבוע בפריים stereotactic, אז הגולגולת מעל RSC היא דלילה עם מקדחה בנוסח החוזר המסומן ואת העצם העגול מוסר. לאחר דימום פסק, mCherry מרמת rAAV2 / 1 מוזרקת לתוך ההיפוקמפוס, וכן מכסה זכוכית מקובע הגולגולת מעל אזור הקדח. לבסוף לבר הקיבעון מאובטח על ראש החיה מושמת בתא ההתאוששות במשך 48 שעות. לאחר כ 2-3 שבועות דרושים ביטוי הווירוס, ניתן דמיין והוב&quot;א. פרוטוקול ההדמיה כולל את השלבים הבאים. ראשית, החיה הוא מורדם קבוע תחת המיקרוסקופ. הפוקוס ואז להגדיר באמצעות מיקרוסקופ widefield, המערכת היא switched למצב שני הפוטונים ואת ערוצי עניין (GFP ו mCherry) הם דמיינו. הטכניקה הציגה מציעה שיפור גדול על פני הפרוטוקולים שתוארו קודם לכן. בגישה הסטנדרטית, רק סוג אחד של תווית ניתן היה לזהות. זה יכול לשמש כדי תחזיות axonal מקומי תמונה ועצים הדנדריטים, אבל אין מחקרי קישוריות לטווח ארוך היו אפשריים. על ידי שילוב של שני חלבוני ניאון אפשרנו מעקב סימולטני של אלמנטים טרום postsynaptic. זה מאפשר לטווח ארוך ניטור vivo של קשרים סינפטיים משוערים. על מנת להשיג את התוצאות הטובות ביותר של ההליך המתואר, חשוב לשים לב לכמה שלבים קריטיים. במהלך הרמת מעגל העצם בשלב 2.8 נזק הדורה עלול לגרום לדלקת ולפגוע השקיפות של החלון גולגולתי. הפסקה מספקת של דימום בשלב 2.9 או בכל שלב אחר של הליך התוצאה וצבור דםיון מתחת לחלון מפחית באופן משמעותי את שדה הראייה. לאחר הזרקת הווירוס הוא חיוני לחכות לפחות 10 דקות לפני הסרת המחט, על מנת הווירוס להחדיר לתוך הרקמה באזור הזריקה בלבד. זה מגביל את האפשרות של זיהום הרצוי של הקליפה בווירוס במהלך הסרת מחט. האזור של transfection ויראלי יש לבחון עם ניתוח היסטולוגית פוסט הוק של רקמת המוח. כל ביטוי mCherry בתאים לאורך עקבות מחט יש להימנע. זמן ההחלמה הסטנדרטי הוא 3 שבועות. תקופה זו היא מספקת את הווירוס להגיע ביטוי יציב בתחזיות הסינפטי עבור החלון גולגולתי לרפא ולייצב מלאים. החיות צריכות להיות שוכנו יחיד על מנת למנוע הסרת שתל חלון גולגולתי ידי חבריהם לכלוב. השימוש בכלוב מוגדל עשוי להיחשב על מנת למנוע נזק תאונתי של החלון גולגולתי ידי להכות את מוטות מתכת. קיבוע יציב של mouse מתחת למיקרוסקופ חיוני. כל תנועת הראש, כוללים תנועות נשימה, עלולה לגרום לירידה משמעותית באיכות של תמונות המתקבלות. כמו כן כדאי למקם את החלון גולגולתי אופקי אל המטרה, להגביל בעיות אפשריות עם רכישת מוקד שוות המטוס כולו של החלון. קריטריונים ברורים קוצי boutons לפתרון צריכים להיות מיושמים. באופן כללי, boutons מוגדרים נפיחויות אקסונלית בעל קוטר לפחות 3 פעמים גדול יותר סיבים שקדמו 7. שדרות מוגדרות בליטות להבחין באופן ברור בין פיר דנדריט המכיל ראש בולבוסים. חלוקה נוספת לתוך אוכלוסיות של דקה ועבה, פטריות קוצים מסועפים אפשרית 3. בשל ההחלטה צירית עניים יחסית של שני פוטונים במיקרוסקופ, ניתוח של עמוד השדרה המקרינים לאורך הציר האופטי יש להימנע 3. על מנת להבחין בבהירות boutons קוצים פונקציונלי, פוסט הוק immunolabelingניתן לבצע על מנת לזהות 7 סמנים טרום postsynaptic. אף על פי הפרוטוקול שהוצג התברר הטוב ביותר בעיצובי הניסוי שלנו, אפשר לשנות את זה על מנת להתאים מטרות ניסוי שונות. לפעמים זה יותר מתאים לשימוש הרדמה בזריקות (כגון קטמין-xylasine) במקום isoflurane, אך חשוב להתאים את המינון כראוי, תוך בדלי מוח ברגישות סמים בין העכברים של זנים, גיל ומין שונים. אפשר להשתמש לִקְדוֹחַ ספחת במקום אחד כדורי עבור הקידוח, אבל זה יכול להגביר את הסיכון של פגיעה ההדורה. מלח סטרילית עשוי להיות מוחלף בהצלחה עם מלאכותי הנוזל השדרתי (ACSF), אבל חשוב לשמור על סטריליות בכל עת במהלך הכנת ותפעול. ACSF יציב במשך 3-4 שבועות לאחר ההכנה, ואם כל זיהום מתרחשת לפני הפעם זה אמור להיות מושלך מיד. fixati הראש השונהבהתקנים ניתן להחיל, בהתאם לעיצוב ניסיוני, לרבות האפשרות של התבוננות העכבר הער תחת מיקרוסקופ שני פוטונים. כמו כל טכניקה אחרת, זה גם יש מגבלות. המיקרוסקופ שני הפוטונים מאפשר הדמיה של רקמת המוח עד 500 מיקרומטר עמוק מפני השטח ההדור. לצורך בחינה של מבנים המוחיים העמוקים יותר שינויים נוספים חייבים להיות מיושמים. הפרוטוקול שלנו מאפשר גישה למרבית RSC, אבל החלק מהמבנה המוסתר תחת סינוס sagittal המעולה הוא עדיין אינו נגיש. הרזולוציה של מיקרוסקופ שני פוטונים אינה מספיק כדי להביא לזיהוי סינפסה ספציפית כמו גם ניתוח מורפולוגי מפורט של קוצים הדנדריטים. טכניקות נוספות, כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית מצטרף חייבות להיות מיושמות על מנת לאשר את קיומו של מבנה חשד. כמו כן, חשוב לציין כי זוהי טכניקה כירורגית יחסית קשה וזה לא recommended עבור מפעיל שנמנה. הטכניקה הציגה עשויה להיות מיושמת במגוון רחב של ניסויים. זה עלול להיות שונה לחקירה של אזורי המוח השונים נגישים עם מיקרוסקופ שני פוטונים. היא מאפשרת ניטור סימולטני של אקסונלית ושינויים הדנדריטים במהלך במגוון מדינות פיזיולוגיים ופתולוגיים כולל תהליכים קוגניטיביים והזדקנות או התקדמות של נוירולוגיות מצבים פסיכיאטריים. זה מאפשר שימוש של מקדמי תא ספציפי לדמיין תחזיות שמקורם ב תת נוירונים הגדיר במדויק. היא עשויה גם להיות מותאמת כדי להתאים את הפרוטוקולים של ניסויים בבעלי חיים ערים מתנהגים. יתר על כן, חלבונים רגישים סידן או pH- יכול לבוא לידי ביטוי במוח על מנת להמחיש לא רק את המורפולוגיה העצבית אלא גם שינויים בפעילות תא ותפקודו. עוד שינוי אפשרי של הגישה הוא השימוש של סרוטיפ rAAV שונה לביטוי mCherry. ה- PR 2/1 סרוטיפ כימריovides ביטוי חזק באזור הזריקה עם פתיחה מהירה מספיק (2-3 שבועות). רמות mCherry שומרות על יציבות כבר לפחות 12 שבועות לאחר הופעה ראשונית ואין תיוג מדרדר זוהה בניסויים שלנו. על מנת לקבל תיוג מדרדר, סרוטיפ שונה עשוי לשמש, כגון rAAV9. מפגשי ההדמיה ניתן לבצע בתדירות כלשהי, אולם במרווח של 24 שעות לפחות מומלץ על מנת לאפשר התאוששות נאותה של החיה לאחר הרדמה. אם מיושם כהלכה, טכניקה זו מאפשרת ביצוע פגישות הדמיה מרובות של אותו האזור במשך מספר חודשים. בניסויים ארוכי טווח (יותר מ -6 חודשים), מערכת Cre / LoxP ניתן להשתמש עם recombinase נמסר עם וקטור AAV לקו העכבר GFP floxed.

שני הפוטונים מיקרוסקופיה מהפכת התצפית של פעילות המוח הן חי ופועל חיות. מאז השקתו בשנת 1990 הוא במהירות לפופולריות והוא מיושם כיום כאחת הגישות המעניינות והחדשניות ביותר כלפי בחינת היבטים רבים של פעילות מוח in vivo 1,2. יישומים אלה כוללים מדידות זרימת דם, הפעלת נוירונים (למשל, באמצעות אינדיקטורים רמת סידן או ביטוי גנים מוקדם מיידיים) ואת המורפולוגיה של תאים עצביים. מספר גדל והולך של מעבדות להשתמש מיקרוסקופי שני פוטונים, יישום הטכניקה ברחבי העולם המדעי כסטנדרט חדש עבור הדמיה המוחית in vivo. הגישה הסטנדרטית כוללת השתלה של החלון גולגולתי (חור עגול הגולגולת מכוסית זכוכית לכסות) מעל החבית או בקליפת המוח הראייתית של עכבר המוח 3. לאחר מכן, בהתאם לפרוטוקול הניסוי, mouse עובר סדרה של ויזואליזציה והדרכות התנהגותי, המאפשר לעקוב אחר השינויים בפעילות המוח והמורפולוגיה עצבית לאורך זמן 4,5. בשני המקרים craniotomy משפיע רק על עצם הקודקוד, מבלי לחצות את התפרים. הוא האמין בעיקר כי החיסרון העיקרי של השיטה הוא היישום שלה מוגבל cortexes ונגיש כגון חבית או בקליפת המוח הראייתית. השרשה של החלון גולגולתי על פני אזורים אחרים מציבה הרבה קשיים, עקב דימום יתר ו / או הפרעה מרחבית. במאמר זה אנו מציעים את ההשתלה של החלון גולגולתי מעל הקורטקס retrosplenial (RSC) כעוד באזור ריבית אפשרי עבור שני פוטונים in vivo מיקרוסקופיה 6. RSC היא מרכיב חשוב של המעגל במוח האחראי על היווצרות הזיכרון המרחבי. אנטומית, RSC היא חלק מהרשת עצבית חיבור קליפת מוח, בהיפוקמפוס, ואזורים התלמוס 7. זהבכבדות מעורב במגוון של התנהגויות, כגון לימוד ושינון הכחדה המרחבית וכן ניווט מרחבית 6. על מנת להמחיש את השינויים המורפולוגיים של נוירונים אנו משתמשים קו עכבר מהונדס מבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת אמרגן Thy1. בעכברים אלו, GFP מתבטא כ 10% של הנוירונים במוח המאפשרים להדמיה ברורה של אקסונים קליפת המוח דנדריטים באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים 8. חידוש נוסף שאנו מציעים הוא הזרקה של סרוטיפ וירוס adeno הקשורים רקומביננטי 2/1 (מרמת rAAV2 / 1) קידוד חלבון פלואורסצנטי אדום (mCherry) תחת האמרגן camkii ספציפי נוירון 9 לתוך המבנים העמוקים יותר של המוח מקרין RSC , כגון ההיפוקמפוס. הביטוי של מרמת rAAV2 / 1 mCherry בהיפוקמפוס של העכבר Thy1-GFP מאפשר להדמיה סימולטני של אלמנטים טרום postsynaptic של hippocampo-cortical הסינפסות 10. הביטוי rAAV מונחה של mCherry דורש שבועיים עד שלושה שבועות לחלבון להגיע לרמה מספקת במסופים אקסונלית. תקופה זו עולה בקנה אחד עם הזמן הרגיל הנדרש להתאוששות מן craniotomy.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Drug&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>5-2% pre-operative</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>1.5-2% during surgery</td></tr><tr><td>Dexametasone</td><td>Scan Vet</td><td>Dexasone 2mg/ml</td><td>0.2 mg/kg intramuscular</td></tr><tr><td>Baytril</td><td>Bayer</td><td>2.50%</td><td>5 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Tolfedine</td><td>Vetoquinol</td><td>4%</td><td>4 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Butomidor</td><td>Richter Pharma</td><td>10 mg/ml</td><td>2 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>KRKA-Polska</td><td>Rycarfa 50mg/ml</td><td>10 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>Jelfa</td><td>Lignocainum</td><td>topically</td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>Jelfa</td><td>20 mg/g</td><td>topically</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Surgery&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Ethicon</td><td>Spongostan dental; REF MS0005</td><td></td></tr><tr><td>Eye ointment</td><td>Dedra</td><td>Lubrithal</td><td>topically</td></tr><tr><td>CA glue</td><td>Pelikan Daniel</td><td>20G Huste</td><td></td></tr><tr><td>Dental acrylic</td><td>SpofaDental</td><td>Duracryl Plus</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic frame</td><td>Stoelting</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tool&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverglass</td><td>Harvard Apparatus</td><td>HSE-64-0720</td><td>3 mm diameter</td></tr><tr><td>Dental drill</td><td>Sigmed</td><td>Keystone KVet</td><td></td></tr><tr><td>Fixation bar</td><td>Custom made</td><td>N/A</td><td>M2 or M3 screw nuts could be used</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Renex</td><td>PN-7B-SA</td><td></td></tr><tr><td>Micro scissors</td><td>Falcon</td><td>BM.183.180</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>KOZO</td><td>XTL6445T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Imaging&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Holder frame</td><td>Custom made</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Two-photon microscope</td><td>Zeiss</td><td>Upright Axio Examiner Z1</td><td>Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Virus</td><td>gift from K. Deisseroth</td><td></td><td>Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter</td></tr></tbody></table>

simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

<html> הביטוי של ה- GFP משנה של נוירונים עכבר כתב Thy1-GFP מאפשר in vivo ההדמיה של דנדריטים קליפת המוח ותחזיות axonal המקומיות RSC. איור 1 א מציג הקרנה מקסימלי של ערימה של תמונות עם דנדריטים GFP חיובים מרובים גלויים. גוף התא הוא מוסתר על ידי עורק. 1B האיור מראה תמונה אחת מטוס תקריב (זום דיגיטלי 3x) של סניף הדנדריטים המצוין 1A. פרטים של מורפולוגיה הדנדריטים (קוצים, filopodia) נראים בבירור. ערוץ GFP נרכש באמצעות מסנן הפליטה לעבור להקת 500-550 ננומטר. זריקה של mCherry מרמת rAAV2 / 1 אל ההיפוקמפוס הגבה מאפשרת הדמיה של אקסונים בהיפוקמפוס boutons הסינפטי המסתיימות RSC. מסופים אלה ניתן לאתר ערוץ mCherry (פליטת לעבור הלהקה לסנן 570-610 ננומטר). ss = &quot;jove_content&quot; FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53528/53528fig1.jpg" /> איור 1. שני ערוץ שני הפוטונים הדמיה vivo של נוירונים RSC ותחזיות בהיפוקמפוס כדי RSC. (א) סקירה של התאים המבטאים-GFP ב שבר של RSC (התמונה המוצגת בצבעים הפוכים). הקרנה מקסימלי לראות ערימה עבה 100 מיקרומטר נלקחה ב בהגדלה נמוכה (זום דיגיטלי 0.7x). (ב) מטוס אופטי יחיד של שהבר מצוין (א) רכשו בהגדלה גדולה (זום דיגיטלי 3x) בערוץ ה- GFP. (C) שבר מטוס אופטי יחיד מצוין (א) תוך שימוש בהגדרות רכישת mCherry. ראה פרוטוקול לפרטים מסננים זיהוי. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53528/53528fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex at JoVE.com

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

שני פוטונים סימולטני<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

simultaneous-two-photon-vivo-imaging-synaptic-inputs-postsynaptic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

11.4K Views.  Nencki Institute of Experimental Biology. This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Video: Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

תיוג ממוקד של תאי עצב בתחומים ספציפיים מייקר פונקציונליים של הניאוקורטקס ידי שילוב אותות פנימיים והדמית שני פוטונים

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

אורך שני-פוטון הדמיה של CA1 היפוקמאל בעכברים חיים

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

Behavior

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

שני פוטונים<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

בזריקות Vivo גרם סטריאוטקאית לגירוי מגנטי של תשומות לטווח ארוך בפרוסות המוח של העכבר

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

<a href='https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61970/transpupillary-two-photon-in-vivo-imaging-of-the-mouse-retina'>Source: Wang, Z., et al.&#160;Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp.&#160;(2021).</a>This video demonstrates a technique for in vivo retinal imaging using two-photon microscopy. Anesthetized mice are prepared for imaging by securing their heads, Applying eye lubricant, and placing a coverslip over the eye. Retinal ganglion cells (RGCs) expressing fluorescent proteins are first visualized using epifluorescence for alignment. Finally, two-photon imaging is employed, allowing for high-resolution visualization of RGCs.

Source: Wang, Z., et al.&#160;Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp.&#160;(2021).This video demonstrates a technique ...

שני פוטונים סימולטני

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video