Gli autori desiderano ringraziare M. Steczkowski per registrazioni vocali, M. Borczyk per i disegni, A. Trąbczyńska per la produzione di virus, M. Ziókowska per la genotipizzazione e A. Mirgos per l&#39;assistenza con le riprese. KR riconosce il dono tipo di virus adeno-associato ricombinante (rAAV) che esprime una proteina fluorescente mCherry sotto il controllo del promotore CaMK da K. Deisseroth. Questo progetto è stato realizzato presso le strutture fondamentali del Laboratorio di modelli animali e laboratorio di tessuti Struttura e funzione, Centro di Neurobiologia, Nencki Istituto di Biologia Sperimentale, con l&#39;utilizzo delle infrastrutture Cept finanziato dall&#39;Unione Europea - Fondo Europeo di Sviluppo regionale all&#39;interno del programma operativo &quot;Economia innovativa&quot; per il periodo 2007-2013. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Science Centre: Sonata Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02.996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00691 per KR e Sonata Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 RC

Tutte le procedure sperimentali descritte di seguito sono stati approvati dal Comitato Etico Locale presso l&#39;Istituto Nencki of Experimental Biology, Accademia polacca delle scienze. Nota: Alcune delle scene del video associato sono accelerati. Fattore di velocità è indicata in queste scene. 1. Chirurgia Preparazione <ol><li> Sterilizzare tutti gli strumenti, contenitori di vetro per liquidi e tamponi di cotone in autoclave. Utilizzare guanti superflui. Pulire il tavolo operatorio, il telaio stereotassico e tutta l&#39;area circostante con il 70% di etanolo. Utilizzare un tampone sterile chirurgica per creare uno spazio sterile per tutte le attrezzature sterilizzato. Tagliare Gelfoam in piccoli pezzi e ammollo in soluzione fisiologica sterile. Nota: Secondo la Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio, l&#39;etanolo non è né un sterilizzante, né un disinfettante di alto livello. Dovrebbe essere usato solo come un detergente / sgrassante su superfici già sterilizzati. </li><li> Mettere l&#39;animale in the camera di induzione e impostare il livello isoflurano al 5% e il flusso di ossigeno a 2 L / min. Questa procedura dovrebbe durare circa 3 min. </li><li> Prendere l&#39;animale dalla camera di induzione. Utilizzare coda o punta pizzicotti per garantire che l&#39;animale è completamente sedato. </li><li> Utilizzando un trimmer precisa radere i capelli dalla parte posteriore della testa (tra le orecchie) fino agli occhi. </li><li> Posto l&#39;animale nel telaio stereotassico e stabilizzare la testa con barre orecchio. </li><li> Impostare i livelli di anestesia per 1,5-2% isoflurano e 0.3 L / min di ossigeno. </li><li> Applicare l&#39;unguento oculare. </li><li> Iniettare il sottocutanea animale con Tolfedine (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) e Baytril (5 mg / kg) per prevenire l&#39;infiammazione, il dolore e l&#39;infezione, rispettivamente. </li><li> Iniettare il intramuscolare animale con desametasone (0,2 mg / kg) per prevenire il gonfiore cervello. Nota: È possibile iniettare desametasone per via sottocutanea o intraperitoneale per evitare danni muscolari. </li><li> Pulire la pelle con stamponi di cotone terile con Betadine seguita da etanolo al 70%. </li><li> Cambiare i guanti e spruzzarli con il 70% di etanolo. Nota: Durante l&#39;utilizzo di guanti usa e getta non toccare il campo sterile. Toccare l&#39;animale solo con le punte di strumenti chirurgici sterili e tamponi sterili. </li></ol> Chirurgia 2. cranica finestra <ol><li> Sollevare la pelle con una pinza e utilizzando microorganismi forbici incidere la pelle orizzontalmente lungo la base della testa e poi obliquamente al punto fronte tra gli occhi. Rimuovere il lembo cutaneo. </li><li> Applicare lidocaina pomata con un tampone sterile sul periostio per evitare un eccessivo sanguinamento e dolore. </li><li> Usare tamponi di cotone sterili o un bisturi per rimuovere il periostio. Asciugare il cranio con tamponi sterili. </li><li> Utilizzando un ago sterile applicare colla cianoacrilato densa sui bordi della pelle per immobilizzare loro e per evitare il contatto con il cemento dentale. Attendere che la colla si asciughi. </li><li> Lay uno sterile 3 millimetri coprioggetti sopra tegli cranio anteriormente alla sutura lambdoidea. Centrare il vetrino a RSC coordinate: AP, bregma -2.8; ML, bregma 0. Mark bordi coprioggetto da graffiare la superficie del cranio con un ago sterile. Mettere il coprioggetti nel contenitore sterile, con il 70% di etanolo. </li><li> Utilizzare un trapano dentistico ad alta velocità con una piccola bava di diametro per delineare un cerchio del diametro di 3 mm. Pulire il sito di perforazione dalla polvere di osso con soluzione salina sterile tamponi immersi. Utilizzare il Gelfoam e tamponi per fermare l&#39;emorragia occasionale e pulire l&#39;osso. </li><li> Tra foratura controllare lo spessore osseo con una pinza sottile toccando delicatamente il cerchio dell&#39;osso e controllando la sua mobilità. Tenere presente che l&#39;osso è più spessa sulla superficie della sutura. Fermare la perforazione quando il cerchio osso è mobile e solo un pari, sottile strato di tessuto osseo viene lasciato sulla circonferenza. Pulire il campo operativo di tutta la polvere osso residuo con soluzione salina immerso tamponi. </li><li> Eliminare la soluzione salina sterile nella zona di perforazione, che copre il cir foratoCLE. Scalzare con cura il cerchio osso con una pinza sottile e poi delicatamente ma con fermezza rimuovere l&#39;osso sollevandolo verso l&#39;alto. Fare attenzione a non inclinare il cerchio osso mentre lo si solleva per evitare possibili danni alla dura. </li><li> applicare delicatamente la Gelfoam imbevuta di soluzione salina sterile sulla dura per aiutare a fermare l&#39;emorragia. Attendere fino a quando tutto il sanguinamento è completamente interrotta. Rimuovere con attenzione il Gelfoam non disturbare il processo di coagulazione. Nota: l&#39;area di sutura è altamente vascolarizzata, in modo che il sanguinamento a questo punto potrebbe rivelarsi profonda. È indispensabile attendere il tempo sufficiente per il sanguinamento si fermi completamente. È utile mantenere l&#39;Gelfoam imbevuta di soluzione salina raffreddato mettendolo in ghiaccio. </li></ol> 3. Virus iniezione <ol><li> Fissare la pompa di infusione alla torre stereotassica e collegare il controller. </li><li> Inserire l&#39;ago 35G nella siringa. Lavare la siringa 10 volte con etanolo per sterilizzare e 10 volte con soluzione salina sterile per rimuovere le tracce di ethanol. Rimuovere le bolle d&#39;aria dalla siringa. Inserire la siringa nella pompa. Nota: Si consiglia di utilizzare altri disinfettanti. </li><li> Scongelare una singola dose di rAAV2 / 1 preparazione mCherry (si consiglia 10 12 pfu) e tenerlo in ghiaccio. Riempire la siringa con la soluzione di virus. </li><li> Centrare l&#39;ago sulla bregma e quindi inserire delicatamente nella ippocampo utilizzando le seguenti coordinate: AP -2, ML +/- 1.0, DV -1. Queste coordinate saranno situati vicino al bordo della craniotomia. Attendere per 5 minuti per il tessuto si stabilizzi. </li><li> Iniettare 0,7 ml di soluzione di rAAV2 / 1 mCherry alla velocità di 50 nl / min. Attendere 10 minuti per il virus di adsorbire completamente. Rimuovere delicatamente l&#39;ago. Tamponare con Gelfoam in caso di sanguinamento. Ripetere con il sito controlaterale. </li></ol> 4. cranica Finestra Implantation <ol><li> Lay sterile, coverglass secca sulla parte superiore della dura nel telaio del cerchio forato. Tenere il coprioggetti con la forceps per appiattire delicatamente la dura e portare coverglass &#39;bordi più vicino alla superficie del cranio. Nota: E &#39;possibile che il coprioggetti sconvolge il coagulo e la riprende sanguinamento. Se questo è il caso, sollevare il coprioggetti, metterlo in alcool, asciutto e tornare al punto 2.9. </li><li> Usando un ago sterile applicare la colla cianoacrilato densa sui bordi di coperture vetrose per il fissaggio al cranio. Attendere che la colla si asciughi. </li><li> Mettere una barra di fissaggio (M2 dado o un disegno su ordine) nella parte anteriore del cranio. Applicare la colla cianoacrilato oltre i bordi della barra. Attendere che la colla si asciughi. <ol><li> Posizionare la barra di fissaggio in una posizione che consenta il posizionamento orizzontale della finestra cranica durante l&#39;imaging sessione. Posizionare il più lontano possibile dal finestrino. Se è posizionato troppo vicino alla finestra, la barra e la vite di collegamento con il supporto misura potrebbero rappresentare un ostacolo per l&#39;obiettivo durante il processo di imaging. </li></ol></li><li&gt; Preparare la acrilico dentale e applicarlo sulla superficie del cranio intorno al bicchiere. È utile per formare una figura crateriforme intorno alla finestra. Si creerà una cavità di acqua applicata successivamente per l&#39;imaging con l&#39;obiettivo di acqua. </li><li> Creare un berretto con l&#39;acrilico dentale, che copre il resto della zona operativa, bordi cutanei, bar fissazione, rafforzando il cratere intorno alla finestra cranica. Attendere che il cemento dentale per indurire. </li><li> Rimuovere l&#39;animale dal telaio stereotassico e metterlo nella camera di recupero. </li><li> Attendere che l&#39;animale per recuperare da un intervento chirurgico nel rispetto delle funzioni fisiologiche. </li><li> Applicare analgesia post-operatoria (carprofen, 10 mg / kg) e il trattamento antibiotici (Baytril, 5 mg / kg) per 48 ore. </li></ol> 5. Imaging <ol><li> Avviare il laser Ti: zaffiro, accendere il microscopio. Il sistema utilizzato in questo esperimento è dotato di un laser a due fotoni, sistema OPO e doppio PMT GaAsP. </li><li> Mettere l&#39;animale nella Induccamera di e indurre l&#39;anestesia. </li><li> Rimuovere l&#39;animale dalla camera di induzione e posto nella maschera anestesia gas sotto il microscopio. Diminuire il flusso di ossigeno al 0,3 L / min e la concentrazione isoflurano al 1,5-2%. </li><li> Fissare l&#39;animale a stativo personalizzato con una vite M2 (o un altro sistema personalizzato). Livellare la finestra del cranio. Nota: È possibile utilizzare il sistema di fissaggio della testa del produttore microscopio, anche se il telaio personalizzato specifico dà risultati migliori (migliore stabilità testa, costante posizionamento in più sessioni durante un esperimento cronica). </li><li> Utilizzando le impostazioni del microscopio widefield e un basso centro obiettivo di ingrandimento della vista su uno dei lati della corteccia retrosplenial e concentrarsi sulla superficie vetrino. </li><li> Applicare una goccia d&#39;acqua nel pozzo acrilico crateriforme. Passare a un obiettivo di immersione in acqua a lunga distanza. Spostare l&#39;obiettivo verso la finestra del cranio fino a quando l&#39;aria l&#39;acqua del meniscoUnisce il campione e obiettivo. </li><li> Passare alle impostazioni di due fotoni e iniziare la scansione del campione superiore a fondo utilizzando lo zoom più basso. La traversata di dura madre sarà visibile come un bagliore di segnale non specifico alta. </li><li> Regolare le impostazioni di acquisizione microscopio in entrambi i canali (GFP e mCherry) secondo la potenza del segnale da cellule fluorescenti in modo da coprire l&#39;intera gamma dinamica. </li><li> Dopo aver trovato un neurone adeguata (con l&#39;albero dendritiche separata da altre cellule) eseguire una scansione iniziale utilizzando solo il filterset GFP con lo zoom più basso e Z-distanza di 5 micron. </li><li> Ottenere una proiezione massima dello stack scansionato e stamparlo per le annotazioni (utilizzando colori invertiti). </li><li> Impostare lo zoom su un valore che permetterà di immagine i dettagli morfologici desiderati. Immagine l&#39;intero albero dendritiche nei canali GFP e mCherry con proiezione massima di guida. </li></ol>

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Gli autori (KL, MR, KR) hanno diritti di brevetto in sospeso (PL410001) per fotogramma Holder usato in questo articolo.

Nel documento corrente vi presentiamo un protocollo per la simultanea a due fotoni imaging in vivo degli ingressi sinaptici e gli obiettivi post-sinaptici in RSC attraverso una finestra cranica. La procedura di impianto è composto da diversi passaggi chiave. Innanzitutto, l&#39;animale è profondamente anestetizzati e fissato nel telaio stereotassico, poi il cranio sopra RSC viene diluito con un trapano lungo le linee circolari segnalati e l&#39;osso circolare viene rimosso. Dopo l&#39;emorragia viene arrestato, il rAAV2 / 1 mCherry viene iniettato nel ippocampo, e il vetro di copertura è fissato al cranio sopra la zona forata. Infine la barra di fissaggio viene fissata sulla testa e l&#39;animale viene posto nella camera di recupero per 48 ore. Dopo circa 2-3 settimane necessarie per l&#39;espressione del virus, l&#39;RSC può essere visualizzato. Il protocollo di imaging comprende i seguenti passaggi. Innanzitutto, l&#39;animale è anestetizzato e fissato al microscopio. L&#39;attenzione viene quindi impostato utilizzando il microscopio widefield, il sistema è SWItched nella modalità a due fotoni ei canali di interesse (GFP e mCherry) vengono visualizzati. La tecnica presentata offre un notevole miglioramento rispetto ai protocolli descritti in precedenza. Nell&#39;approccio standard solo tipo di etichetta potrebbe essere rilevato. Potrebbe essere usato per un&#39;immagine locale proiezioni assonale e alberi dendritiche, ma non esistono studi a lungo raggio connettività fosse possibile. Grazie alla combinazione di due proteine ​​fluorescenti abbiamo attivato tracciamento simultaneo di elementi pre-e post-sinaptici. Ciò consente il monitoraggio a lungo termine in vivo di connessioni sinaptiche putativi. Per ottenere i risultati ottimali nella procedura descritta, è importante prestare attenzione a diversi passaggi critici. Durante il sollevamento del cerchio dell&#39;osso nel passaggio 2.8 danni alla dura può causare infiammazione e compromettere la trasparenza della finestra cranica. arresto insufficiente delle emorragie in fase 2.9 o in qualsiasi altro punto della procedura si traduce in accumulat sangueione sotto la finestra e riduce significativamente il campo di vista. Dopo aver iniettato il virus è indispensabile attendere almeno 10 minuti prima di rimuovere l&#39;ago, affinché il virus di infondere nel tessuto al solo sito di iniezione. Esso limita la possibilità di infezione indesiderata della corteccia con il virus durante la rimozione dell&#39;ago. L&#39;area della trasfezione virale dovrebbe essere esaminata con un&#39;analisi post hoc istologica del tessuto cerebrale. Qualsiasi espressione mCherry nelle cellule lungo la traccia ago deve essere evitato. Il tempo di recupero standard è di 3 settimane. Tale periodo è sufficiente per il virus di raggiungere espressione stabile nelle proiezioni sinaptiche e per la finestra cranica di guarire completamente e stabilizzare. Gli animali dovranno essere singola alloggiati al fine di impedire la rimozione della finestra protesi cranica dai compagni di gabbia. L&#39;impiego di una gabbia allargata potrebbe essere considerato per evitare danni accidentali della finestra cranica colpendo le barre metalliche. fissazione stabile del mouse al microscopio è essenziale. Qualsiasi movimento della testa, compresi i movimenti respiratori, può causare una significativa riduzione della qualità delle immagini ottenute. E &#39;anche utile per posizionare la finestra cranica orizzontale all&#39;obiettivo, di limitare eventuali problemi all&#39;acquisizione uguale attenzione per l&#39;intero piano della finestra. criteri chiari per risolvere spine e boutons devono essere applicate. Generalmente, boutons sono definiti come gonfiori assonale aventi un diametro di almeno 3 volte più grande della fibra precedente 7. Spine sono definiti come sporgenze chiaramente distinguibile da l&#39;albero dendrite che contiene la testa bulbosa. Ulteriori divisione in popolazioni di sottile, tozzo, funghi e spine ramificata è possibile 3.. A causa della risoluzione assiale relativamente povera della microscopia a due fotoni, analisi delle spine che proiettano lungo l&#39;asse ottico deve essere evitato 3. Al fine di distinguere chiaramente boutons e spine funzionali, un post hoc immunomarcaturapuò essere effettuata per identificare marcatori pre e post-sinaptici 7. Sebbene il protocollo presentato dimostrato di essere il più favorevole nei nostri disegni sperimentali, è possibile modificare in modo da adattarsi ai diversi obiettivi sperimentali. A volte è più adatto da usare anestesia iniettabile (come ketamina-xylasine) invece di isoflurano, ma è importante regolare adeguatamente la dose, tenendo presente le differenze nella sensibilità ai farmaci tra i topi di diversi ceppi, età e sesso. È possibile utilizzare un trapano fresa invece di una sfera per la perforazione, ma potrebbe aumentare il rischio di danni alla dura. salina sterile può essere sostituito con successo con liquido cerebrospinale artificiale (ACSF), ma è importante mantenere sterile in ogni momento durante la preparazione ed il funzionamento. ACSF è stabile per 3-4 settimane dopo la preparazione, e se la contaminazione si verifica prima di questo tempo dovrebbe essere immediatamente eliminata. Diversi fixati testasu dispositivi può essere applicato, a seconda del disegno sperimentale, compresa la possibilità di osservare il mouse sveglio al microscopio a due fotoni. Come ogni altra tecnica, questo ha anche i suoi limiti. Il microscopio a due fotoni permette la visualizzazione del tessuto cerebrale fino a 500 micron in profondità dalla superficie dura. Per l&#39;esame delle strutture cerebrali profonde devono essere applicate ulteriori modifiche. Il nostro protocollo permette l&#39;accesso a più di RSC, ma la parte della struttura nascosta sotto il seno longitudinale superiore non è ancora accessibile. La risoluzione del microscopio a due fotoni non è sufficiente per l&#39;identificazione di una sinapsi specifico, nonché analisi morfologica dettagliata delle spine dendritiche. Altre tecniche, come la microscopia elettronica correlativo devono essere applicate per confermare l&#39;esistenza di una struttura sospetta. È inoltre importante ricordare che questa è una relativamente difficile tecnica chirurgica e non è recommended per un operatore inesperto. La tecnica presentata può essere applicata in una vasta gamma di esperimenti. Esso può essere modificato per indagini di diverse regioni del cervello accessibili con il microscopio a due fotoni. Consente il monitoraggio simultaneo di assonale e alterazioni dendritiche durante varietà di stati fisiologici e patologici, tra cui i processi cognitivi e di invecchiamento o la progressione della neurologici e psichiatrici. Esso consente l&#39;uso di promotori specifici delle cellule per visualizzare proiezioni originari in sottoinsiemi neuronali ben definite. Può anche essere regolato per adattarsi ai protocolli di esperimenti su animali svegli e di comportarsi. Inoltre, le proteine ​​sensibili calcio-o del pH possono essere espressi nel cervello al fine di visualizzare non solo la morfologia dei neuroni ma anche cambiamenti nelle attività delle cellule e la funzione. Un&#39;altra possibile modifica del metodo è l&#39;uso di un differente sierotipo rAAV per l&#39;espressione mCherry. Il chimerico pr 2/1 sierotipoovides robusta espressione al sito di iniezione con sufficientemente rapida insorgenza (2-3 settimane). I livelli mCherry è rimasto stabile per almeno 12 settimane dopo l&#39;insorgenza iniziale e nessuna marcatura retrograda è stata rilevata nei nostri esperimenti. Per ottenere marcatura retrograda, un sierotipo differente potrebbe essere utilizzato, ad esempio rAAV9. Le sessioni immagini vengono eseguite a qualsiasi frequenza, comunque almeno intervallo di 24 ore è raccomandato per consentire il corretto recupero dell&#39;animale dopo anestesia. Se applicato correttamente, questa tecnica permette di eseguire più sessioni di imaging della stessa regione nel corso di diversi mesi. Per esperimenti di lunga durata (superiore a 6 mesi), un sistema Cre / loxP può essere utilizzato con la ricombinasi consegnato con il vettore AAV in una linea GFP del mouse floxed.

Microscopia a due fotoni rivoluzionato l&#39;osservazione di attività cerebrale nel vivere e di comportarsi animali. Dalla sua introduzione nel 1990 ha rapidamente guadagnato popolarità ed è ora implementato come uno degli approcci più interessanti e innovative verso l&#39;esame di numerosi aspetti dell&#39;attività cerebrale in vivo 1,2. Queste applicazioni includono le misurazioni del flusso sanguigno, attivazione neuronale (ad esempio, utilizzando indicatori di livello di calcio o di geni precoci immediati espressione) e la morfologia delle cellule neuronali. Un numero crescente di laboratori utilizzano microscopi a due fotoni, l&#39;attuazione della tecnica in tutto il mondo scientifico come un nuovo standard per l&#39;imaging in vivo del cervello. L&#39;approccio standard prevede l&#39;impianto della finestra del cranio (un foro rotondo nel cranio coperto con una copertura in vetro) oltre il barile o corteccia visiva del cervello di topo 3. Successivamente, a seconda del protocollo sperimentale, il mouse subisce una serie di visualizzazione e allenamenti comportamentali, consentendo di monitorare i cambiamenti nell&#39;attività cerebrale e la morfologia neuronale nel tempo 4,5. In entrambi i casi il craniotomia interessa solo l&#39;osso parietale, senza attraversare le suture. È ampiamente ritiene che il principale svantaggio di questa tecnica è la limitata applicazione cortecce facilmente accessibili come il barile o corteccia visiva. L&#39;impianto della finestra del cranio su altre regioni pone molte difficoltà, a causa di eccessivo sanguinamento e / o ostacoli spaziale. In questo articolo si propone l&#39;impianto della finestra del cranio sopra la corteccia retrosplenial (RSC) come un&#39;altra possibile regione di interesse per due fotoni in vivo microscopia a 6. RSC è un elemento importante del circuito di cervello responsabile per la formazione della memoria spaziale. Anatomicamente, RSC è una parte di una rete neuronale che collega corticale, ippocampo, talamo e le regioni 7. Èpesantemente coinvolti in una serie di comportamenti, quali l&#39;apprendimento spaziale e l&#39;estinzione, così come la navigazione spaziale 6. Al fine di visualizzare i cambiamenti morfologici dei neuroni che usiamo una linea di topo transgenico che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il promotore Thy1. In questi topi, GFP è espressa in circa il 10% dei neuroni nel cervello consentendo chiara visualizzazione degli assoni e dendriti corticali utilizzando microscopia a due fotoni 8. Un&#39;altra innovazione che vi proponiamo è l&#39;iniezione di un ricombinante adeno-associato virus sierotipo 2/1 (rAAV2 / 1) che codifica una proteina fluorescente rossa (mCherry) in una specifica-neurone CaMKII promotore 9 nelle strutture profonde del cervello sporgenti di RSC , come l&#39;ippocampo. L&#39;espressione di rAAV2 / 1 mCherry nell&#39;ippocampo di topo Thy1-GFP permette la visualizzazione simultanea di elementi pre-e post-sinaptici del Hippocampo-cortical sinapsi 10. L&#39;espressione rAAV-driven di mCherry richiede due o tre settimane per la proteina di raggiungere livello sufficiente nei terminali degli assoni. Questo periodo è coerente con il solito tempo richiesto per il recupero di craniotomia.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Drug&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>5-2% pre-operative</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>1.5-2% during surgery</td></tr><tr><td>Dexametasone</td><td>Scan Vet</td><td>Dexasone 2mg/ml</td><td>0.2 mg/kg intramuscular</td></tr><tr><td>Baytril</td><td>Bayer</td><td>2.50%</td><td>5 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Tolfedine</td><td>Vetoquinol</td><td>4%</td><td>4 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Butomidor</td><td>Richter Pharma</td><td>10 mg/ml</td><td>2 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>KRKA-Polska</td><td>Rycarfa 50mg/ml</td><td>10 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>Jelfa</td><td>Lignocainum</td><td>topically</td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>Jelfa</td><td>20 mg/g</td><td>topically</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Surgery&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Ethicon</td><td>Spongostan dental; REF MS0005</td><td></td></tr><tr><td>Eye ointment</td><td>Dedra</td><td>Lubrithal</td><td>topically</td></tr><tr><td>CA glue</td><td>Pelikan Daniel</td><td>20G Huste</td><td></td></tr><tr><td>Dental acrylic</td><td>SpofaDental</td><td>Duracryl Plus</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic frame</td><td>Stoelting</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tool&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverglass</td><td>Harvard Apparatus</td><td>HSE-64-0720</td><td>3 mm diameter</td></tr><tr><td>Dental drill</td><td>Sigmed</td><td>Keystone KVet</td><td></td></tr><tr><td>Fixation bar</td><td>Custom made</td><td>N/A</td><td>M2 or M3 screw nuts could be used</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Renex</td><td>PN-7B-SA</td><td></td></tr><tr><td>Micro scissors</td><td>Falcon</td><td>BM.183.180</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>KOZO</td><td>XTL6445T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Imaging&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Holder frame</td><td>Custom made</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Two-photon microscope</td><td>Zeiss</td><td>Upright Axio Examiner Z1</td><td>Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Virus</td><td>gift from K. Deisseroth</td><td></td><td>Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter</td></tr></tbody></table>

simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

L&#39;espressione di GFP in un sottoinsieme di neuroni nel topo giornalista Thy1-GFP permette imaging in vivo dei dendriti corticali e proiezioni assonale locali a RSC. Figura 1A mostra proiezione massima di una pila di immagini con più dendriti GFP-positive visibili. Il corpo cellulare è oscurata da un&#39;arteria. Figura 1B mostra un&#39;immagine ingrandita solo piano (zoom digitale 3x) del ramo dendritico indicato 1A. Dettagli di morfologia dendritica (spine, filopodi) sono chiaramente visibili. Il canale GFP viene acquisita utilizzando il filtro passa banda di emissione 500-550 nm. Un&#39;iniezione di rAAV2 / 1 mCherry nelle dell&#39;ippocampo dorsale permette la visualizzazione degli assoni dell&#39;ippocampo e boutons sinaptica terminano in RSC. Questi terminali possono essere rilevati nel canale mCherry (l&#39;emissione passa banda filtro 570-610 nm). Figura 1. Due canali in vivo due fotoni di imaging di neuroni dell&#39;ippocampo RSC e proiezioni a RSC. (A) Una panoramica delle cellule GFP che esprimono in un frammento di RSC (immagine mostrata in colori invertiti). sporgenza massima mostrato di una pila di spessore di 100 micron prese a basso ingrandimento (0,7x zoom digitale). (B) piano ottico standard del frammento indicato in (A) acquisita ad alto ingrandimento (3x zoom digitale) nel canale GFP. (C) singolo frammento piano ottico indicato in (A) utilizzando le impostazioni di acquisizione mCherry. Vedere Protocollo per i dettagli dei filtri di rilevamento. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53528/53528fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultanea a due fotoni<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di Synaptic ingressi e degli obiettivi postsinaptici nella corteccia mouse retrosplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

simultaneous-two-photon-vivo-imaging-synaptic-inputs-postsynaptic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

11.4K Views.  Nencki Institute of Experimental Biology. This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Video: Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

Etichettatura mirata di neuroni in una specifica funzionale Micro-dominio della neocorteccia combinando segnale intrinseca e due fotoni Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

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Neuroscienze

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

Imaging longitudinale a due fotoni dell'ippocampo dorsale CA1 in topi vivi

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

Comportamento

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse Uso un teschio Diluito-Preparazione

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando Thy1-topi transgenici GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Iniezioni per la stimolazione optogenetica degli ingressi a lungo raggio nelle fette di cervello del topo

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

Imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale in topi svegli

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

<a href='https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61970/transpupillary-two-photon-in-vivo-imaging-of-the-mouse-retina'>Source: Wang, Z., et al.&#160;Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp.&#160;(2021).</a>This video demonstrates a technique for in vivo retinal imaging using two-photon microscopy. Anesthetized mice are prepared for imaging by securing their heads, Applying eye lubricant, and placing a coverslip over the eye. Retinal ganglion cells (RGCs) expressing fluorescent proteins are first visualized using epifluorescence for alignment. Finally, two-photon imaging is employed, allowing for high-resolution visualization of RGCs.

Source: Wang, Z., et al.&#160;Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp.&#160;(2021).This video demonstrates a technique ...

Simultanea a due fotoni

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