Los autores desean agradecer a M. Steczkowski para grabaciones de voz, M. Borczyk para dibujos, A. Trąbczyńska para la producción de virus, M. Ziókowska para el genotipado y A. Mirgos para obtener ayuda con la filmación. KR reconoce la especie de regalo del virus adeno-asociado recombinante (rAAV) que expresa la proteína fluorescente mCherry bajo el control del promotor de CaMK K. Deisseroth. Este proyecto se llevó a cabo en las instalaciones centrales del Laboratorio de Modelos Animales y Laboratorio de Estructura de los tejidos y la función del Centro de Neurobiología del Instituto Nencki de Biología Experimental, con el uso de la infraestructura de la CEPT financiado por la Unión Europea - Fondo Europeo de Desarrollo Regional dentro del Programa operativo &quot;economía innovadora&quot; para el período 2007-2013. Este trabajo fue apoyado por becas de Centro Nacional de Ciencia: Sonata Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00691 a KR y Sonata Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 a RC

Todos los procedimientos experimentales se describen a continuación fueron aprobados por el Comité Ético local en el Instituto Nencki of Experimental Biology, Academia de Ciencias de Polonia. Nota: Algunas de las escenas en el vídeo asociado se aceleran. Factor de velocidad se indica en estas escenas. 1. Preparación para la Cirugía <ol><li> Esterilizar todas las herramientas, envases de vidrio para líquidos y bastoncillos de algodón en el autoclave. Use guantes prescindibles. Limpiar la mesa de operaciones, el marco estereotáxico y todo lo que le rodea con etanol al 70%. Use una almohadilla quirúrgico estéril para crear un espacio estéril para todo el equipo esterilizado. Cortar espuma de gel en trozos pequeños y remojar en solución salina estéril. Nota: De acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, el etanol es un esterilizante ni un desinfectante de alto nivel. Sólo se debe utilizar como un agente de limpieza / desengrasado de superficies previamente esterilizados. </li><li> Poner el animal en THcámara de inducción de correo y establecer el nivel de isoflurano al 5% y el flujo de oxígeno a 2 l / min. Este procedimiento debe tomar alrededor de 3 min. </li><li> Llevar al animal fuera de la cámara de inducción. Utilice la cola o del dedo del pie aprieta con el fin de asegurar que el animal está completamente sedado. </li><li> El uso de un condensador de ajuste preciso afeitar el pelo de la parte posterior de la cabeza (entre las orejas) hasta los ojos. </li><li> Colocar el animal en el marco estereotáxico y estabilizar la cabeza con barras de oído. </li><li> Establecer niveles de anestesia con isoflurano al 1,5-2% y 0,3 L / min de oxígeno. </li><li> Aplicar el ungüento oftálmico. </li><li> Inyectar la vía subcutánea animal con Tolfedine (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) y Baytril (5 mg / kg) para prevenir la inflamación, el dolor y la infección, respectivamente. </li><li> Inyectar la vía intramuscular animal con dexametasona (0,2 mg / kg) para evitar la hinchazón del cerebro. Nota: Es posible inyectar por vía subcutánea o intraperitoneal dexametasona para prevenir el daño muscular. </li><li> Limpiar la piel con shisopos de algodón terile con Betadine seguidos por 70% de etanol. </li><li> Cambiar los guantes y rociarlas con un 70% de etanol. Nota: Durante el uso de guantes desechables no toque el campo estéril. Toca el único animal con la punta de los instrumentos quirúrgicos estériles e hisopos estériles. </li></ol> 2. Cirugía ventana del cráneo <ol><li> Levantar la piel con pinzas y el uso de tijeras micro incise la piel horizontalmente a lo largo de la base de la cabeza y luego oblicuamente hasta el punto de frente entre los ojos. Retire la tapa de piel. </li><li> Aplique un ungüento de lidocaína con un hisopo estéril en el periostio para evitar el sangrado y el dolor excesivo. </li><li> Use hisopos de algodón estériles o un escalpelo para retirar el periostio. Se seca el cráneo con hisopos estériles. </li><li> El uso de una aguja estéril se aplica densa pegamento de cianoacrilato sobre los bordes de la piel para inmovilizarlos y para evitar el contacto con cemento dental. Espere a que el pegamento se seque. </li><li> Coloque un 3 mm cubreobjetos estéril sobre tque el cráneo anterior a esta sutura. Centre el cubreobjetos en RSC coordenadas: AP, bregma -2,8; ML, bregma 0. Marque los bordes cubreobjetos por el rascado la superficie del cráneo con una aguja estéril. Poner el cubre de nuevo en el recipiente estéril con un 70% de etanol. </li><li> Use un taladro dental de alta velocidad con rebabas de pequeño diámetro para delinear un círculo de 3 mm de diámetro. Limpiar el sitio de perforación del polvo de hueso con hisopos de cruce de solución salina estéril. Utilice la espuma de gel y de hisopos para detener el sangrado ocasional y limpiar el hueso. </li><li> En el medio de perforación comprobar el espesor del hueso con unas pinzas finas tocando con suavidad el círculo de hueso y la comprobación de su movilidad. Tenga en cuenta que el hueso es más gruesa en el área de la sutura. Detener la perforación cuando el círculo de hueso es móvil y sólo un par, capa delgada de hueso se deja en la circunferencia. Limpiar el campo operacional de todo el polvo de hueso restante con hisopos salinas de cruce. </li><li> La caída de la solución salina estéril en el área de perforación, que cubre el CIR perforadoCLE. saque con cuidado el círculo hueso con unas pinzas finas y luego suavemente pero con firmeza quitar el hueso levantándolo hacia arriba. Tenga cuidado de no sesgar el círculo de hueso mientras se levanta para evitar posibles daños a la dura. </li><li> Aplique suavemente la espuma de gel empapada en solución salina estéril sobre la duramadre para ayudar a detener el sangrado. Espere hasta que todo el sangrado se detiene por completo. Retirar con cuidado la espuma de gel de no perturbar el proceso de coagulación. Nota: El área de sutura es muy vascularizada, por lo que el sangrado en este punto podría ser profundos. Es esencial que esperar el tiempo suficiente para que el sangrado se detenga completamente. Es útil para mantener la espuma de gel empapada en solución salina enfriada colocándola en hielo. </li></ol> 3. Inyección de virus <ol><li> Coloque la bomba de infusión a la torre estereotáctica y conectar el controlador. </li><li> Insertar la aguja 35G en la jeringa. Enjuague la jeringa 10 veces con etanol para esterilizarla y 10 veces con solución salina estéril para eliminar los restos de correoTHANOL. Eliminar las burbujas de aire de la jeringa. Inserte la jeringa en la bomba. Nota: Considere el uso de otros desinfectantes. </li><li> Descongelar una dosis única de rAAV2 / 1 mCherry preparación (se recomienda 10 12 pfu) y mantenerlo en hielo. Llene la jeringa con la solución de virus. </li><li> Centrar la aguja en el bregma y luego insertar suavemente en el hipocampo utilizando las siguientes coordenadas: AP-2, ML +/- 1,0, -1 DV. Estas coordenadas se encuentran cerca del borde de la craneotomía. Esperar durante 5 minutos para que el tejido se estabilice. </li><li> Inyectar 0,7 l de la solución rAAV2 / 1 mCherry a razón de 50 nl / min. Esperar 10 min para que el virus se adsorbe completamente. Retire con cuidado la aguja. Seque con espuma de gel si se presenta sangrado. Repita con el sitio contralateral. </li></ol> 4. craneal ventana de implantación <ol><li> Coloque el cubreobjetos estéril, seca en la parte superior de la duramadre en el marco del círculo perforado. Mantenga el cubreobjetos con el forceps para aplanar suavemente la duramadre y llevar cubreobjetos &#39;bordes más cerca de la superficie del cráneo. Nota: Es posible que el cubreobjetos interrumpe el coágulo y se restablece el sangrado. Si ese es el caso, levantar el cubre objetos, colocarlo en el alcohol, secar y volver al paso 2.9. </li><li> Usando una aguja estéril aplicar el pegamento de cianoacrilato densa en los bordes de recubrimientos de vidrio para la fijación a la calavera. Espere a que el pegamento se seque. </li><li> Coloque una barra de fijación (tuerca M2 o un diseño hecho a medida) en la parte frontal del cráneo. Aplique el pegamento de cianoacrilato sobre los bordes de la barra. Espere a que el pegamento se seque. <ol><li> Colocar el gancho de fijación en una posición que permita el posicionamiento horizontal de la ventana del cráneo durante el diagnóstico por sesión. Colocarlo tan distantes como sea posible de la ventana. Si se coloca demasiado cerca de la ventana, la barra y el tornillo de conexión con el titular de la medida pueden suponer un obstáculo para el objetivo durante el proceso de formación de imágenes. </li></ol></li><li&gt; preparar el acrílico dental y aplicarlo sobre la superficie del cráneo alrededor del vaso. Es útil para formar una forma de cráter alrededor de la ventana. Se va a crear una cavidad para agua aplicada posteriormente para obtener imágenes con el objetivo de agua. </li><li> Crear un casquillo con el acrílico dental, que cubre el resto de la zona operativa, bordes de la piel, bar fijación, reforzando el cráter alrededor de la ventana craneal. Espere a que el cemento dental se endurezca. </li><li> Retire el animal del marco estereotáxico y ponerlo en la cámara de recuperación. </li><li> Espere a que el animal se recupere de la cirugía, mientras que la observación de las funciones fisiológicas. </li><li> Aplicar analgesia postoperatoria (carprofeno, 10 mg / kg) y el tratamiento de antibióticos (Baytril, 5 mg / kg) durante 48 horas. </li></ol> 5. Imaging <ol><li> Iniciar el Ti: Zafiro láser, encienda el microscopio. El sistema usado en este experimento está equipado con un láser de dos fotones, sistema OPO y PMT dual GaAsP. </li><li> El sacrificio del animal en el Inducy cámara de inducir la anestesia. </li><li> Retire el animal de la cámara de inducción y el lugar de la máscara de anestesia de gas bajo el microscopio. Disminuir el flujo de oxígeno a 0,3 L / min y la concentración de isoflurano al 1,5-2%. </li><li> Fijar el animal al pie del microscopio personalizado con un tornillo M2 (u otro sistema de medida). Nivelar la ventana del cráneo. Nota: Es posible utilizar el sistema de fijación de la cabeza del fabricante microscopio, aunque la trama personalizada específica da mejores resultados (mejora de la estabilidad de la cabeza, posicionamiento constante en varias sesiones durante un experimento crónica). </li><li> El uso de los ajustes del microscopio de campo amplio y un centro de objetivo de baja magnificación de la vista en uno de los lados de la corteza retroesplenial y enfocarla en la superficie cubreobjetos. </li><li> Aplicar una gota de agua en el pozo de acrílico en forma de cráter. Cambiar a un objetivo de inmersión en agua a larga distancia. Mover el objetivo hacia la ventana del cráneo hasta que el menisco con aguanecta la muestra y objetiva. </li><li> Cambiar a la configuración de dos fotones y comenzar a escanear la parte superior a la inferior muestra el uso del zoom más bajo. El cruce de la duramadre será visible como un reflejo de la señal no específica alta. </li><li> Ajuste la configuración de adquisición de microscopio en ambos canales (GFP y mCherry) de acuerdo con la intensidad de señal de las células fluorescentes con el fin de cubrir todo el rango dinámico. </li><li> Después de encontrar una neurona adecuada (con el árbol dendrítico separado de otras células) realizar una exploración inicial usando sólo el filterset GFP con zoom más baja y la distancia z de 5 micras. </li><li> Obtener una proyección máxima de la pila de escaneado e imprimirlo para las anotaciones (utilizando colores invertidos). </li><li> Ajuste el zoom a un valor que permita a la imagen de los detalles morfológicos deseados. Imagen entera del árbol dendrítico en los canales de GFP y mCherry utilizando máxima proyección como guía. </li></ol>

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Los autores (KL, MR, KR) tienen derechos de patente pendientes (PL410001) para el marco Holder utilizada en este artículo.

En el presente trabajo se presenta un protocolo para la utilización simultánea de dos fotones de imágenes in vivo de las entradas sinápticas y las metas post-sinápticas en RSC a través de una ventana del cráneo. El procedimiento de implantación consiste en varios pasos clave. En primer lugar, el animal se anestesió profundamente y se fija en el marco estereotáctico, entonces el cráneo sobre RSC se adelgaza con un taladro a lo largo de las líneas circulares marcados y se retira el hueso circular. Después se detiene la hemorragia, la rAAV2 / 1 mCherry se inyecta en el hipocampo, y la cubierta de vidrio se fija en el cráneo sobre el área perforado. Por último la barra de fijación está asegurado en la cabeza y el animal se coloca en la cámara de recuperación de 48 hr. Después de aproximadamente 2-3 semanas necesarios para la expresión del virus, la RSC puede ser visualizado. El protocolo de formación de imágenes se compone de los siguientes pasos. En primer lugar, el animal se anestesia y se fija bajo el microscopio. El foco se establece a continuación, utilizando el microscopio de campo amplio, el sistema es conmutadoencend da en el modo de dos fotones y los canales de interés (GFP) y mCherry se visualizan. La técnica presentada ofrece una mejora importante con respecto a los protocolos descritos anteriormente. En el enfoque estándar, sólo un tipo de una etiqueta podría ser detectado. Podría ser utilizado para imagen local proyecciones axonales y árboles dendríticas, pero no hay estudios de conectividad de largo alcance fuera posible. Mediante la combinación de dos proteínas fluorescentes que habilitado el seguimiento simultáneo de elementos pre y postsinápticos. Esto permite a largo plazo en el seguimiento in vivo de las conexiones sinápticas putativos. Con el fin de obtener los resultados óptimos en el procedimiento descrito, es importante prestar atención a varios pasos críticos. Durante la elevación del círculo de hueso en el paso 2.8 cualquier daño a la duramadre puede causar inflamación y afectar la transparencia de la ventana craneal. paro insuficiente de sangrado en el paso 2.9 o en cualquier otro paso del procedimiento se traduce en la sangre accumulation debajo de la ventana y reduce significativamente el campo de visión. Después de inyectar el virus es de vital importancia que esperar por lo menos 10 min antes de retirar la aguja, para que el virus de infundir en el tejido sólo en el sitio de la inyección. Se limita la posibilidad de infección no deseada de la corteza con el virus durante la extracción de la aguja. El área de la transfección viral debe ser examinado con un análisis histológico post hoc del tejido cerebral. Cualquier expresión mCherry en las células a lo largo de la traza de la aguja debe ser evitado. El tiempo de recuperación estándar es de 3 semanas. Este período es suficiente para que el virus para alcanzar la expresión estable en las proyecciones sinápticas y para la ventana craneal para curar completamente y estabilizar. Los animales deben ser alojados individualmente con el fin de evitar la extracción del implante ventana del cráneo por los compañeros de jaula. El uso de una jaula ampliada podría considerarse con el fin de evitar el daño accidental de la ventana craneal por golpear las barras de metal. una fijación estable del mouSE bajo el microscopio es esencial. Cualquier movimiento de la cabeza, incluyendo los movimientos de respiración, puede causar una reducción significativa en la calidad de las imágenes obtenidas. También es útil para colocar la ventana del cráneo horizontalmente hacia el objetivo, para limitar posibles problemas con la adquisición de la misma atención para todo el plano de la ventana. criterios claros para la resolución de espinas y boutons deben aplicarse. Generalmente, boutons se definen como inflamaciones axonales que tienen un diámetro de al menos 3 veces más grande que la fibra anterior 7. Las espinas se definen como protuberancias claramente distinguibles desde el eje de dendritas que contiene una cabeza bulbosa. Además división en poblaciones de fina, rechoncha, champiñones y espinas ramificadas es posible 3. Debido a la resolución axial relativamente pobre de la microscopía de dos fotones, el análisis de las espinas que se proyectan a lo largo del eje óptico debe evitarse 3. Con el fin de distinguir claramente boutons espinas y funcionales, un post hoc immunolabelingse puede realizar con el fin de identificar marcadores pre y postsinápticos 7. Aunque el protocolo presentado resultó ser la más favorable en nuestros diseños experimentales, es posible modificarla con el fin de adaptarse a diferentes objetivos experimentales. A veces es más adecuado utilizar anestesia inyectable (como la ketamina-xilasina) en lugar de isoflurano, pero es importante para ajustar adecuadamente la dosis, teniendo en cuenta las diferencias en la susceptibilidad al fármaco entre los ratones de diferentes cepas, la edad y el sexo. Es posible utilizar un trépano en lugar de uno esférica para la perforación, pero podría aumentar el riesgo de daños a la dura. La solución salina estéril se puede sustituir con éxito con líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF), pero es importante para mantenerla estéril en todo momento durante la preparación y funcionamiento. ACSF es estable durante 3-4 semanas después de la preparación, y si se produce cualquier contaminación antes de este tiempo debe desecharse inmediatamente. Diferentes DE FIJACIÓN cabezaen los dispositivos se pueden aplicar, dependiendo del diseño experimental, incluyendo la posibilidad de observar el ratón despierto bajo el microscopio de dos fotones. Como cualquier otra técnica, éste también tiene sus limitaciones. El microscopio de dos fotones permite la visualización del cerebro tejido hasta 500 micras de profundidad de la superficie dura. Para el examen de las estructuras cerebrales profundas modificaciones adicionales deben aplicarse. El protocolo permite el acceso a la mayor parte de RSC, pero la parte de la estructura oculta bajo el seno sagital superior todavía no es accesible. La resolución del microscopio de dos fotones no es suficiente para la identificación de una sinapsis específica, así como el análisis morfológico detallada de las espinas dendríticas. técnicas adicionales, tales como la microscopía electrónica correlativa se deben aplicar con el fin de confirmar la existencia de una estructura de sospecha. También es importante mencionar que esta es una técnica quirúrgica relativamente difícil y no es recommended para un operador inexperto. La técnica presentada puede ser aplicado en una amplia gama de experimentos. Puede ser modificado para la investigación de diferentes regiones del cerebro accesibles con el microscopio de dos fotones. Se permite la monitorización simultánea de axonal y alteraciones dendríticas durante la variedad de estados fisiológicos y patológicos, incluyendo los procesos cognitivos y el envejecimiento o la progresión de enfermedades neurológicas y trastornos psiquiátricos. Permite el uso de promotores específicos de células para visualizar proyecciones que se originan en subconjuntos neuronales definidas con precisión. También se puede ajustar para adaptarse a los protocolos de experimentos en animales despiertos y se comportan. Además, las proteínas sensibles al pH del calcio o pueden ser expresados ​​en el cerebro con el fin de visualizar no sólo la morfología neuronal, sino también los cambios en la actividad de las células y la función. Otra posible modificación del enfoque es el uso de un serotipo diferente rAAV para la expresión mCherry. El quimérico pr 2/1 serotipoovides sólida expresión en el sitio de la inyección con un inicio bastante rápida (2-3 semanas). Los niveles mCherry permanecieron estables durante al menos 12 semanas después de la aparición inicial y no se detectó el etiquetado retrógrada en nuestros experimentos. Con el fin de obtener el etiquetado retrógrada, un serotipo diferente podría ser utilizado, tal como rAAV9. Las sesiones de formación de imágenes se pueden realizar en cualquier frecuencia, sin embargo, al menos, intervalo de 24 h se recomienda con el fin de permitir la recuperación adecuada del animal después de la anestesia. Si se aplica correctamente, esta técnica permite la realización de múltiples sesiones de formación de imágenes de la misma región en el transcurso de varios meses. Para los experimentos a largo plazo (más de 6 meses), un sistema Cre / loxP se puede utilizar con la recombinasa entregado con el vector de AAV en una línea de GFP ratón floxed.

microscopía de dos fotones revolucionó la observación de la actividad cerebral en vivir y comportarse animales. Desde su introducción en 1990, rápidamente ganó popularidad y ahora se implementa como uno de los enfoques más interesantes e innovadores en el examen de numerosos aspectos de la actividad cerebral in vivo 1,2. Estas aplicaciones incluyen las mediciones de flujo de sangre, la activación neuronal (por ejemplo, utilizando indicadores de nivel de calcio o genes tempranos inmediatos de expresión) y la morfología de las células neuronales. Un número creciente de laboratorios utilizan microscopios de dos fotones, la aplicación de la técnica en todo el mundo científico como un nuevo estándar para las imágenes del cerebro in vivo. El método estándar consiste en la implantación de la ventana del cráneo (un agujero redondo en el cráneo cubierto con una tapa de vidrio) sobre el barril o la corteza visual del cerebro del ratón 3. A continuación, dependiendo del protocolo experimental, el mouse somete a una serie de visualización y las sesiones de entrenamiento de comportamiento, lo que permite controlar los cambios en la actividad cerebral y la morfología neuronal en el tiempo 4,5. En ambos casos la craneotomía sólo afecta el hueso parietal, sin cruzar las suturas. Se cree ampliamente que el principal inconveniente de la técnica es su limitada aplicación a cortezas fácilmente accesibles, tales como el barril o de la corteza visual. La implantación de la ventana del cráneo sobre otras regiones plantea muchas dificultades, debido a un sangrado excesivo y / u obstáculo espacial. En este artículo se propone la implantación de la ventana del cráneo por encima de la corteza retroesplenial (RSC) como otra posible zona de interés para los dos fotones en la microscopía in vivo 6. RSC es un elemento importante del circuito cerebral responsable de la formación de la memoria espacial. Anatómicamente, RSC es una parte de una red neuronal de conexión cortical, del hipocampo, y las regiones talámicas 7. Esmuy involucrado en una serie de comportamientos, tales como el aprendizaje espacial y la extinción, así como la navegación espacial 6. Con el fin de visualizar los cambios morfológicos de las neuronas que utilizamos una línea de ratón transgénico que expresa la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el promotor thy1. En estos ratones, GFP se expresa en aproximadamente el 10% de las neuronas en el cerebro que permiten una visualización clara de los axones y dendritas corticales utilizando microscopía de dos fotones 8. Otra innovación que proponemos es la inyección de un serotipo recombinante adeno-asociado virus 2/1 (rAAV2 / 1) que codifica una proteína fluorescente de color rojo (mCherry) bajo un promotor específico de neuronas CaMKII 9 en las estructuras más profundas del cerebro que se proyectan hacia RSC , tales como el hipocampo. La expresión de rAAV2 / 1 mCherry en el hipocampo de ratón Thy1-GFP permite la visualización simultánea de elementos pre y postsinápticos del Hippocampo-Cortical 10 sinapsis. La expresión impulsada por el rAAV de mCherry requiere dos a tres semanas para la proteína para alcanzar el nivel suficiente en los terminales axonales. Este período es consistente con el tiempo usual requerido para la recuperación de la craneotomía.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Drug&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>5-2% pre-operative</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>1.5-2% during surgery</td></tr><tr><td>Dexametasone</td><td>Scan Vet</td><td>Dexasone 2mg/ml</td><td>0.2 mg/kg intramuscular</td></tr><tr><td>Baytril</td><td>Bayer</td><td>2.50%</td><td>5 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Tolfedine</td><td>Vetoquinol</td><td>4%</td><td>4 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Butomidor</td><td>Richter Pharma</td><td>10 mg/ml</td><td>2 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>KRKA-Polska</td><td>Rycarfa 50mg/ml</td><td>10 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>Jelfa</td><td>Lignocainum</td><td>topically</td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>Jelfa</td><td>20 mg/g</td><td>topically</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Surgery&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Ethicon</td><td>Spongostan dental; REF MS0005</td><td></td></tr><tr><td>Eye ointment</td><td>Dedra</td><td>Lubrithal</td><td>topically</td></tr><tr><td>CA glue</td><td>Pelikan Daniel</td><td>20G Huste</td><td></td></tr><tr><td>Dental acrylic</td><td>SpofaDental</td><td>Duracryl Plus</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic frame</td><td>Stoelting</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tool&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverglass</td><td>Harvard Apparatus</td><td>HSE-64-0720</td><td>3 mm diameter</td></tr><tr><td>Dental drill</td><td>Sigmed</td><td>Keystone KVet</td><td></td></tr><tr><td>Fixation bar</td><td>Custom made</td><td>N/A</td><td>M2 or M3 screw nuts could be used</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Renex</td><td>PN-7B-SA</td><td></td></tr><tr><td>Micro scissors</td><td>Falcon</td><td>BM.183.180</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>KOZO</td><td>XTL6445T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Imaging&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Holder frame</td><td>Custom made</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Two-photon microscope</td><td>Zeiss</td><td>Upright Axio Examiner Z1</td><td>Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Virus</td><td>gift from K. Deisseroth</td><td></td><td>Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter</td></tr></tbody></table>

simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

La expresión de GFP en un subconjunto de neuronas en el ratón reportero Thy1-GFP permite imágenes in vivo de las dendritas corticales y proyecciones axonales locales en RSC. La Figura 1A muestra la máxima proyección de una pila de imágenes con múltiples dendritas GFP-positivas visibles. El cuerpo de la célula es oscurecida por una arteria. La Figura 1B muestra una imagen ampliada de un solo plano (zoom digital 3x) de la rama dendrítica se indica en 1A. Los detalles de la morfología dendrítica (espinas, filopodios) son claramente visibles. El canal de GFP se adquiere mediante el filtro de paso de banda de emisión de 500-550 nm. Una inyección de la rAAV2 / 1 mCherry en el hipocampo dorsal permite la visualización de los axones del hipocampo y botones sinápticos que terminan en RSC. Estos terminales pueden ser detectados en el canal mCherry (la emisión de paso de banda de filtro 570 a 610 nm). Figura 1. Dos canales vivo de dos fotones de imágenes de las neuronas del hipocampo de RSC y proyecciones a RSC en. (A) Una visión general de las células que expresan GFP en un fragmento de la RSC (imagen mostrada en colores invertidos). proyección máxima que se muestra de una pila de espesor 100 micras tomada a bajo aumento (zoom digital de 0,7x). (B) plano óptico individual del fragmento indicado en (a) adquiridos a gran aumento (zoom digital 3x) en el canal de GFP. (C) fragmento plano óptico individual se indica en (A) utilizando los ajustes de adquisición mCherry. Véase el Protocolo para los detalles de los filtros de detección. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53528/53528fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultánea de dos fotones<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de entradas sinápticas y Objetivos postsinápticos en la corteza del ratón retroesplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

11.4K vistas.  Nencki Institute of Experimental Biology. This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Video: Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

Etiquetado dirigida de neuronas en una versión concreta de Micro-funcional de dominio de la neocorteza por combinar la señal intrínseca e Imagen de dos fotones

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

Investigación

Neurociencias

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo de dos fotones de imágenes de dependientes Experience-Los cambios moleculares en las neuronas corticales

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

Imágenes longitudinales de dos fotones del hipocampo dorsal CA1 en ratones vivos

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

Comportamiento

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

De dos fotones<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón Usando un Diluido-cráneo Preparación

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imágenes de la actividad neuronal en la corteza somatosensorial primaria usando Thy1-ratones transgénicos GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Imágenes transpupilares de dos fotones in vivo de la retina del ratón

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

<a href='https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61970/transpupillary-two-photon-in-vivo-imaging-of-the-mouse-retina'>Source: Wang, Z., et al.&#160;Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp.&#160;(2021).</a>This video demonstrates a technique for in vivo retinal imaging using two-photon microscopy. Anesthetized mice are prepared for imaging by securing their heads, Applying eye lubricant, and placing a coverslip over the eye. Retinal ganglion cells (RGCs) expressing fluorescent proteins are first visualized using epifluorescence for alignment. Finally, two-photon imaging is employed, allowing for high-resolution visualization of RGCs.

Source: Wang, Z., et al.&#160;Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp.&#160;(2021).This video demonstrates a technique ...

Simultánea de dos fotones

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