仕事は、バイオ テクノロジー ・生物科学研究会議 [アリフールに BB/N005759/1] によって支えられました。NRFH、Rosetrees 信託し、信託 Stoneygate によって資金が供給された [A1130/M546]。ツァイス Elyra PS.1 顕微鏡、処理コンピューターおよびソフトウェアは BBSRC BB/L013827/1 (学際的な超解像度顕微鏡施設ノッティンガム大学助成) によって賄われていた

1 共焦点画像の生成 <ol><li>シトシンの変更された形態の分析に備えて、免疫組織染色 Abakir et al. による記述で実行。 34.</li> <li>顕微鏡を用いたイメージングをスライドの実施し、LSM 形式でファイルを保存します 。
	注: ときの強度を比較するプロファイル サンプル間レーザー パワーとゲインをチャンネルごとに使用する値画像解析段階での直接比較を可能にするための手順を取って画像全体維持する必要があります</li>。
</ol> 2。2.5 D 強度プロットの生成 <ol><li>(例えば ゼン ・ ブラック) ソフトウェアを開き、選択 &#39; 画像処理 &#39;.</li>
	<li>は [ファイル] メニューに移動し、開くを選択します。処理が必要なイメージを選択します</li>。
	<li>つけ &#39; すべて表示 &#39; すべてのグラフィカル コントロールを表示する画像の下。画面の下半分には、3 つのタブ;&#39; 寸法 &#39;、&#39; 表示 &#39; と &#39; グラフィック &#39;、選択、&#39; グラフィック &#39; タブ
	<ol><li>の選択、&#39; の四角形 &#39; 核/関心の領域を選択するためのツール</li>。
		<li>選択 &#39; 領域をカット &#39; 画像をトリミングします。これは別タブでトリミング領域の新しいイメージを生成する</li>
		<li>ファイル メニューに移動、ファイル名前を付けて与える保存の選択し、LSM または CZI ファイルとして保存します</li>。
	</ol></li> <li>ソフトウェア (例えば 禅青) を開き、選択、&#39; 禅デスク &#39;.</li>
	<li>はファイルを選択して [ファイル] メニューをクリックすると、ゼン ・ ブラックから禅青にトリミングされた画像を送信し、禅 2012年青版に送信を選択します。トリミングされた画像は、適切なプログラムを開きします 。
	注: イメージ ファイルが転送される禅ブラック 2012 年に 2.5 D 強度プロット機能に複数チャンネルの画像が同時に表示されないためです</li>。
	<li>画像の左側にラベル タブを選択 &#39; 2.5 D &#39;、2.5 d 画像の可視化します。クリックして &#39; すべて表示 &#39; すべてのグラフィカル コントロールを表示する</li>。
	<li>左と画像の下に位置しています 4 つの灰色のバーを使用して可視化設定を変更します 。
	注: 左手バー、トップ画面のズームを =。画面の一番下、左手バー = 軸上のターンのイメージ。手を左画面の下部バー = イメージの回転。手バー = 拡大し、スケール バーの契約直後に、画面の下部</li>。
	<li>選択したレンダリング モードは、これは個々 のピークの最高の可視化により、表面を確認します</li>。
	<li>グリッド距離を変える割合より低い割合を変更してよりは各々 の個々 のピークを定義します</li>。
	2.5 次元画像を保存する <li>は、まず 2.5 D プロットの下の灰色の矢印をクリックして右側に、画像の下のグラフィカル ツールのファイルの一覧を非表示 (横に &#39; すべて表示 &#39;)、これはがれを記入できるように展開するイメージのグラフィック タブを非表示(名)、2.5 D のプロットを保存するキーを押します、&#39; PrtSc &#39; キーボードのキー。これは、ディスプレイのスクリーン ショットをキャプチャします。Microsoft ペイントでスクリーン ショットを貼り付け、保存する前に画像をトリミングします</li>。
</ol> 3。強度プロファイル <ol><li>(例えば ゼン ・ ブラック) ソフトウェアを開き、画像の処理を選択します</li>。
	<li>は [ファイル] メニューに移動し、開くを選択します。処理が必要なイメージを選択します</li>。
	<li>画像の左側にラベル タブを選択画像が画面に表示されます、&#39; プロファイル &#39;.</li>
	<li>下にある画面の半分は (ダニ) を選択、&#39; すべて表示 &#39;] タブ。これはすべての書式設定オプションへのアクセスを有効にします</li>。
	<li>画面の下半分には、3 つのタブ; &#39; 寸法 &#39;、&#39; 表示 &#39; と &#39; ProfileƆ 選択 &#39; プロファイル &#39; (ダニ) を選択し、&#39; テーブル &#39; ボックス。選択、&#39; 矢印 &#39; ボタン</li>。
	<li>画像の開始点を選択し、セルの連続的な数をマウスでドラッグするマウスを使用しています。ラインに沿って細胞の強度プロットを生成するマウス ボタンを離しますさらにテーブルは、各波長の線に沿ってピクセル強度測定データで作成されます 。
	注: テーブルはどのピクセルで赤、緑、青の蛍光の強度が読み込まれ距離 (μ m) を提供します</li>。
	<li>このデータをエクスポートするテーブルの選択を右クリックして &#39; 保存テーブル &#8230; &#39; .txt ファイルとして適切な場所に保存します</li>。
	ファイル メニューを選択し、選択した強度プロファイル イメージを保存する <li>&#39; 輸出 &#8230; &#39;。ポップアップ ウィンドウで選択 &#39; タグ付きのイメージ ファイル (形式) &#39; と &#39; 画像ウィンドウの内容 - 単一ペイン (データ) &#39; クリックして &#39; ファイル名を選択し、保存 &#8230; &#39; の適切な場所を選択し、クリックして &#39; 保存 &#39;.</li>
	<li>の視野と分析するプロファイルの数に応じて個々 の強度プロファイルごとにプロセスを繰り返します</li>。
	<li>インポート強度プロファイル (3.7 を参照) 保存されたデータと統計分析に続いてスプレッドシートで分析します</li>。
</ol> 4。共局在解析 <ol><li>ソフトウェアを開き、選択 &#39; 画像処理 &#39;.</li>
	<li>は [ファイル] メニューに移動し、開くを選択します。処理が必要なイメージを選択します</li>。
	<li>イメージの左側にラベル タブを選択、画像が画面に表示されます &#39; Coloc &#39;.</li>
	<li>下にある画面の半分は (ダニ) を選択、&#39; すべて表示 &#39;] タブ。これはすべての書式設定オプションへのアクセスを有効にします</li>。
	<li>画面の下半分では、4 つのタブ; &#39; 寸法 &#39;、&#39; 表示 &#39;、&#39; グラフィック &#39; と &#39; ColocalizationƆ 選択 &#39; 共存 &#39; のボックスをチェックし、&#39; テーブル &#39; と &#39; 画像 &#39;.
	<ol><li>このタブ (ツール上マウスを置いたときにテキストが表示されます閉じるベジエ) の上部に沿って 3 番目のアイコン、単一核を取り囲むようにこのツールを使用、この核は値、テーブルに表示を選択します 。
		注: 各丸核画面の左側のパネルで可視化した蛍光グリーンと赤の散布が生成されます。軸には、ゲートのしきい値に応じて細胞をするために移動します。興味の核を画像で手動で選択すると、0 より大きいゲートのしきい値を調整する必要はありません。核の周囲の内で観察されたすべてのピクセル強度値は、肯定的な信号としてと見なされます</li>。
	</ol></li> <li>] タブの 3 番目のアイコンを選択して、データセットが完了するまで後続の核を取り囲むによりこのプロセスを繰り返します</li>。
	<li>このデータをエクスポートするテーブルを右クリックして、保存テーブルを選択し、適切な場所に保存します</li>。
	<li>共存イメージを保存するファイル メニューを選択し、選択 &#39; 輸出 &#8230; &#39; を選択。タグ付きのイメージ ファイル (形式) と &#39; 画像ウィンドウの内容 &#8211; 1 つの平面 (データ) &#39; クリックして &#39; ファイル名を選択し、保存 &#8230; &#39;、適切な場所を選択してクリックして &#39; 保存 &#39;.</li>
	<li>統計解析に続いてスプレッドシートの共存に関する研究データをプロットします</li>。
</ol>

<ol>
	<li>Bird, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+restriction+enzymes+to+study+eukaryotic+DNA+methylation:+II.+The+symmetry+of+methylated+sites+supports+semi-conservative+copying+of+the+methylation+pattern.">Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: II. The symmetry of methylated sites supports semi-conservative copying of the methylation pattern.</a> J Mol Biol. 118 (1), 49-60 (1978).</li><li>Youssoufian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+mutations+in+haemophilia+A+give+evidence+for+CpG+mutation+hotspots.">Recurrent mutations in haemophilia A give evidence for CpG mutation hotspots.</a> Nature. 324 (6095), 380-382 (1985).</li><li>Holliday, R., Pugh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+modification+mechanisms+and+gene+activity+during+development.">DNA modification mechanisms and gene activity during development.</a> Cold Spring Harbor Monograph Series. 32, 639-645 (1996).</li><li>Christman, J. K., Price, P., Pedrinan, L., Acs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+hypomethylation+of+DNA+and+expression+of+globin+genes+in+Friend+erythroleukemia+cells.">Correlation between hypomethylation of DNA and expression of globin genes in Friend erythroleukemia cells.</a> European J Biochem. 81 (1), 53-61 (1977).</li><li>Bird, A. P., Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+restriction+enzymes+to+study+eukaryotic+DNA+methylation:+I.+The+methylation+pattern+in+ribosomal+DNA+from+Xenopus+laevis.">Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: I. The methylation pattern in ribosomal DNA from Xenopus laevis.</a> J Mol Biol. 118 (1), 27-47 (1978).</li><li>Kim, G. D., Ni, J., Kelesoglu, N., Roberts, R. J., Pradhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-operation+and+communication+between+the+human+maintenance+and+de+novo+DNA+(cytosine-5)+methyltransferases.">Co-operation and communication between the human maintenance and de novo DNA (cytosine-5) methyltransferases.</a> EMBO J. 21 (15), 4183-4195 (2002).</li><li>Reik, W., Kelsey, G., Walter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+de+novo+methylation.">Dissecting de novo methylation.</a> Nature genetics. 23 (4), 380-382 (1999).</li><li>Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methyltransferases+Dnmt3a+and+Dnmt3b+are+essential+for+de+novo+methylation+and+mammalian+development.">DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development.</a> Cell. 99 (3), 247-257 (1999).</li><li>Eckhardt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+profiling+of+human+chromosomes+6,+20+and+22.">DNA methylation profiling of human chromosomes 6, 20 and 22.</a> Nat Genet. 38 (12), 1378-1385 (2006).</li><li>Lees-Murdock, D. J., Lau, H. -. T., Castrillon, D. H., De Felici, M., Walsh, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methyltransferase+loading,+but+not+de+novo+methylation,+is+an+oocyte-autonomous+process+stimulated+by+SCF+signalling.">DNA methyltransferase loading, but not de novo methylation, is an oocyte-autonomous process stimulated by SCF signalling.</a> Dev Biol. 321 (1), 238-250 (2008).</li><li>Leonhardt, H., Page, A. W., Weier, H. -. U., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeting+sequence+directs+DNA+methyltransferase+to+sites+of+DNA+replication+in+mammalian+nuclei.">A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei.</a> Cell. 71 (5), 865-873 (1992).</li><li>Jones, P. A., Taylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+differentiation,+cytidine+analogs+and+DNA+methylation.">Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation.</a> Cell. 20 (1), 85-93 (1980).</li><li>J&#228;hner, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA methylation: DNA Methylation in Early mammalian Development. , 189-219 (1984).</li><li>Chalitchagorn, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+pattern+of+LINE-1+methylation+level+in+normal+tissues+and+the+association+with+carcinogenesis.">Distinctive pattern of LINE-1 methylation level in normal tissues and the association with carcinogenesis.</a> Oncogene. 23 (54), 8841-8846 (2004).</li><li>Fatemi, M., Hermann, A., Gowher, H., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnmt3a+and+Dnmt1+functionally+cooperate+during+de+novo+methylation+of+DNA.">Dnmt3a and Dnmt1 functionally cooperate during de novo methylation of DNA.</a> Eur J Biochem. 269 (20), 4981-4984 (2002).</li><li>Gruenbaum, Y., Cedar, H., Razin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+and+sequence+specificity+of+a+eukaryotic+DNA+methylase.">Substrate and sequence specificity of a eukaryotic DNA methylase.</a> Nature. 295 (5850), 620-622 (1982).</li><li>Dean, W., Santos, F., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+in+early+mammalian+development+and+following+somatic+nuclear+transfer.">Epigenetic reprogramming in early mammalian development and following somatic nuclear transfer.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology (Elsevier). 14 (1), 93-100 (2003).</li><li>Wu, S. C., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+DNA+demethylation:+many+roads+lead+to+Rome.">Active DNA demethylation: many roads lead to Rome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (9), 607-620 (2010).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+proteins+can+convert+5-methylcytosine+to+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine.">Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine.</a> Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).</li><li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li><li>Bachman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Formylcytosine+can+be+a+stable+DNA+modification+in+mammals.">5-Formylcytosine can be a stable DNA modification in mammals.</a> Nat Chem Biol. 11 (8), 555-557 (2015).</li><li>Bachman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine+is+a+predominantly+stable+DNA+modification.">5-Hydroxymethylcytosine is a predominantly stable DNA modification.</a> Nat Chem. 6 (12), 1049-1055 (2014).</li><li>Lurlaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome-wide+profiling+reveals+a+tissue-specific+role+for+5-formylcytosine.">In vivo genome-wide profiling reveals a tissue-specific role for 5-formylcytosine.</a> Genome Biol. 17 (1), 141 (2016).</li><li>Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributive+Processing+by+the+Iron+(II)/&#945;-Ketoglutarate-Dependent+Catalytic+Domains+of+the+TET+Enzymes+Is+Consistent+with+Epigenetic+Roles+for+Oxidized+5-Methylcytosine+Bases.">Distributive Processing by the Iron (II)/&#945;-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases.</a> J Am Chem Soc. 138 (30), 9345-9348 (2016).</li><li>He, Y. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA.">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li><li>Herman, J. G., Graff, J. R., My&#246;h&#228;nen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation-specific+PCR:+a+novel+PCR+assay+for+methylation+status+of+CpG+islands.">Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.</a> Proc Natl Acad Sci. 93 (18), 9821-9826 (1996).</li><li>Nagae, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+demethylation+in+CpG-poor+promoters+during+cellular+differentiation.">Tissue-specific demethylation in CpG-poor promoters during cellular differentiation.</a> Hum Mol Genet. 20 (14), 2710-2721 (2011).</li><li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+5-hydroxymethylcytosine+in+mouse+ES+cells+and+during+differentiation.">Dynamic regulation of 5-hydroxymethylcytosine in mouse ES cells and during differentiation.</a> Nature. 473 (7347), 398-402 (2011).</li><li>Jin, S. -. G., Wu, X., Li, A. X., Pfeifer, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+the+human+brain.">Genomic mapping of 5-hydroxymethylcytosine in the human brain.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 5015-5024 (2011).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundant+DNA+6mA+methylation+during+early+embryogenesis+of+zebrafish+and+pig.">Abundant DNA 6mA methylation during early embryogenesis of zebrafish and pig.</a> Nat Commun. 7, (2016).</li><li>Wu, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+on+N6-adenine+in+embryonic+stem+cells.">DNA methylation on N6-adenine in embryonic stem cells.</a> Nature. 532 (7599), 329-333 (2016).</li><li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain.">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324 (5929), 929-930 (2009).</li><li>Globisch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine+and+search+for+active+demethylation+intermediates.">Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates.</a> PloS one. 5 (12), e15367 (2010).</li><li>Abakir, A., Wheldon, L. M., Ruzov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Epigenetic Methods in Neuroscience Research: Immunohistochemical Detection of Oxidized Forms of 5-Methylcytosine in Embryonic and Adult Brain Tissue. , 125-137 (2016).</li><li>Alioui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Carboxylcytosine+is+localized+to+euchromatic+regions+in+the+nuclei+of+follicular+cells+in+axolotl+ovary.">5-Carboxylcytosine is localized to euchromatic regions in the nuclei of follicular cells in axolotl ovary.</a> Nucleus. 3 (6), 565-569 (2012).</li><li>Chen, Y., Damayanti, N., Irudayaraj, J., Dunn, K., Zhou, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+two+forms+of+DNA+methylation+in+the+brain.">Diversity of two forms of DNA methylation in the brain.</a> Front Genet. 5, 46 (2014).</li><li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy.">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C723-C742 (2011).</li><li>Lachmanovich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-localization+analysis+of+complex+formation+among+membrane+proteins+by+computerized+fluorescence+microscopy:+application+to+immunofluorescence+co-patching+studies.">Co-localization analysis of complex formation among membrane proteins by computerized fluorescence microscopy: application to immunofluorescence co-patching studies.</a> J Microsc. 212 (Pt 2), 122-131 (2003).</li></ol>

いいえ利害対立の可能性を明らかにされました。

このプロトコルでは、核内で DNA 変更の視覚的な表現を生成する段階的なプロセスについて説明します。ながらインパクトの強い、敏感なこれらの技術は制限数を所有しています。
2.5 D から生成されたデータのプロット、信号強度分布と共局在解析、自然の半定量を強調する必要があります。おかげでレーザー走査型共焦点顕微鏡の画像集録中にサンプルのポイント照明、各チャンネルの信号強度が記録されます。しかし、これらは 5hmC の絶対的な大きさではない、5caC が検出されたとだけ表現の有無またはこれらのエピゲノムのスケールの徴候。
信号増幅の反復的な性質のため必然的に信号を高めるために適用される機械の大きさと一貫性のある制限は、これらのマークの34の本当の物理的なゲノム占有の近似を混同します。これらのマークの実際のゲノムのローカリゼーションは、物理的に 200-300 nm34の最適な共焦点の解像度制限でも解決できない領域を占めるこれらのかさばる蛋白質によって隠される可能性があります。また、抗体の感度や fluorophore 活用34の違いによってお互いにそれぞれのマークの個々 のチャンネルの信号強度を比較できません。しかしゲノムのマークの時空間ダイナミクスのライトを取除くイメージングで得られた情報。
5hmC と 5caC の信号の正確な定量の核が強調され、明確に読み手に分析される領域境界を定める DAPI の対比染色に対して包囲します。この手順は、バック グラウンド ノイズを無視して核1を選択する手動プロセスによって、ゲートのしきい値を調整するための要件を分配します。核分割実行するを可能にする最新のソフトウェアでは、この工程の自動化を実現できます。無料の代替ソフトウェア パッケージなど、フィジー共局在解析、バイナリ 8 ビット形式に画像を変換するための要件などの欠点がありますしながらマスキング画像の領域を選択するサイズ除外データを入力する興味があり制限、このプログラムへのユーザー アクセス。さらに、全体的な限定 5hmC と一般的にユークロマチン領域、ゲノムの CpG 配列の枯渇の優勢な場所と相まってゲノムで 5caC のレベルを考えると、核のマニュアル包囲はユーザー バイアスを紹介します。したがって、自動的に核の強調表示は肯定する区画の地域内で発生するすべてのイベントを前提としています、存在できる背景のピクセルを無視します。したがって、ピクセル強度に基づく画像の分析はより意味のある可能性があります。これらの要因が重要な前提としているピアソンの相関係数に反対すると、信号強度に関係なく、2 つの信号間の空間的重なりの度合いを分析するマンダーの共存係数の使用を検討する際、信号の線形関係は。
全体的に、ここで説明した技術は、直感的な形式で生物学的データの視覚的表現のテーマを運ぶ。半定量的画像解析感度または単一の基本解像度ゲノムの観点から質量分析法などの強力な技術に取って代わることはできませんしながら広い配列する仮説と推論を許可する補完的なデータを提供精密画像の解析から誕生します。

DNA のメチル化、転写制御に関連付けられているよくとり上げられるメカニズムが伴います、5'-シトシン-リン-グアニン - 3 チトジンの残余の変更 ' メチル グループの付加によって (CpG) 型コンテキスト (-CH3) 5-5-メチルシトシン (5mC)1を形成するシトシンのピリミジン環の炭素原子。哺乳類で、消耗して自発的にアミノにチミン25mC 変異原性傾向のおかげでこの回文シーケンスのゲノムの 1% だけを構成する Cpg の約 70% がメチル化します。遺伝子プロモータ配列のメチル グループの存在は、脊椎動物3,4、5の転写抑制と強い相関を示します。非常に節約された DNA メチルトランスフェラーゼ (DNMT) 酵素 DNMT3a、3 b と 3 L、および DNMT1 ・ デ ・ ノボと維持メチル化のコンテキストで CpG シトシンをそれぞれ変更によってこれらのメチル グループの付加を触媒6。DNMT3A/B 式が胚性幹細胞と胚盤葉上層の開発中に昇格します。しかし次の分化8体細胞運命に多能性細胞分化系列決定その減少の発現が観察されます。機能の冗長性を共有しながら DNMT3a と 3b はマウス胚における一様検出 3 a が次と絨毛外胚葉組織8に主にローカライズされた 3b 組織特異的発現パターンを表示します。
メチル化署名は、有糸分裂と減数分裂の10時に継承できます。維持メチル化は、CpG チトジンの残余の二本鎖 DNA11の回文のヘミメチル化で既存の容易に DNMT1 の変更を伴います。DNMT1 の結合 DNA 複製フォーク11とその結果、ゲノムのメチル化レベル12細胞周期の S 期のピーク。DNMT1 現在未変更シトシンにより新たに合成された DNA 鎖を区別する x 染色体の不活性化を推進、転写抑制プロファイル13を維持することでメチル化します。ヘミメチル化 DNA の CpG 配列の認識、DNMT1 はde novo長い散在している核要素 1 (行 1) のメチル化の例:抑圧によって画定のメチル化の確立されたパターンを維持します。その潜在的発癌性伝搬14を阻害するレトロトランスポゾン プロモーター。DNMT1 できます緊急de novoのメチル化役割15 DNMT3a/b -/-の変異細胞の非メチル化 CpG アイランド (CGI) シーケンスをメチル化ヘミメチル化 DNA 優遇結合親和性を有するものの.したがって、DNA 複製16半保守的な性質により維持メチル化は、娘細胞17に親からメチル化署名を忠実に要約することができます。
ただし、遺伝子のと、式を動的に変調、抑圧的なメチル化修飾を消去する必要がありますはパッシブとアクティブの脱メチル化機構18によって達成することができます。ジオキシゲナーゼ蛋白質の保存ファミリーに属する 10-11 Translocase (テト) 蛋白質は、CpG 残基19上のメチル グループの反復的な酸化が可能です。トリパノソーマ bruceiiで発見された J ベース結合蛋白質 (JBP) 相同性の高いこれらの Tet タンパク質認識し、変更された DNA を結合して 5mC などの拠点および 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC)、5 formylcytosine (5 fC) および 5 - これらの残基を酸素carboxylcytosine (5caC)20。5 fC と 5caC の変更は 5mC 酸化21,から直接合成することができますしかしテト タンパク質がヒドロキシル基、カルボニルとカルボン酸の構成するメチルから段階的なコンフォメーション変化で 5mC 結果の酸化を促進22,23,24。
テト蛋白質の活動の規制を理解する上での有益な指標は、分布やオキシ-メチル-シトシン マークの豊富さに勉強しています。CpG 悪いプロモーターで重要な 5mC の存在は非メチル化 CpG の豊富な地域とは対照的に検出、CpG の特徴的な後者が諸島25。組織、口腔粘膜を示す最も低いメチル化しながら特定のメチル化は脳、精巣と血で観察される最高の組織間でティッシュ特定の促進者26で発生したメチル化パターンを示します。
敏感な反 5mC と反 5hmC を活用した抗体選択メチル/ヒドロキシメチル DNA 免疫沈降法 (meDIP/hmeDIP) とそれに続く高スループット シーケンス、Ficzらの実証、プロモーターにおける高 5hmC 占有率幹細胞27のエクソンとマウス胚にこれらの場所で減少 5mC レベルと相関線 1 レトロトランスポゾンのシーケンス。逆に、反復的な衛星時系列で観察された最大 5mC 濃縮 5hmC 存在が限られている28。人間の前頭葉脳組織の実施された試験では、非常に重要な 5hmC 濃縮、4 倍以上のマウス胚性幹細胞28を明らかにします。前の所見と一致、5hmC 信号の前頭葉組織図過半数 55 59% の高スループット シーケンス ローカライズ低密度で CpG プロモーター領域、遺伝子体と遺伝子間で約 6% の占有率内 35-38%地域。対照的に、遺伝子体 (52-55%) の中で豊かで遺伝子間領域 (25-26%) と高い 5mC が、プロモーターに削減 (22-24%) シーケンス29。5 fC と 5caC の分布に関する研究は限られているが、これらの研究は胚性幹細胞と体細胞の組織、特に脳、5hmC の豊富なを示します。
興味深いことに、真核生物、6 位窒素 (N6) アデニン残基のメチル化で最近発見された表示 (6 ma) ゲノムの豊富なプロファイル 5mC30の逆。高速液体クロマトグラフィー ・ タンデム質量分析法による観測はシマウマの魚とそのレベル (ゲノム アデニンの 0.003%) と精子と比較してブタ初期胚内に過剰に存在する 6 ma の絶対レベルを明らかにする受精、着実に増加して桑実胚の発達段階 (33 倍精子よりも高い) のピークとゲノム アデニン31の 0.004% の定常体性レベルに達する。免疫沈降濃縮 6 ma DNA シーケンスは、反復要素領域と転写開始サイト32の時はこのマークの優勢な占有率 (およそ 80% 濃縮) を実証しています。これらの観察は文脈し、6 ma デメチラーゼ null e の発見を検証蓄積された 6 ma を展示 mbryonic 幹細胞を介したライン 1 レトロトランスポゾン サイレンシング野生型細胞における転写活性状態の要素と比較しています。これらのデータは、6 ma33転写調節機能をお勧めします。
彼らは分布またはこれらのマーク34,の定量的な情報を伝えることはできませんしながら後続のディップの試金に結合共役の生化学的タグによって指定酸化メチルシトシン誘導体 (oxi mCs) の有無、35です。 最近開発された36才だった 5hmC と 5caC の免疫化学的検出のためのプロトコル。レーザー共焦点顕微鏡を用いた結合この蛍光標識二次抗体を用いた免疫染色メソッドはこのように、細胞内 DNA 変更の視対象定位を提供するユニークな利点を所有しています。肯定的または否定的は染色細胞これらのマークの異種の存在に対応する個人を強調しました。5hmC と 5caC の絶対信号強度に活用された抗体によって増幅する例えばヘテロクロマチンとユークロマチン領域の大きさおよび核内でこれらのマークの位置についての提案する半定量的な解釈を有効にします。37,38。 ここで共焦点顕微鏡画像の解析のための手法を説明します。明確な 5hmC を表示するプロットの 2.5 次元空間分布を生成とピクセルと核内の場所ごとの 5caC 信号のピークを示した。ヒストグラム プロットの 5hmC と 5caC 信号強度分布のピークとしてこれらのマークの豊富さで動向を説明することが谷は別の非オーバー ラップ チャネルとしてプロットされます。最後に、共存機能を実装すると、1 つの信号間の近接の程度を決定することができます、この結果として、彼らのそれぞれのゲノム座標を識別できます。

<table><tbody><tr><td>Zeiss Elyra PS1. Super resolution microscope equipped with LSM780 confocal head</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen Black 2012</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Zen Blue 2012</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

immunostaining for dna modifications: computational analysis of confocal images

数十年、5-メチルシトシン (5mC) は後生動物の機能的意義がある唯一の DNA の変更をすると考えられています。N6-メチルアデニン (6 ma) 多細胞生物の dna の検出と同様、5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC)、5 formylcytosine (5 fC) および 5-carboxylcytosine (5caC) 5mC の酵素的酸化の発見を提供追加度エピジェネティクスの研究の複雑さ。実験的証拠の成長するボディによるとこれらの新しい DNA の変更は異なる細胞および進化プロセスの特定の役割を果たす可能性があります。重要なこと, これらのマーク (e. g. 5hmC、5 fC と 5caC) 展示組織 - と、脊椎動物で発達段階に固有発生の一部として免疫を表しますにおける DNA 修飾の空間分布の評価を許可する重要なツール異なった生物学的文脈。ここで免疫染色後に共焦点顕微鏡で可視化した DNA 修飾の解析方法を説明します。具体的には、2.5 次元 (2.5 D) の生成信号強度プロット、信号強度プロファイルには、複数の細胞および信号の共存係数の決定における染色の数量が表示されます。総称して、これらの技術が運用レベルと後生動物の生物学的役割の解明に貢献すること、核のこれらの DNA の修正の局在の評価にあります。

5hmC と肝前駆細胞の immunostained スライドこれらの DNA の変更を区別することに 5caC の空間分布を決定するため、顕微鏡を使用してをイメージしました。
これらから oxi mCs の空間分布の初期分析は 2.5 D 強度プロット (図 1 a、1 b) の生成を行った。赤と緑のピークは、5caC および 5hmC の信号の小さな重なりのみを示すオレンジ色のピークの限られた存在と定義されているように見えた。これらの結果に一致して対応するセルで 5hmC と 5caC の強度のプロフィールはお互いに (図 1) 強く一致しません。これは 5caC と 5hmC がこの特定のクロマチン DNA 修飾の酸化誘導体別の世代に 5mC リードのテト依存酸化を示唆して肝前駆細胞の核分布の異なるパターンを展示示しています地域。
5caC と Daoy 髄芽腫と四 1425EPN 上衣細胞で 5hmC のレベルを比較するためは、同一の実験条件下で試料上をこれらから oxi mCs の免疫染色を行った。各セルラインの記録 3-5 細胞で生成された 20 のプロファイルで 5caC と 5hmC の信号の強度を比較した (図 2 a-2 D)。これらの結果の定量化は、四 1425EPN セルが 5hmC と 5caC の両方の免疫染色 Daoy 細胞 (図 2 D) と比較して有意に低いレベルを示すことを明らかにしました。
考えると赤 2 つのチャネル (5hmC) と緑 (5caC) を表すことができます R および G としてそれぞれ、ピアソンの相関係数 (PCC) の空間的重なりと R の共同偏析の程度を説明します &#38; G 両方の印と仮定すると線形に存在34R 統計で示される、お互いとの関係。R2で表される、PCC の値を二乗と、赤い信号強度34の影響は緑色の信号強度変化の測定ができます。これは 5caC 対 5hmC の共局在解析の余分です。
5caC と 5hmC 未分化 (未分化培地) hiPSCs と肝内胚葉の誘導後 24 時間 (HE24) の空間分布を調べるには、これらの DNA の変更の共局在解析実施しました 20 の R 値を持つ同じ共焦点画像を核は、セル行 (図 3 a-3 C) ごとに分析。
これらの結果の定量化を示した共存の程度は有意に高かった (P &#60; 0.05) 未分化培地 (図 3 c) と比較して HE24 に。これは 5caC の存在の減少の大きさとこの細胞未分化培地でその減らされた信号強度に起因する可能性があります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56318/56318fig1.jpg"> 
図 1: 72 時間ポスト分化誘導で肝内胚葉前駆細胞の免疫組織化学的染色します。(A) 共同染色 DAPI 染色 (ブルー)、5caC (緑) (赤) 5hmC。'B' 白の破線矢印は、 1 Cに示す核を介してサンプリング プロファイリングの方向を示します。スケール バーを表す 5 μ m. 赤のチャネル: 800 を得るため、1% をレーザーします。緑のチャネル: 750 を得るため、2.4% のレーザーします。DAPI チャネル: 750 を得るため、2.6% のレーザーします。5hmC、5caC、DAPI 信号の 2.5 D (B) 強度プロット。個々 のピークは、各ピクセルの絶対信号強度を表しています。マージされたビューと個々 のチャンネルが表示されます。(C) 5hmC、5caC、DAPI の強度プロファイルを肝前駆細胞分化の 72 時間ポスト導入時に通知します。ピーク強度は白い破線の矢印 'B' のディメンションを記録し、強度プロファイル x 軸に沿って黒い破線矢印で示されます。<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56318/56318fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56318/56318fig2.jpg"> 
図 2: シグナル強度 Daoy 髄芽腫と四 1425EPN 上衣細胞での 5hmC と 5caC の解析。(A) の蛍光抗体染色 5hmC (赤)、5caC (緑) Daoy と四 1425EPN の細胞に。同じ設定で両方油浸対物レンズ、x の 63 で撮影。マージされたビューと個々 のチャンネルが表示されます。スケール バーを表す 10 μ m. 赤のチャネル: 746 を得るため、1% をレーザーします。緑のチャネル: 750 を得るため、2.4% のレーザーします。Daoy (B) と (C) 号 1425EPN の個々 のセルは、隣接する図に展開されます。スケール バーの (B) と (C) 表す 5 μ m。 (D) Daoy 号 1425EPN 細胞における 5hmC 対 5caC 信号の平均蛍光強度測定 (n = 20、SD)。意義は、F 検定を用いて評価した、2 標本 t アスタリスクの統計的に重要な p 値 * * p として &#60; 0.01 と * * * p として &#60; 0.001。<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56318/56318fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56318/56318fig3.jpg"> 
図 3: 未分化 hiPSCs (未分化培地) に 5hmC と 5caC の絶対信号の共局在解析に比べて肝内胚葉 24 時間後差別化された前駆細胞 (HE24) です。(A) の共焦点顕微鏡画像は、hiPSCs と染色 DAPI (ブルー)、5caC (緑) (赤) 5hmC (B) HE24 細胞未分化。細胞は、同一の設定で 63 X オイル浸漬レンズでイメージしました。20 丸核共存分析用サンプリングされたセルを示しています。スケール バーを表す 20 μ m. 赤のチャネル: 800 を得るため、1% をレーザーします。緑のチャネル: 750 を得るため、2.4% のレーザーします。DAPI チャネル: 750 を得るため、2.6% のレーザーします。(C) 5hmC 近接未分化培地と HE24 の範囲内で 5caC 信号の存在の共局在解析 (n = 20、SD)。意義は、F 検定を用いて評価した、2 標本 t アスタリスクの統計的に重要な p 値 * p &#60; 0.05。<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56318/56318fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

DNA 変更染色: 共焦点画像の数値解析

新たに発見された 5-メチルシトシン (oxi mCs), 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) の酸化フォームと 5-carboxylcytosine (5caC) は、独自の機能的役割の異なる DNA 変更を表す場合があります。ここの可視化から oxi mCs の空間分布、信号強度プロファイルとの共存の半定量的なワークフローを説明します。

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

immunostaining-for-dna-modifications-computational-analysis-confocal

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

9.6K ビュー.  University of Nottingham. 新たに発見された 5-メチルシトシン (oxi mCs), 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) の酸化フォームと 5-carboxylcytosine (5caC) は、独自の機能的役割の異なる DNA 変更を表す場合があります。ここの可視化から oxi mCs の空間分布、信号強度プロファイルとの共存の半定量的なワークフローを説明します。

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Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an effective invasin for human epithelial and endothelial cells. We have identified endothelial surface-located integrins as major receptors for Opc, a process which requires Opc to first bind to integrin ligands such as vitronectin and via these to the cell-expressed receptors1. This process leads to bacterial invasion of endothelial cells2. More recently, we observed an interaction of Opc with a 100kDa protein found in whole cell lysates of human cells3. We initially observed this interaction when host cell proteins separated by electrophoresis and blotted on to nitrocellulose were overlaid with Opc-expressing Nm. The interaction was direct and did not involve intermediate molecules. By mass spectrometry, we established the identity of the protein as &alpha;-actinin. As no surface expressed &alpha;-actinin was found on any of the eight cell lines examined, and as Opc interactions with endothelial cells in the presence of serum lead to bacterial entry into the target cells, we examined the possibility of the two proteins interacting intracellularly. For this, cultured human brain microvascular endothelial cells (HBMECs) were infected with Opc-expressing Nm for extended periods and the locations of internalised bacteria and &alpha;-actinin were examined by confocal microscopy. We observed time-dependent increase in colocalisation of Nm with the cytoskeletal protein, which was considerable after an eight hour period of bacterial internalisation. In addition, the use of quantitative imaging software enabled us to obtain a relative measure of the colocalisation of Nm with &alpha;-actinin and other cytoskeletal proteins. Here we present a protocol for visualisation and quantification of the colocalisation of the bacterium with intracellular proteins after bacterial entry into human endothelial cells, although the procedure is also applicable to human epithelial cells.

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &#945;-actinin by Confocal Imaging

Neisseria meningitidis (Nm), a gram negative human-specific respiratory pathogen, can bind to human &alpha;-actinin. Here we present a protocol for visualisation of colocalisation of the bacterium with intracellular &alpha;-actinin after bacterial entry into human brain microvascular endothelial cells (HBMECs).

の細胞内相互作用の可視化と定量化髄膜炎菌</em共焦点イメージングによるα-アクチニン>と人間

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

免疫・感染学

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

発生生物学

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage response induced by neutron-gamma mixed-beam used in boron neutron capture therapy (BNCT). Specifically, the proposed methodology is applied for the detection of repair proteins activation which can be visualized as foci using antibodies specific to DNA double-strand breaks (DNA-DSBs). DNA repair foci were assessed by immunofluorescence in colon cancer cells (HCT-116) after irradiation with the neutron-mixed beam. DNA-DSBs are the most genotoxic lesions and are repaired in mammalian cells by two major pathways: non-homologous end-joining pathway (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR). The frequencies of foci, immunochemically stained, for commonly used markers in radiobiology like &#947;-H2AX, 53BP1 are associated with DNA-DSB number and are considered as efficient and sensitive markers for monitoring the induction and repair of DNA-DSBs. It was established that &#947;-H2AX foci attract repair proteins, leading to a higher concentration of repair factors near a DSB. To monitor DNA damage at the cellular level, immunofluorescence analysis for the presence of DNA-PKcs representative repair protein foci from the NHEJ pathway and Rad52 from the HRR pathway was planned. We have developed and introduced a reliable immunofluorescence staining protocol for the detection of radiation-induced DNA damage response with antibodies specific for repair factors from NHEJ and HRR pathways and observed radiation-induced foci (RIF). The proposed methodology can be used for investigating repair protein that is highly activated in the case of neutron-mixed beam radiation, thereby indicating the dominance of the repair pathway.

Radiation-induced DNA damage response activated by neutron mixed-beam used in boron neutron capture therapy (BNCT) has not been fully established. This protocol provides a step-by-step procedure to detect radiation-induced foci (RIF) of repair proteins by immunofluorescence staining in human colon cancer cell lines after irradiation with the neutron-mixed beam.

ヒト大腸癌細胞におけるDNA損傷および修復病巣の免疫蛍光イメージング

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

がん研究

ヒト初代細胞における核タンパク質染色の解析ワークフロー

A Versatile Pipeline for Analyzing Dynamic Changes in Nuclear Bodies in a Variety of Cell Types

Various nuclear processes, such as transcriptional control, occur within discrete structures known as foci that are discernable through the immunofluorescence technique. Investigating the dynamics of these foci under diverse cellular conditions via microscopy yields valuable insights into the molecular mechanisms governing cellular identity and functions. However, performing immunofluorescence assays across different cell types and assessing alterations in the assembly, diffusion, and distribution of these foci present numerous challenges. These challenges encompass complexities in sample preparation, determination of parameters for analyzing imaging data, and management of substantial data volumes. Moreover, existing imaging workflows are often tailored for proficient users, thereby limiting accessibility to a broader audience.
In this study, we introduce an optimized immunofluorescence protocol tailored for investigating nuclear proteins in different human primary T cell types that can be customized for any protein of interest and cell type. Furthermore, we present a method for unbiasedly quantifying protein staining, whether they form distinct foci or exhibit a diffuse nuclear distribution.
Our proposed method offers a comprehensive guide, from cellular staining to analysis, leveraging a semi-automated pipeline developed in Jython and executable in Fiji. Furthermore, we provide a user-friendly Python script to streamline data management, publicly accessible on a Google Colab notebook. Our approach has demonstrated efficacy in yielding highly informative immunofluorescence analyses for proteins with diverse patterns of nuclear organization across different&#160;contexts.

著者スポットライト:免疫蛍光アッセイを用いたヒト細胞の可塑性と環境適応性を調査するための包括的なエピジェネティック解析(英語)

This method describes an immunofluorescence protocol and quantification pipeline for evaluating protein distribution with varied nuclear organization patterns in human T lymphocytes. This protocol provides step-by-step guidance, starting from sample preparation and continuing through the execution of semi-automated analysis in Fiji, concluding with data handling by a Google Colab notebook.

さまざまな細胞タイプの原子核体の動的変化を解析するための汎用性の高いパイプライン

Various nuclear processes, such as transcriptional control, occur within discrete structures known as foci that are discernable through the ...

遺伝学

マウスの前期停止卵子におけるDNA損傷の同定

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

著者スポットライト:哺乳類の卵母細胞および着床前胚におけるDNA損傷応答の理解 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

マウス卵母細胞におけるDNA二本鎖切断の検出

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

3D原子力組織の変化を研究するために3D保存状態間期核に組み合わさ免疫やDNA FISH

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

DNA 変更染色: 共焦点画像の数値解析

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さまざまな細胞タイプの原子核体の動的変化を解析するための汎用性の高いパイプライン

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マウス卵母細胞におけるDNA二本鎖切断の検出

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