Name: visualizing multiciliated cells in the zebrafish through a combined protocol of whole mount fluorescent in situ hybridization and immunofluorescence
Uploaded: 2017-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence at JoVE.c

この作品は一部インスタントスキルし国立科学財団大学院研究フェローシップ号助成金 R01DK100237 によって支えられました。DGE-1313583 に A.N.M.また、大学の科学夏学部研究フェローシップ ・ プログラム調印への支援に感謝します。自分専用のケア私たちのゼブラフィッシュのノートルダム大学でゼブラフィッシュ研究センターに感謝したいと思います。また、生物科学専攻だけでなく、彼らのサポートと貴重な洞察力のすべての研究室のメンバーに感謝したいと思います。

次のプロトコルは、ゼブラフィッシュ大人維持し、ノートルダム大学でゼブラフィッシュ研究センターの世話を使用します。ゼブラフィッシュ大人と胚を操作するためのすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. 胚の固定
<ol><li>上記の方法39,40を用いたゼブラフィッシュ胚を収集します。24 で hpf、胚の E3 に非特定プロテアーゼ混合溶液 (50 mg/mL) の 500 μ L 皿加温室温 (RT) で追加。</li>
	<li>胚の絨毛膜分割し始め、一旦胚皿からすべての液体を削除します。</li>
	<li>E3 の約 20 mL を追加、皿、E3 を軽く旋回液体廃棄物の容器に液体をデカントによって新鮮な E3 に胚を 2-3 回を洗います。</li>
	<li>修正する前に胚を安楽死、E3 に 0.2% tricaine 2 mL を追加します。</li>
	<li>プラスチック製の Pasteur のピペットを使用して 5 mL バイアルに胚を転送します。胚は、バイアルの底に落ち着いて後にピペットを使用して tricaine/E3 ソリューションのほとんどを削除します。</li>
	<li>撹拌せず常温では、2-4 時間 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 5 mL で 24 hpf 胚を固定します。 注意: PFA は有毒であると研究者は実験用の上着や手袋、眼の保護を着ている間、PFA ソリューションは化学のボンネットの下処理必要があります。PFA 顆粒から PFA 定着剤の準備は、グラニュー PFA が静電気によって分散する傾向がある例外的な注意を払って行わなければなりません。 注: 胚は 4 %pfa が 4 ° C で一晩で修正できます。準備 4% グラニュー PFA を完全に解消するソリューションを継続的に攪拌しながら沸騰させるリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 を加熱することによって PFA。一度ソリューションが RT、PFA は真空ろ過、0.45 μ m の使い捨てシステムを通すことで滅菌フィルター 4% に戻ってダウン冷却し、-20 ° C で保存用 15 mL や 50 mL の部分に避けよう</li>
	<li>削除、4 %pfa と 1 X リン酸バッファーで 2 回洗浄胚 0.1% 生理食塩水トゥイーン 20 (pbst;) 室温洗って新鮮な 100% の右追加 5 mL で 100% メタノール (メタノール) 5 mL を 1 回胚胚にメタノールし、-20 ° c 少なくとも 20 分間加温します。 注: 胚は 100% に格納できる胚の準備の準備ができるまでの-20 ° C でメタノール。</li>
</ol>2. 胚の準備および交配
<ol><li>50 %5 mL で 1 回の洗濯で胚を水分補給 1 のメタノールを 5 mL 30% の胚を洗浄することにより RT 続行水分補給で 5 分間 x PBST 1 のメタノール室温 5 分 x PBST 1 の 5 mL で胚を洗う x PBST で各 5 分の 2 回。RT。</li>
	<li>1 の縮尺プロテイナーゼ K 溶液 5 mL (pK) (10 mg/mL) にそれらを孵化によって胚を permeabilize ルートで 2 分間 x PBST 注: 古い胚 pK 濃度濃度 5 mg/mL とインキュベーション時間 2 分未満しかし、上記の 2 分が 24 未満の胚の示唆されたより長く培養できます hpf。</li>
	<li>室温 2 回 pbst; 4 %5 mL に胚を修正する 1 つの x の 5 mL pK ソリューションと即座に洗浄を削除、少なくとも 20 分間常温 PFA。 注: 胚は 4 %pfa が 4 ° C で一晩で修正できます。</li>
	<li>削除 PFA と洗浄を 2 度 1 の 5 mL 室温 x PBST</li>
	<li>1 の 5 mL の胚を転送平らな底遠心チューブに x PBST それぞれの胚とその後交配ソリューション間の相互作用を容易にする RT で遠心ラックに上向きに置かれました。</li>
	<li>新鮮な Hyb + RT。 追加 1.5 mL でハイブリダイゼーション溶液 (Hyb +) 1.5 mL で 2 回胚を洗って、4-6 h のハイブリダイゼーション オーブンで 70 ° C で胚を孵化させなさい。</li>
	<li>プローブ ソリューションのボリュームの Hyb + 1.5 mL に置き換えます (10 μ L RNA プローブ/500 μ L Hyb +) 胚を完全にカバーするために十分な。 注: は、アンチセンス RNA プローブ以前を使用して説明の方法39を合成します。</li>
	<li>振盪せずに遠心ラックに配置されている個々 のチューブ直立 70 ° C でハイブリダイゼーション オーブンで一晩プローブを交配させます。</li>
</ol>3. ホット洗浄およびブロック
注: ホット洗浄は、胚の適切なソリューションを置くと、ハイブリダイゼーション オーブン 70 ° C で培養によって実行されます。70 ° C で洗浄ソリューションを維持、ハイブリダイゼーション オーブンに各ソリューションの 50 mL チューブに配置場合プローブ/Hyb + 混合物を追加。
<ol><li>プローブを削除します。50% ホルムアミド/2 x 20-30 分のクエン酸塩ナトリウム (SSC) バッファーの 1.5 mL で 70 ° C で 2 回胚を洗います。 注: プローブ Hyb + で-20 ° C で保存して再使用できる後日。</li>
	<li>70 ° c 2 の 1.5 mL で胚を一度洗って 15 分の x SSC は、20-30 分の 0.2 X SSC の 1.5 mL で 70 ° C で 2 回胚を洗います。1.5 ml のブロッキング試薬の置換 0.2 x SSC と 4 ° C で一晩インキュベート 注: それは一晩ではなく 4 h の RT でブロッキング試薬をインキュベートする可能です。</li>
</ol>4. 抗体の孵化とマレイン酸バッファー洗浄
注意: 胚の周囲の光から保護します。
<ol><li>ブロッキング試薬に置き換えて抗 DIG-ポッド縮尺の比率でブロッキング試薬 0.2 mL、3 h の箔や室温に別の遮光カバーの下でインキュベート 注: また、抗体の 4 ° C での一晩インキュベートすることができます。</li>
	<li>3 h 後 2-4 倍した加温胚は一晩で 1.5 mL の新鮮なマレイン酸バッファー 4 ° C の各 10-15 分のマレイン酸バッファーの 1.5 mL で胚を洗ってください。 注: マレイン酸バッファーで一晩インキュベートする必要はありませんが、行うので減少プローブ背景。</li>
</ol>5. プローブの検出およびペルオキシダーゼの除去
注意: 胚の周囲の光から保護します。
<ol><li>マレイン酸バッファーを削除し、1.5 mL の 1x PBS で置き換えます。蛍光染色液室温 60 分 1.5 mL で 5 分間各 0.2 mL に加温した胚 Cy3 の 1x PBS で 2 回胚を洗う 注: 異なるプローブのインキュベーション時間が異なる場合があります。</li>
	<li>RT で 10 分の 1 × PBS で次の % メタノールの 1.5 mL で一度胚を洗う: 30%、50% メタノール メタノール、75% メタノールと 100% メタノール。</li>
	<li>1.5 ml の MeOH 中 RT。 洗浄で 30 分間 1% H2O2の胚を RT で 10 分の 1 × PBS で次の MeOH ソリューションの 1.5 mL で一度胚孵化させなさい: 75% メタノール、50% メタノール、および 30% メタノール。1.5 mL の 1x PBS で常温 5 分のため 2 回胚を洗浄します。 注: 胚に格納できる PBS 一晩 4 ° C で</li>
</ol>6. 蛍光抗体法
注意: 胚の周囲の光から保護します。
<ol><li>室温 7 分洗う ddH2O 5 分の 1.5 mL で一度胚した洗浄で 1.5 に一度胚のためあらかじめ冷やしたアセトン (-20 ° C で保管) の 1.5 mL で胚した洗浄で ddH2O 5 分の 1.5 mL で胚を洗う1 mL 1 %dmso (PBDT) ルートで 5 分間 x PBST</li>
	<li>2 時間常温ロッカーの PBDT + 10% 牛胎児血清 (FBS) の 1.5 mL で胚を孵化させなさい。</li>
	<li>一次抗体、抗アセチル化チューブリン (マウスから生産)、アンチ-γ-チューブリン (ウサギから生産)、PBDT + 1 %1: 400 で一緒に希釈した 1.5 mL で取り外して交換する PBDT + FB 政府短期証券。4 ° C で一晩胚を孵化します。 注: インキュベーション時間は一次抗体によって異なる場合があります。さまざまな時間間隔のテスト表示を最適化する必要があります。</li>
</ol>7. 二次抗体
注意: 胚の周囲の光から保護します。
<ol><li>過剰を削除する胚からの抗体を非連結、FBS + ロッカーに RT で 1 分の 0.1 M の NaCl を PBDT + 1% の 1.5 mL で洗います。</li>
	<li>胚を洗う PBDT + 1% の 1.5 mL で 5 回 FBS + 室温ロッカーに各 30 分の 0.1 M の NaCl を洗う胚 PBDT + 1% の 1.5 mL で 30 分常温ロッカーの FBS。</li>
	<li>一晩で 200 μ L 二次抗体の 4 ° C の胚をインキュベート アレクサ 488 ヤギ抗マウス igg 抗体と Alexa 647 ヤギ抗ウサギ IgG、1: 500 で PBDT で一緒に希釈しました。</li>
</ol>8. DAPI 染色
注意: 胚の周囲の光から保護します。
<ol><li>胚をすぐに洗って RT で PBDT の 1.5 mL で 2 回。DAPI の 1.5 mL で PBDT を置き換える、pbst; X 1 で 1:15000 を希釈し、15 分常温ロッカーを孵化させなさい。</li>
	<li>PDBT + 1% の 1.5 mL で胚を洗う FBS + 0.1 M 塩化ナトリウム 3 回 RT 15-20 分間。マウントし、イメージの準備ができるまで、4 ° C で PBDT の 1.5 mL で胚を格納します。</li>
</ol>9. マウントおよびゼブラフィッシュ Pronephros イメージング
<ol><li>小さな容量の約 10 μ L、PBDT のガラス スライドのレイアウト胚横。</li>
	<li>頭を削除する微細鉗子のペアと卵黄球の一部の目の後ろに胚を絞る。</li>
	<li>ゆっくりとこすり胚の体から残りの卵黄のボールに微細鉗子を使用します。薄い組織でスライドから分離卵黄、余分な液体を削除します。</li>
	<li>胚の残りの尾にメディアのマウントを一滴を追加し、尾を横に置いたように配置します。サンプルでは、平らにするカバー スライド ボックスに配置し尻尾の上に coverslip を配置します。</li>
	<li>次のチャネルを使用して共焦点顕微鏡の 60 倍の倍率で腎臓繊毛をイメージ: 青の DAPI (408.0 でセットをレーザー nm)、緑の FITC (488.0 でセットをレーザー nm)、赤色素 Cy3 標識 (561.0 でセットをレーザー nm) と白の Alexa 680 (637.0 でセットをレーザー nm)。</li>
</ol>

<ol>
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N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+Mount+Preparation+for+Observation+and+Analysis+of+Zebrafish+Embryo+Specimens+Stained+by+Whole+Mount+In+situ+Hybridization.">Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization.</a> J Vis Exp. (89), e51604 (2014).</li><li>Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Manual+Small+Molecule+Screen+Approaching+High-throughput+Using+Zebrafish+Embryos.">A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. (93), e52063 (2014).</li></ol>

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上記の詳細なプロトコルは、 odf3bトラン スクリプトと α-チューブリン 24 hpf ゼブラフィッシュ胚における pronephros の MCCs のラベルに最適です。最良の結果は、新鮮な固定および準備された胚を使用することをお勧めします。固定と 1 週間以上-20 ° C でメタノールまたは Hyb + のいずれかで保存されている胚は、胚をストレージに保持する時間の増加を汚す不要なバック グラウンドの確率が使用できます。
変更とトラブルシューティングのこの技術の特定のマーカー、その他のアンチセンスの riboprobes やその他の抗体などの他のスイーツのこのメソッドに合わせて必要です。全台紙の in situハイブリダイゼーション過程でステップのパラメーターを調整するための多くの方法がされている31,34,36,38、私たちのグループで以前記載されています。 39。同様に、各蛋白質抗体染色時間の面でいくつかのトラブルシューティングが必要になります、希釈、各一次抗体の孵化時間のおおよその範囲が文書化された結果28,の評価によって算出された最高35。 24 歳未満の胚の hpf、pK の治療は 2 分より短くなるはずどこ 24 より古い胚 2 分より長いため pk hpf を扱う必要があります。また、胚 24 より古い hpf は pK 治療前に、色素の漂白する必要があります。
蛍光染色液で染色後、メタノールや過酸化水素洗浄のシリーズを実行することによって、任意の残りの汚れ、抗体およびペルオキシダーゼを削除するが重要です。PBS 洗浄直後は胚から過剰なメタノールを削除に不可欠です。重要なは、IF 抗体を前に、我々 はアセトンと脱イオン水洗浄胚互いおよび/または遠沈管に付着しにくいことを発見しました。私たちの経験、特定のトランスクリプション要因および他の遺伝子のための抗体効率的に働くことがありますけれども西部のしみ、ゼブラフィッシュのよく動作しません。ただし、α-チューブリンと β-カテニンなどの非常に節約された、豊富な蛋白質は場合16,37のゼブラフィッシュでうまく動作しないでください。
魚、まだのゼブラフィッシュ特異抗体を持っていない遺伝子の RNA 転写産物を視覚化することが可能です。このプロトコルによって示されるように場合魚を組み合わせることによって、RNA 転写産物やタンパク質の共局在は見られる生体内で(図 2) できます。プロトコルの柔軟な性質により、様々 な RNA 転写産物と多数の組織および時間ポイントにおけるタンパク質の可視化のための迅速なトラブルシューティングできます。ゼブラフィッシュ胚のすでに尊敬の特性と組み合わせることで、魚 + 場合のこのプロトコルは発達経路制御する遺伝子および重要なタンパク質発現を探検する別のツールを提供します。

過去数十年にわたってゼブラフィッシュ (動脈分布) は、発生生物学を研究するプライム モデル生物として浮上しています。胚は母親以外の開発と光学的透過的です。また、目、腎臓、脳などの重要な器官の形成はちょうど 24 時間後受精 (hpf) によって形成された構造を持つ急速に発生します。重要なは、ゼブラフィッシュのゲノムが哺乳類1,2,3保存性が高い。さらに、ゼブラフィッシュと哺乳類の臓器と同様の解剖学と生理学があります。ゼブラフィッシュ胚の腎臓、または pronephros、初期のなかでもと脊椎動物のネフロン4,の保存された上皮細胞集団の運命決定の間に遺伝子の機能を調べるためのモデル システムの値を示してください。5,6,7,8,9,10します同様に、ゼブラフィッシュ胚の MCCs11,12,13,14,15,の個体発生を調べることでますます重要になっている。16,17。
その名の通り、MCCs は上皮細胞の頂端表面17に位置する繊毛の束によって特徴付けられます。ゼブラフィッシュ、MCCs 液流機能、24 hpf11,12,13,14、 、pronephros の各ネフロンの中間を通してファッションのような「霜降り」に分散しています。15,16,17. ひと腎臓の病気症例18,19,20,21MCCs、脳など他の哺乳類の組織で普及している彼らは、ほんの一握りで指摘されているが、気管22,23,24、実験的なデザインの課題を提起します。ゼブラフィッシュを含む様々 な脊椎動物モデルでエレガントな研究は、クライアント開発12,17,25 阻害剤としてシグナル伝達経路の切り込みと MCC 運命の保存された経路を示しています。、26,27。したがって、ゼブラフィッシュ pronephros クライアント開発生体内で11,12,13,14,の遺伝子のメカニズムを勉強する簡単にアクセスできるモデルについて説明します15,16,17。
透明性とゼブラフィッシュ胚の遺伝的操作を容易、初期胚1,2 の開発、組織の成長、細胞の運命を制御する遺伝学的および分子経路を検討するとき非常に貴重な特性であると証明します。 ,3。タンパク質と遺伝子の転写産物の in situハイブリダイゼーションなど全体の場合のマウントを視覚化する、されているに適用しゼブラフィッシュ16,28,29のために最適化された、このような伝統的な手法として 30,31,32,33,34,35,36,37,38。魚の場合は人気のあるプロトコルを組み合わせて、ラベル、MCCs体内の16,28,37,38を分析することが可能です。

<table><tbody><tr><td>non-specific protease mixture solution</td><td>Roche</td><td>11459643001, pronase from Streptomyces griseus</td><td>Dilute in E3 &lt;strong&gt;without&lt;/strong&gt; methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>E3 solution</td><td></td><td></td><td>Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination</td></tr><tr><td>tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td><td>Fluka</td><td>A5040-250G</td><td>To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL</td></tr><tr><td>embryo dishes</td><td>VWR</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>5 mL glass vials</td><td>Wheaton</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>disposable plastic Pasteur pippettes</td><td>VWR</td><td>414004-004</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde (PFA) solution</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>19210</td><td>Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20&amp;deg;C. Do not refreeze once thawed for use.</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072</td><td>Dilute in distilled water to make a 1X stock</td></tr><tr><td>Tween-20 stock</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td>Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water.</td></tr><tr><td>1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST)</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>0.1% Tween-20 in 1X PBS</td></tr><tr><td>methanol (MeOH)</td><td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr><tr><td>proteinase K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td>Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>flat bottom microcentrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>87003-300; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600</td><td>store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>hybridization solution (HYB+)</td><td></td><td></td><td>50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 &amp;mu;g/&amp;mu;L heparin; store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>hybridization oven</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-10Q</td><td></td></tr><tr><td>20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156</td><td>dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks</td></tr><tr><td>blocking reagent solution</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td>dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>maleic acid buffer solution</td><td>Sigma</td><td>M0375 and S7653</td><td>150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5)</td></tr><tr><td>anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11207739910</td><td>store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Cy3 fluorescent staining solution</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system</td><td>store at 4&amp;deg;C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide (H2O2)</td><td>Sigma</td><td>H1009-500mL</td><td>store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>molecular grade distilled water (ddH2O)</td><td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>acetone</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00636-01000</td><td>store an aliquot at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00435-01000</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10438-034</td><td>aliquot and store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td>aliquot and store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>anti-&amp;gamma;-tubulin anitbody produced in rabbit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5192</td><td>aliquot and store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>odf3b cDNA clone MGC:63985</td><td>OpenBiosystems</td><td>IMAGE:6792478</td><td>store bacterial glycerol stock at -80&amp;deg;C</td></tr><tr><td>NaCL</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915-05000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21245</td><td>store at 4&amp;deg;C; protect from light</td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td>store at 4&amp;deg;C; protect from light</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td>aliquot and store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>glass slide</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td></td></tr><tr><td>glass coverslip</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>fine forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Tweezers Pattern #55</td></tr><tr><td>mounting media</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18606, Aqua-Poly/Mount</td><td>store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>confocal microscope and associated software</td><td></td><td></td><td>We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software</td></tr><tr><td>rocker</td><td>Bio-Rad</td><td>1660710EDU</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing multiciliated cells in the zebrafish through a combined protocol of whole mount fluorescent in situ hybridization and immunofluorescence

近年、ゼブラフィッシュ胚は胚子宮 exと光透過性などの特徴により発生生物学を研究する人気モデルとして登場しました。特に、ゼブラフィッシュ胚研究 multiciliated 細胞 (MCC) の開発と同様に、脊椎動物の腎臓器官形成に重要な生物になりました。ゼブラフィッシュ胚性腎センターを視覚化するには、我々 は蛍光その場全体マウント交配 (魚) の複合的なプロトコルを開発しているし、全体高分解能イメージングを可能にする蛍光抗体法 (IF) をマウントします。本稿では、共同様々 な系統の因子の発現を通じて発達プログラムの制御を理解するツールとして RNA 転写産物やタンパク質をローカライズするための手法について説明します。

野生型ゼブラフィッシュ胚が 24 で固定した hpf と前述のようにすぐに準備します。図 1は、選択したイラスト段階に沿って実験ワークフローを示しています。1-8 の手順に従ってワークフローにはサンプル調達、固定、およびアンチセンス riboprobes 続いて興味のラベル蛋白への蛍光抗体法と内因性のトラン スクリプトにラベルを付ける固定組織の操作のプロセスが含まれます。ワークフローのステップ 9 は、取り付けとイメージング ゼブラフィッシュ胚性幹の可視化を最適化するために特別に設計された技術を指します。ステップ 9 に付随する図面では、スライド ガラス上の組織を配置するための操作方法を示しています。このステップでスライド ガラスと coverslip の間に配置される横尾を残して胚の頭と卵黄のボールは削除されます。卵黄のボール自動蛍光を発するし、実装プロセスを妨害、pronephros の MCC 住民の最高のイメージング卵黄のボールとヘッドの取り外しが示唆されました。
図 2を示しています 60 倍の倍率で同じ野生型胚と同じ倍率でデジタル ズームは、共焦点顕微鏡を用いた代表的な像を提供しています。下の 2 つのパネルはこれらの画像データの複合のオーバーレイ、上部パネルは、個々 のチャンネルのイメージを提供します。(左列のイメージ) の白いボックスは、デジタル ズーム (右列の画像) のフォーカスとなっている区域をについて説明します。デジタル ズームの最後のパネルで強調表示, 核を DAPI でラベル付けしたそして Mcc は、 odf3b γ-チューブリン抗体を示す基底の体、α-チューブリンを示します繊毛を認識するように設計されたアンチセンス riboprobe に基づいて検出されました。複合のオーバーレイのデジタル ズーム、黄色の破線の円は、 odf3bの成績証明書、複数の基底ボディと繊毛の所持のため検出されたクライアント センターの境界を示します。単一の体温と単一の繊毛を有するの表現型に基づく黄色点線の円が付いた、隣接のモノラル繊毛細胞が確認されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig1.jpg"> 図 1: 実験フローチャートのスケマティック。これは雪が冷たいインキュベーションをことを示しますの重要な段階のイラストが伴う実験ワークフローのフローチャートに示します、3 本の曲線を表す熱、および時計は長いインキュベーション時間を表します。プロトコルで説明したように、長い時間の期間にわたっていくつかの手順を実行できますが、6 日間 (プロセスの各ステージの右上隅に番号を参照)、最低でワークフローを実行できます。実装プロセスの詳細な描写は、スライド ガラスと coverslip の最終的なマウントされた胚の尾を示す、描画されます。黒破線のボックスは、60 倍の倍率で撮影である区域をについて説明します。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56261/56261fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig2.jpg"> 図 2: ゼブラフィッシュ pronephros の MCCs を可視化結果を代表します。イメージの最大投影倍率と同じ胚の 60 倍の倍率で共にデジタル ズーム X 60 24 hpf 野生型ゼブラフィッシュ胚の。白いボックスは、ズームの焦点領域を示します。DAPI (核)、 odf3b (MCCs)、γ-チューブリン (基底ボディ)、α-チューブリン (繊毛) の個々 の汚れは貼付し、下の二つのパネルにマージされます。デジタル ズームで我々 は次のようにセルの位置の近似を提供: 黄色破線の円によってクライアント センターを囲まれ、黄色点線の丸モノ繊毛細胞の概要を説明します。<a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56261/56261fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

繊毛の開発は適切な器官形成に不可欠です。このプロトコルでは、ラベルを付けると、ゼブラフィッシュの繊毛細胞を可視化する最適化されたメソッドについて説明します。

全体のマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション、免疫組織の結合されたプロトコルを介してゼブラフィッシュにおける Multiciliated の細胞を可視化します。

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

visualizing-multiciliated-cells-zebrafish-through-combined-protocol

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

8.1K ビュー.  University of Notre Dame. 繊毛の開発は適切な器官形成に不可欠です。このプロトコルでは、ラベルを付けると、ゼブラフィッシュの繊毛細胞を可視化する最適化されたメソッドについて説明します。

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Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

ゼブラフィッシュ後脳における標識およびイメージング細胞

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

神経科学

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

発生生物学

Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos

The rapid proliferation of cells, the tissue-specific expression of genes and the emergence of signaling networks characterize early embryonic development of all vertebrates. The kinetics and location of signals - even within single cells - in the developing embryo complements the identification of important developmental genes. Immunostaining techniques are described that have been shown to define the kinetics of intracellular and whole animal signals in structures as small as primary cilia. The techniques for fixing, imaging and processing images using a laser-scanning confocal compound microscope can be completed in as few as 36 hr.
Zebrafish (Danio rerio) is a desirable organism for investigators who seek to conduct studies in a vertebrate species that is affordable and relevant to human disease. Genetic knockouts or knockdowns must be confirmed by the loss of the actual protein product. Such confirmation of protein loss can be achieved using the techniques described here. Clues into signaling pathways can also be deciphered by using antibodies that are reactive with proteins that have been post-translationally modified by phosphorylation. Preserving and optimizing the phosphorylated state of an epitope is therefore critical to this determination and is accomplished by this protocol.
This study describes techniques to fix embryos during the first 72 hr of development and co-localize a variety of relevant epitopes with cilia in the Kupffer&#39;s Vesicle (KV), the kidney and the inner ear. These techniques are straightforward, do not require dissection and can be completed in a relatively short period of time. Projecting confocal image stacks into a single image is a useful means of presenting these data.

Techniques are described to immunostain phospho-epitopes in whole zebrafish embryos and then conduct two-color fluorescent confocal localization in cellular structures as small as primary cilia. The techniques for fixing and imaging can define the location and kinetics of the appearance or activation of specific proteins.

ホールマウントゼブラフィッシュ胚の繊毛器官におけるリン酸化エピトープを免疫染色

The rapid proliferation of cells, the tissue-specific expression of genes and the emergence of signaling networks characterize early embryonic development ...

化学

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-&#946;-Hydroxysteroid dehydrogenase /&#916;5-4 isomerase (3&#946;-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3&#946;-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3&#946;-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

The interrenal gland in zebrafish is the teleostean counterpart of the mammalian adrenal gland. This protocol introduces how to perform the 3-&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase (&#916;5-4 isomerase; 3&#946;-Hsd) enzymatic activity assay, which detects differentiated steroidogenic cells in the developing zebrafish.

腎間のステロイド合成組織とゼブラフィッシュにおけるその血管微小環境の可視化

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

生物学

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫賦形化学

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

ホールマウントによるゼブラフィッシュ胚標本ステンドの観察および分析のためのフラットマウントの準備<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a model for human diseases. Gene function study is based on the detection of gene expression patterns. Although immunohistochemistry offers a powerful way to assay protein expression, the limited number of commercially available antibodies in zebrafish restricts the application of costaining. In situ hybridization is widely used in zebrafish embryos to detect mRNA expression. This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish embryo sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. Immunohistochemistry and the imaging of a single cryosection were performed after in situ hybridization. The protocol is helpful to unravel the expression pattern of two genes, first by in situ transcript detection and then by immunohistochemistry against a protein in the same section.

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry of zebrafish embryonic sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. It is useful to detect the expression patterns of two genes in zebrafish if there is a paucity of antibodies.

その場で 凍結切片ゼブラフィッシュ胚における免疫組織化学と組み合わせたハイブリダイゼーション

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

全体のマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション、免疫組織の結合されたプロトコルを介してゼブラフィッシュにおける Multiciliated の細胞を可視化します。

要約

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この動画の章

ゼブラフィッシュ後脳における標識およびイメージング細胞

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

ホールマウントゼブラフィッシュ胚の繊毛器官におけるリン酸化エピトープを免疫染色

腎間のステロイド合成組織とゼブラフィッシュにおけるその血管微小環境の可視化

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化

ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫賦形化学

ホールマウントによるゼブラフィッシュ胚標本ステンドの観察および分析のためのフラットマウントの準備

その場で凍結切片ゼブラフィッシュ胚における免疫組織化学と組み合わせたハイブリダイゼーション

全体のマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション、免疫組織の結合されたプロトコルを介してゼブラフィッシュにおける Multiciliated の細胞を可視化します。

要約

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ゼブラフィッシュ後脳における標識およびイメージング細胞

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

ホールマウントゼブラフィッシュ胚の繊毛器官におけるリン酸化エピトープを免疫染色

腎間のステロイド合成組織とゼブラフィッシュにおけるその血管微小環境の可視化

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化

ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫賦形化学

ホールマウントによるゼブラフィッシュ胚標本ステンドの観察および分析のためのフラットマウントの準備

その場で 凍結切片ゼブラフィッシュ胚における免疫組織化学と組み合わせたハイブリダイゼーション

その場で凍結切片ゼブラフィッシュ胚における免疫組織化学と組み合わせたハイブリダイゼーション