Name: visualizing multiciliated cells in the zebrafish through a combined protocol of whole mount fluorescent in situ hybridization and immunofluorescence
Uploaded: 2017-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence at JoVE.c

Questo lavoro è stato supportato in parte dalla concessione R01DK100237 R.A.W e il National Science Foundation Graduate ricerca Fellowship No. DGE-1313583 di Raffaele Ringraziamo anche il College di Scienze Undergraduate Research Fellowship programma estivo per supporto per M.U. Vorremmo ringraziare il centro per la ricerca di Zebrafish presso l'Università di Notre Dame per la loro cura dedicato del nostro zebrafish. Vorremmo anche ringraziare il dipartimento di scienze biologiche, come pure i membri del nostro laboratorio per tutte le loro supporto e informazioni preziose.

Il seguente protocollo utilizza zebrafish adulti tenuto e curato dal centro per la ricerca di Zebrafish presso l'Università di Notre Dame. Tutti i metodi per l'utilizzo di embrioni e zebrafish adulti sono stati approvati dal comitato di uso e cura degli animali istituzionale.
1. embrione fissazione
<ol><li>Raccogliere gli embrioni di zebrafish utilizzando metodi precedentemente descritti39,40. Alle 24 hpf, aggiungere 500 µ l di soluzione di miscela di proteasi aspecifiche (50 mg/mL) per l'E3 in un embrione piatto Incubare a temperatura ambiente (TA).</li>
	<li>Una volta che gli embrioni iniziano a scoppiare di chorion, rimuovere tutto il liquido dal piatto dell'embrione.</li>
	<li>Lavare gli embrioni 2 - 3 volte con E3 fresco aggiungendo circa 20 mL di E3, agitando delicatamente la E3 nel piatto, e quindi decantare il liquido in un recipiente di scarico liquido.</li>
	<li>Per eutanasia gli embrioni prima del fissaggio, aggiungere 2 mL di tricaina 0,2% per l'E3.</li>
	<li>Trasferire gli embrioni in un flaconcino di vetro da 5 mL utilizzando una pipetta Pasteur di plastica. Rimuovere la maggior parte della soluzione tricaina/E3 con la pipetta dopo gli embrioni hanno depositato sul fondo del flaconcino.</li>
	<li>Difficoltà 24 embrioni hpf con 5 mL di paraformaldeide al 4% (PFA) per 2-4 h a RT, senza agitazione. Attenzione: PFA è tossico e soluzioni PFA dovranno essere gestiti sotto una cappa chimica, mentre il ricercatore indossa un camice da laboratorio, guanti e occhiali di protezione. Preparazione del fissativo PFA dalla polvere granulata di PFA dovrebbe essere effettuato con cura eccezionale, come il granulato PFA tende a disperdere attraverso carica statica. Nota: Gli embrioni possono risolvere in 4% PFA durante la notte a 4 ° C. Preparare 4% PFA riscaldando 1x tamponato fosfato salino (PBS) ad ebollizione rimestando continuamente la soluzione per sciogliere completamente il granulato PFA. Una volta che la soluzione è raffreddata giù per RT, il 4% PFA è filtro sterilizzato facendolo passare attraverso un sistema monouso di 0,45 µm per filtrazione sotto vuoto, quindi e aliquotati in porzioni di 15 mL o 50 mL per la conservazione a-20 ° C.</li>
	<li>Rimuovere il 4% PFA e gli embrioni di lavare due volte con 1 tampone fosfato X salino con 0.1% Tween-20 (PBST) a RT. lavare gli embrioni una volta con 5 mL di metanolo al 100% (MeOH) a RT. aggiungere 5 mL di fresco 100% MeOH agli embrioni e incubare a-20 ° C per almeno 20 min. Nota: Gli embrioni possono essere memorizzati in 100% MeOH a-20 ° C fino al momento per la preparazione di embrione.</li>
</ol>2. ibridazione e preparazione embrione
<ol><li>Reidratare gli embrioni con il lavaggio una volta in 5 mL di 50% MeOH in 1 x PBST per 5 min a RT. continua reidratazione lavando gli embrioni in 5 mL di 30% MeOH in 1 x PBST per 5 min a RT. lavare gli embrioni in 5 mL di 1 x PBST due volte per 5 minuti ciascuno, a RT.</li>
	<li>Permeabilize gli embrioni di incubarle in 5 mL di una soluzione di 1:1,000 proteinasi K (pK) (10 mg/mL) in 1 x PBST per 2 minuti a TA. Nota: Più vecchi embrioni possono essere incubati più di 2 min con la concentrazione di pK indicata sopra, tuttavia meno di 2 minuti di tempo di una concentrazione di 5 mg/mL e l'incubazione è suggerito per gli embrioni più giovani di 24 hpf.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di pK e lavare immediatamente in 5 mL di 1x PBST due volte a RT. Difficoltà gli embrioni in 5 mL di 4% PFA a temperatura ambiente per almeno 20 min. Nota: Gli embrioni possono risolvere in 4% PFA durante la notte a 4 ° C.</li>
	<li>Rimuovere PFA e lavare due volte in 5 mL di 1 x PBST a TA.</li>
	<li>Trasferire gli embrioni in 5 mL di 1 x PBST nelle provette microcentrifuga fondo piatto posizionato verticalmente in un rack microcentrifuga a RT per facilitare le interazioni tra ciascun embrione e la soluzione di ibridazione successive.</li>
	<li>Lavare gli embrioni due volte in 1,5 mL di soluzione di ibridazione (IBRID +) a RT. aggiungere 1,5 mL di fresco Hyb + e incubare gli embrioni a 70 ° C in un forno di ibridazione per 4-6 h.</li>
	<li>Sostituire i 1,5 mL di ibrid + con un volume di soluzione della sonda (10 µ l RNA sonda/500 µ l Hyb +) sufficiente a coprire completamente gli embrioni. Nota: Sintetizzare antisenso sonda RNA usando precedentemente descritto metodi39.</li>
	<li>Ibridare la sonda pernottamento in forno a 70 ° C l'ibridazione con il montante di tubi singoli posizionati nel rack microcentrifuga, senza agitazione.</li>
</ol>3. caldo lavaggi e blocco
Nota: Lavaggi caldi vengono eseguite mettendo la soluzione appropriata sugli embrioni e incubando poi in forno a 70 ° C. ibridazione Per mantenere le soluzioni di lavaggio a 70 ° C, mettere le provette da 50 mL di ciascuna soluzione in forno ibridazione quando la sonda / IBRID + miscela viene aggiunto.
<ol><li>Rimuovere la sonda. Lavare gli embrioni due volte a 70 ° C in 1,5 mL di 50% formammide/2 x tampone salino-sodio citrato (SSC) per 20-30 minuti ciascuno. Nota: La sonda può essere memorizzata nella Hyb + a-20 ° C e ri-utilizzata in un secondo momento.</li>
	<li>Lavare gli embrioni una volta a 70 ° C in 1,5 mL di 2 x SSC per 15 min. lavare gli embrioni due volte a 70 ° C in 1,5 mL di 0,2 X SSC per 20-30 minuti ciascuno. Sostituisci 0.2 x SSC con 1,5 mL di reagente bloccante e incubare per una notte a 4 ° C. Nota: È possibile incubare reagente bloccante a RT per 4 h invece di pernottamento.</li>
</ol>4. anticorpo incubazione e acido maleico Buffer lavaggi
Nota: Conservare gli embrioni protetti dalla luce ambientale.
<ol><li>Sostituire il Reagente Bloccante con 0,2 mL di anti-DIG-POD nel Reagente Bloccante con un rapporto di 1:1,000 e incubare per 3 h in lamina o un'altra luce di blocco coperchio a TA. Nota: In alternativa, l'anticorpo può incubare overnight a 4 ° C.</li>
	<li>Dopo 3 h, lavare gli embrioni in 1,5 mL di tampone acido maleico 2 - 4 volte per 10-15 minuti ciascuno, a RT. Incubare gli embrioni durante la notte a 4 ° C in 1,5 mL di tampone fresco acido maleico. Nota: Non è necessario Incubare per una notte nel buffer di acido maleico, ma facendo così diminuisce la sonda sfondo.</li>
</ol>5. sonda di rilevamento e rimozione di perossidasi
Nota: Conservare gli embrioni protetti dalla luce ambientale.
<ol><li>Tampone acido maleico di rimuovere e sostituire con 1,5 mL di PBS 1X. Lavare gli embrioni due volte in 1,5 mL di PBS 1X per 5 min a RT. Incubare embrioni in 0,2 mL di Cy3 fluorescente macchiatura soluzione per 60 minuti a TA. Nota: Il tempo di incubazione può variare per diverse sonde.</li>
	<li>Lavare gli embrioni una volta con 1,5 mL della seguente percentuale MeOH in 1X PBS per 10 min a RT: 30% MeOH, 50% MeOH, 75% MeOH e 100% MeOH.</li>
	<li>Incubare gli embrioni con 1,5 mL di 1% H2O2 in MeOH per 30 min a RT. Wash gli embrioni una volta con 1,5 mL di MeOH seguenti soluzioni in 1X PBS per 10 min a RT: 75% MeOH, 50% MeOH e 30% MeOH. Lavare gli embrioni due volte per 5 minuti ciascuno a RT in 1,5 mL di PBS 1X. Nota: Gli embrioni possono essere memorizzati in PBS durante la notte a 4° C.</li>
</ol>6. immunofluorescenza
Nota: Conservare gli embrioni protetti dalla luce ambientale.
<ol><li>Lavare gli embrioni in 1,5 mL di ddH2O per 5 min a RT. Wash gli embrioni in 1,5 mL di acetone pre-refrigerati (conservato a-20 ° C) per 7 min a RT. lavare gli embrioni una volta in 1,5 mL di ddH2O per 5 min a RT. Wash gli embrioni una volta in 1.5 mL di 1 x PBST con 1% DMSO (PBDT) per 5 minuti a TA.</li>
	<li>Incubare gli embrioni in 1,5 mL di PBDT + 10% siero bovino fetale (FBS) su un agitatore meccanico a temperatura ambiente per 2 h.</li>
	<li>Rimuovere PBDT + FBS e sostituirli con 1,5 mL di anticorpi primari, anti-acetilato tubulina (prodotto da mouse) e anti-γ-tubulina (prodotto da coniglio), diluito insieme a 1: 400 in PBDT + 1% FBS. Incubare gli embrioni durante la notte a 4 ° C. Nota: Tempi di incubazione possono variare a seconda l'anticorpo primario. Test di diversi intervalli di tempo potrebbe essere necessario ottimizzare l'etichettatura.</li>
</ol>7. secondaria dell'anticorpo
Nota: Conservare gli embrioni protetti dalla luce ambientale.
<ol><li>Per rimuovere l'eccesso anticorpo non legato da embrioni, lavare in 1,5 mL di PBDT + 1% FBS + 0,1 M NaCl per 1 min a RT su un agitatore meccanico.</li>
	<li>Lavare gli embrioni 5 volte in 1,5 mL di PBDT + 1% FBS + 0,1 M NaCl per 30 minuti ciascuno, su un rocker RT. lavare gli embrioni in 1,5 mL di PBDT + 1% FBS per 30 min a RT su un agitatore meccanico.</li>
	<li>Incubare gli embrioni durante la notte a 4 ° C a 200 µ l di anticorpi secondari, Alexa 488 capra anti-topo IgG e Alexa 647 capra anti-coniglio IgG, diluito insieme a PBDT a 1: 500.</li>
</ol>8. DAPI macchiatura
Nota: Conservare gli embrioni protetti dalla luce ambientale.
<ol><li>Lavare gli embrioni rapidamente a RT in 1,5 mL di PBDT due volte. Sostituire PBDT con 1,5 mL di DAPI, diluito 1:15000 in 1 X PBST e incubare per 15 min a RT su un agitatore meccanico.</li>
	<li>Lavare gli embrioni in 1,5 mL di PDBT + 1% FBS + 0,1 M NaCl tre volte a RT per 15-20 minuti ciascuno. Conservare gli embrioni in 1,5 mL di PBDT a 4 ° C fino al momento di montare e immagine.</li>
</ol>9. montaggio e Imaging per Zebrafish Pronephros
<ol><li>Embrione laici laterale su vetrino in un piccolo volume, circa 10 µ l, di PBDT.</li>
	<li>Spremere l'embrione dietro gli occhi con una coppia di una pinzetta per rimuovere la testina e alcuni della palla tuorlo.</li>
	<li>Utilizzare una pinzetta per raschiare delicatamente la palla di tuorlo rimanente dal corpo dell'embrione. Rimuovere il tuorlo dissociata e liquido supplementare dal vetrino con un tessuto sottile.</li>
	<li>Aggiungere una goccia di montaggio supporto alla coda rimanente dell'embrione e posizionare in modo che la coda è disposto lateralmente. Porre un coprivetrino in cima alla coda per appiattire il campione, quindi inserire in una casella di scivolo coperto.</li>
	<li>Ciglia di rene a 60 ingrandimenti su un microscopio confocale utilizzando i seguenti canali di immagine: DAPI in blu (set presso 408,0 laser nm), FITC in verde (set presso 488.0 laser nm), Cy3 tingere-contrassegnati in rosso (set alle 561.0 laser nm) e Alexa 680 in bianco (set a 637.0 laser nm).</li>
</ol>

<ol>
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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cilia+in+zebrafish.">Imaging cilia in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 97, 415-435 (2010).</li><li>Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescent+in+situ+hybridization+to+define+abutting+and+overlapping+gene+expression+in+the+embryonic+zebrafish+brain.">Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain.</a> Neural Dev. 6, (2011).</li><li>Sorrells, S., Toruno, C., Stewart, R. A., Jette, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+apoptosis+in+zebrafish+embryos+by+whole-mount+immunofluorescence+to+detect+activated+caspase+3.">Analysis of apoptosis in zebrafish embryos by whole-mount immunofluorescence to detect activated caspase 3.</a> J Vis Exp. (82), e51060 (2013).</li><li>Schumacher, J. A., Zhao, E. J., Kofron, M. J., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+using+chromogenic+substrates+in+zebrafish.">Two-color fluorescent in situ hybridization using chromogenic substrates in zebrafish.</a> Bio Techniques. 57, 254-256 (2014).</li><li>Julich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beamter/deltaC+and+the+role+of+Notch+ligands+in+the+zebrafish+somite+segmentation,+hindbrain+neurogenesis+and+hypochord+differentiation.">beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation.</a> Dev Biol. 286, 391-404 (2005).</li><li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos.">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biology. 12, (2014).</li><li>Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+Mount+Preparation+for+Observation+and+Analysis+of+Zebrafish+Embryo+Specimens+Stained+by+Whole+Mount+In+situ+Hybridization.">Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization.</a> J Vis Exp. (89), e51604 (2014).</li><li>Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Manual+Small+Molecule+Screen+Approaching+High-throughput+Using+Zebrafish+Embryos.">A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. (93), e52063 (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo descritto sopra è ottimizzato per l'etichettatura MCCs in pronephros con odf3b trascrizioni e α-tubulina in embrioni di zebrafish 24 hpf. Per ottenere risultati ottimali, si consiglia di utilizzare embrioni appena fissi e preparati. Gli embrioni che sono stati corretti e immagazzinati in MeOH o IBRID + a-20 ° C per più di una settimana possono essere utilizzati, ma la probabilità di sfondo indesiderati macchiatura aumenta con il tempo che gli embrioni sono conservati in deposito.
Le modifiche e la risoluzione dei problemi di questa tecnica sono necessarie per adattare questo metodo per altre suite di particolari marcatori, ad es. altri riboprobes antisenso e altri anticorpi. Molti metodi per regolare i parametri delle fasi del processo intero supporto ibridazione in situ sono stati documentati in precedenza dal nostro gruppo ed altri31,34,36,38, 39. Allo stesso modo, ogni anticorpo proteina richiederà alcuni risoluzione dei problemi in termini di tempi di trattamento, e approssimative gamme di diluizioni e tempi di incubazione per ogni anticorpo primario migliori sono stimate dalla valutazione di risultati documentati28, 35. per gli embrioni di età inferiore ai 24 hpf, pK trattamento dovrebbe essere inferiore a 2 min, dove oltre 24 anni di embrioni hpf devono essere trattati con pK per più di 2 min. Inoltre, gli embrioni oltre 24 hpf dovrebbe essere sbiancato di pigmento prima del trattamento di pK.
Dopo colorazione con la soluzione colorante fluorescente, è fondamentale per rimuovere qualsiasi restante macchia, anticorpo e perossidasi eseguendo la serie di lavaggi di metanolo e perossido di idrogeno. I lavaggi di PBS immediatamente successivi sono vitali per rimuovere il metanolo in eccesso da embrioni. Importante, prima di procedere con gli anticorpi se, abbiamo trovato che l'acetone e risciacqui con acqua deionizzata rendono gli embrioni meno tendono ad aderire l'un l'altro e/o le provette da centrifuga. Nella nostra esperienza, gli anticorpi per specifici fattori di trascrizione e di altri geni, anche se potrebbero funzionare in modo efficiente macchie occidentali, non funzionano bene per se in zebrafish. Tuttavia, proteine altamente conservate e abbondanti, come α-tubulina e β-catenina, funzionano bene in zebrafish per se16,37.
Con il pesce, è possibile visualizzare trascrizioni del RNA dei geni che non hanno ancora gli anticorpi specifici in zebrafish. Combinando il pesce con se, come dimostrato dal presente protocollo, co-localizzazione di trascritti di RNA e proteine può essere visto in vivo (Figura 2). La natura flessibile del protocollo consente la rapida risoluzione dei problemi per la visualizzazione dei vari trascritti di RNA e proteine in numerosi tessuti e intervalli di tempo. Quando combinato con i tratti già rispettati di embrioni di zebrafish, questo protocollo di pesce + se fornisce un altro strumento per esplorare l'espressione di geni e proteine importanti per via dello sviluppo.

Nel corso degli ultimi decenni, il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un organismo il primo modello per studiare biologia inerente allo sviluppo. Gli embrioni si sviluppano di fuori della madre e sono otticamente trasparenti. Inoltre, la formazione di organi vitali come l'occhio, il rene e il proencefalo si verifica rapidamente, con strutture formate da solo 24 h post fertilizzazione (hpf). D'importanza, il genoma di zebrafish è altamente conservato con mammiferi1,2,3. Inoltre, zebrafish e organi mammiferi hanno simili anatomia e fisiologia. Il rene embrionale di zebrafish, o pronephros, dimostra il valore del sistema modello per l'esame di funzione del gene durante primi nefrogenesi e determinazione di destino delle popolazioni di cellule epiteliali conservata del nefrone vertebrati4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. allo stesso modo, l'embrione di zebrafish è diventato sempre più importante nell'esaminare l'ontogenesi di MCCs11,12,13,14,15, 16 , 17.
Come suggerisce il loro nome, MCCs sono cellule epiteliali, caratterizzate da un fascio di ciglia mobili situato sulla superficie apicale17. In zebrafish, MCCs funzionare in flusso di fluido e sono disperse in un "sale e pepe" come la moda in tutta la metà di ogni nefrone dei pronephros da 24 hpf11,12,13,14, 15 , 16 , 17. anche se essi sono stati notati solo in una manciata di rene umano malattia casi18,19,20,21, MCCs sono prevalenti in altri tessuti di mammiferi come il cervello e trachea22,23,24, che pone una serie di sfide per il disegno sperimentale. Elegante in vari modelli vertebrati compreso zebrafish hanno dimostrato una via conservata del destino MCC, con la tacca via di segnalazione come inibitore di MCC sviluppo12,17,25 ,26,27. Di conseguenza, i pronephros zebrafish fornisce un modello facilmente accessibile per studiare i meccanismi genetici di MCC sviluppo in vivo11,12,13,14, 15 , 16 , 17.
Trasparenza e facile manipolazione genetica degli embrioni di zebrafish hanno dimostrato di essere tratti inestimabile quando si studia le vie genetiche e molecolari che regolano il destino delle cellule, la crescita dei tessuti e lo sviluppo del primo embrione1,2 ,3. Come tali, tecniche tradizionali per visualizzare trascrizioni del gene e della proteina, quali ibridazione in situ e intero monte se, sono stati applicati a e ottimizzato per il Danio rerio16,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38. Combinando i più diffusi protocolli per pesce e se, è possibile aggiungere etichette e analizzare MCCs in vivo16,28,37,38.

<table><tbody><tr><td>non-specific protease mixture solution</td><td>Roche</td><td>11459643001, pronase from Streptomyces griseus</td><td>Dilute in E3 &lt;strong&gt;without&lt;/strong&gt; methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>E3 solution</td><td></td><td></td><td>Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination</td></tr><tr><td>tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td><td>Fluka</td><td>A5040-250G</td><td>To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL</td></tr><tr><td>embryo dishes</td><td>VWR</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>5 mL glass vials</td><td>Wheaton</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>disposable plastic Pasteur pippettes</td><td>VWR</td><td>414004-004</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde (PFA) solution</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>19210</td><td>Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20&amp;deg;C. Do not refreeze once thawed for use.</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072</td><td>Dilute in distilled water to make a 1X stock</td></tr><tr><td>Tween-20 stock</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td>Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water.</td></tr><tr><td>1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST)</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>0.1% Tween-20 in 1X PBS</td></tr><tr><td>methanol (MeOH)</td><td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr><tr><td>proteinase K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td>Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>flat bottom microcentrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>87003-300; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600</td><td>store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>hybridization solution (HYB+)</td><td></td><td></td><td>50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 &amp;mu;g/&amp;mu;L heparin; store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>hybridization oven</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-10Q</td><td></td></tr><tr><td>20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156</td><td>dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks</td></tr><tr><td>blocking reagent solution</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td>dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>maleic acid buffer solution</td><td>Sigma</td><td>M0375 and S7653</td><td>150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5)</td></tr><tr><td>anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11207739910</td><td>store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Cy3 fluorescent staining solution</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system</td><td>store at 4&amp;deg;C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide (H2O2)</td><td>Sigma</td><td>H1009-500mL</td><td>store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>molecular grade distilled water (ddH2O)</td><td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>acetone</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00636-01000</td><td>store an aliquot at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00435-01000</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10438-034</td><td>aliquot and store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td>aliquot and store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>anti-&amp;gamma;-tubulin anitbody produced in rabbit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5192</td><td>aliquot and store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>odf3b cDNA clone MGC:63985</td><td>OpenBiosystems</td><td>IMAGE:6792478</td><td>store bacterial glycerol stock at -80&amp;deg;C</td></tr><tr><td>NaCL</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915-05000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21245</td><td>store at 4&amp;deg;C; protect from light</td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td>store at 4&amp;deg;C; protect from light</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td>aliquot and store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>glass slide</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td></td></tr><tr><td>glass coverslip</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>fine forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Tweezers Pattern #55</td></tr><tr><td>mounting media</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18606, Aqua-Poly/Mount</td><td>store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>confocal microscope and associated software</td><td></td><td></td><td>We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software</td></tr><tr><td>rocker</td><td>Bio-Rad</td><td>1660710EDU</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing multiciliated cells in the zebrafish through a combined protocol of whole mount fluorescent in situ hybridization and immunofluorescence

Negli ultimi anni, l'embrione di zebrafish è emerso come un modello popolare per studiare biologia inerente allo sviluppo a causa di caratteristiche quali la ex utero lo sviluppo dell'embrione e trasparenza ottica. In particolare, l'embrione di zebrafish è diventato un organismo importante per studiare l'organogenesi renale vertebrati, nonché lo sviluppo delle cellule multiciliated (MCC). Per visualizzare MCCs nel rene embrionale zebrafish, abbiamo sviluppato un protocollo combinato di ibridazione del intero-supporto fluorescente in situ (FISH) e montare tutto immunofluorescenza (IF) che permette l'imaging ad alta risoluzione. Questo manoscritto descrive la nostra tecnica per la co-localizzazione di trascritti di RNA e proteine come strumento per comprendere meglio la regolamentazione dei programmi di sviluppo attraverso l'espressione di vari fattori di lignaggio.

Embrioni di zebrafish di selvaggio-tipo sono stati fissati alle 24 hpf e immediatamente preparato come descritto sopra. Figura 1 illustra un flusso di lavoro sperimentale, insieme ad alcune fasi illustrate. Il flusso di lavoro descritto nei passaggi 1-8 comprende i processi di approvvigionamento campione, fissazione e la manipolazione del tessuto fisso per etichettare le trascrizioni endogene con riboprobes antisenso seguita dall'immunofluorescenza per etichetta proteina di interesse. Passaggio 9 del flusso di lavoro si riferisce specificatamente progettati per ottimizzare la visualizzazione del tronco embrionali zebrafish tecniche di imaging ed il montaggio. Nei disegni che accompagnano il passaggio 9, illustriamo il metodo di manipolazione per il posizionamento del tessuto su un vetrino. In questo passaggio, la palla di testa e tuorlo di embrione vengono rimossi, lasciando la coda per essere posizionato lateralmente tra una lastra di vetro e il vetrino coprioggetti. Rimozione della sfera di tuorlo e la testa è suggerito per la migliore immagine della popolazione residente MCC in pronephros, come la palla di tuorlo reagisce in auto e ostacola il processo di montaggio.
Immagini rappresentative ottenute utilizzando un microscopio confocale sono fornite in Figura 2, che mostra l'embrione stesso di selvaggio-tipo a 60x e uno zoom digitale allo stesso ingrandimento. I pannelli superiori forniscono immagini di ogni singolo canale, mentre i due pannelli di fondo sono la sovrapposizione composita di questi dati di imaging. La scatola bianca (nell'immagine colonna sinistra) delinea l'area che è al centro dello zoom digitale (l'immagine della colonna di destra). Evidenziata nel riquadro finale dello zoom digitale, i nuclei sono stati etichettati in DAPI e MCCs sono stati rilevati basato su un ribosonde antisenso progettato per riconoscere odf3b, dove gli anticorpi a γ-tubulina denotano i corpi basali e α-tubulina denota le ciglia. Nello zoom digitale della sovrapposizione composito, il cerchio con tratteggio giallo indica il perimetro di un MCC, che è stato identificato dovuto il possesso di odf3b trascrizioni, più corpi basali e ciglia. La cella adiacente mono-ciliated, etichettata con un cerchio giallo punteggiato, è stata identificata basata sul fenotipo di possedere un singolo corpo basale e un singolo Cilio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig1.jpg"> Figura 1: schema di diagramma di flusso sperimentale. Questo diagramma di flusso Mostra un flusso di lavoro sperimentale, corredato da illustrazioni di fasi critiche in cui il fiocco di neve indica freddo incubazione, le tre linee curve rappresentano il calore e l'orologio rappresenta tempi lunghi di incubazione. Il flusso di lavoro possa essere eseguito in un minimo di 6 giorni (Vedi il numero del giorno nell'angolo superiore destro di ogni fase del processo), tuttavia alcuni passaggi possono essere eseguiti su più lunghi periodi di tempo, come indicato nel protocollo. Una rappresentazione dettagliata del processo di montaggio è tirata fuori, dimostrando la coda finale dell'embrione montato tra il vetrino e il vetrino coprioggetti. Una casella tratteggiata nera delinea l'area che è imaged 60 ingrandimenti. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56261/56261fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig2.jpg"> Figura 2: rappresentante risultati per la visualizzazione di MCCs dei pronephros zebrafish. Proiezioni di massima dell'immagine di un embrione di zebrafish di selvaggio-tipo hpf 24 a 60 X ingrandimento, come pure uno zoom digitale sul confocale a 60 ingrandimenti dell'embrione stesso. Le caselle bianche indicano l'area incentrata su per lo zoom. Le macchie individuali di DAPI (nuclei), odf3b (MCCs), γ-tubulina (corpi basali) e α-tubulina (ciglia) sono etichettate e quindi fuse insieme nei pannelli di fondo due. Lo zoom digitale, forniamo approssimazioni delle posizioni delle cellule come segue: un MCC è delineato dal cerchio con tratteggio giallo, e il cerchio giallo punteggiato delinea una cella mono-ciliati. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56261/56261fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Sviluppo di ciglia è vitale per l'organogenesi corretto. Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per etichettare e visualizzare le cellule ciliate di zebrafish.

Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

visualizing-multiciliated-cells-zebrafish-through-combined-protocol

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

8.1K Views.  University of Notre Dame. Sviluppo di ciglia è vitale per l'organogenesi corretto. Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per etichettare e visualizzare le cellule ciliate di zebrafish.

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Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

Etichettatura e cellule Imaging nel romboencefalo Zebrafish

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Ricerca

Neuroscienze

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Biologia dello sviluppo

Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos

The rapid proliferation of cells, the tissue-specific expression of genes and the emergence of signaling networks characterize early embryonic development of all vertebrates. The kinetics and location of signals - even within single cells - in the developing embryo complements the identification of important developmental genes. Immunostaining techniques are described that have been shown to define the kinetics of intracellular and whole animal signals in structures as small as primary cilia. The techniques for fixing, imaging and processing images using a laser-scanning confocal compound microscope can be completed in as few as 36 hr.
Zebrafish (Danio rerio) is a desirable organism for investigators who seek to conduct studies in a vertebrate species that is affordable and relevant to human disease. Genetic knockouts or knockdowns must be confirmed by the loss of the actual protein product. Such confirmation of protein loss can be achieved using the techniques described here. Clues into signaling pathways can also be deciphered by using antibodies that are reactive with proteins that have been post-translationally modified by phosphorylation. Preserving and optimizing the phosphorylated state of an epitope is therefore critical to this determination and is accomplished by this protocol.
This study describes techniques to fix embryos during the first 72 hr of development and co-localize a variety of relevant epitopes with cilia in the Kupffer&#39;s Vesicle (KV), the kidney and the inner ear. These techniques are straightforward, do not require dissection and can be completed in a relatively short period of time. Projecting confocal image stacks into a single image is a useful means of presenting these data.

Techniques are described to immunostain phospho-epitopes in whole zebrafish embryos and then conduct two-color fluorescent confocal localization in cellular structures as small as primary cilia. The techniques for fixing and imaging can define the location and kinetics of the appearance or activation of specific proteins.

Immunocolorazione fosfo-epitopi in Ciliated Organi di monte intero embrioni di zebrafish

The rapid proliferation of cells, the tissue-specific expression of genes and the emergence of signaling networks characterize early embryonic development ...

Chimica

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-&#946;-Hydroxysteroid dehydrogenase /&#916;5-4 isomerase (3&#946;-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3&#946;-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3&#946;-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

The interrenal gland in zebrafish is the teleostean counterpart of the mammalian adrenal gland. This protocol introduces how to perform the 3-&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase (&#916;5-4 isomerase; 3&#946;-Hsd) enzymatic activity assay, which detects differentiated steroidogenic cells in the developing zebrafish.

Visualizzare il Tissue interrenale Steroidogenic e la sua Vascolare Microenvironment in Zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biologia

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish intero monte ad alta risoluzione doppia fluorescente In Situ Ibridazione

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Visualizzazione dell'attività elettrica cellulare in Zebrafish embrioni in anticipo e tumori

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Intero Monte Immunohistochimica in Embrioni e Larve di pesce zebra

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

Preparazione di montaggio schermo per l&#39;osservazione e l&#39;analisi di zebrafish campioni macchiato da Whole Monte<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a model for human diseases. Gene function study is based on the detection of gene expression patterns. Although immunohistochemistry offers a powerful way to assay protein expression, the limited number of commercially available antibodies in zebrafish restricts the application of costaining. In situ hybridization is widely used in zebrafish embryos to detect mRNA expression. This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish embryo sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. Immunohistochemistry and the imaging of a single cryosection were performed after in situ hybridization. The protocol is helpful to unravel the expression pattern of two genes, first by in situ transcript detection and then by immunohistochemistry against a protein in the same section.

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry of zebrafish embryonic sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. It is useful to detect the expression patterns of two genes in zebrafish if there is a paucity of antibodies.

Sul posto Ibridazione combinata con immunoistochimica in embrioni di zebrafish criosezionati

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

Riepilogo

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