Name: visualization of cellular electrical activity in zebrafish early embryos and tumors
Uploaded: 2018-04-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
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この出版物で報告された研究がによって国立科学研究所の一般医療賞数 R35GM124913、パデュー大学 PI4D インセンティブ プログラム、および PVM 内部競争の下で健康の国民の協会のサポートされていた基本的な研究資金プログラムです。内容は著者の責任と資金調達エージェントの公式見解を必ずしも表さない。メダカ Tol2 構築、ASAP1 構造体のマイケル ・ リンありがとう川上浩一、 ubiプロモーターのレナード ・ ゾンを Addgene を構築します。

ゼブラフィッシュ、AAALAC 承認の動物施設に収容され、パーデュー大学動物ケアおよび使用委員会 (PACUC) によって承認されたプロトコルに従ってすべての実験を行った。
1. メダカ Tol2 トランスポゾン プラスミド構築準備
注: メダカ Tol2 トランスポゾン、メダカに発見されたは、ゼブラフィッシュ研究コミュニティ8,9で広く使用されています。正常にゲートウェイ ・部位特異的組換えベース クローン システムに採用されており、メダカ Tol2 キット10として知られています。メダカ Tol2 キットも遺伝子導入の効率を向上させながら、カスタマイズされた式の構造物の作成のより便利な方法ことができます。したがって、このシステムの活用し、検証されたユビキチンプロモーターを使用して ASAP111をドライブするユビキタス ASAP1 式ゼブラフィッシュ行を作成する簡単な決断だった。
<ol><li>中間エントリ ASAP1 構造を作成: pDONR221 ASAP1<ol>
<li>Addgene から pcDNA3.1/Puro CAG ASAP1 (プラスミド #52519)、遺伝的コード化の電圧センサー ASAP1 構成要素を取得します。ASAP1 コーディング領域を増幅するには、プライマー (図 1) の 5' 端に attB 配列の両脇にカスタマイズされたプライマー (attB1 ASAP1F、attB2 ASAP1R) を使用して PCR を設定します。Phusion DNA ポリメラーゼはその高効率化のために選ばれた、以前に公開されたプロトコル12に基づいて PCR 条件を最適化します。</li>
		<li>TAE は、200 μ L のヒント、正規ピペットを使用してゲル 1% に 50 μ L の PCR の製品を読み込むし、約 30 分間水平ゲルタンクで 160 V で電気泳動を行います。</li>
		<li>UV transilluminator の下でゲルをチェック (353 nm)、以前に公開された13,14、UV transilluminator 下刃/メスを使用して目的のバンドを消費税し、含んでいるゲルの DNA のサンプルを入れてきれいな 1.5 mL 遠心機チューブ。</li>
		<li>ASAP1 PCR の製品のゲルの浄化を実行します。製造元の指示に従って商業 DNA ゲル精製キットを使用して摘出したゲルの DNA を回復し、水の 20 μ L に DNA を溶出します。サンプルとして 1 μ L をとり、分光光度計を用いた DNA 濃度を測定します。空白のコントロール15として水を使用してソフトウェアの指示を流れ。</li>
		<li>100 を取る ng の PCR の製品の浄化し、150 混ぜる ng のテの 10 μ L の pDONR221 プラスミドのバッファー (10 mM トリス、1 mM EDTA pH 8.0)16。反応に BP Clonase II の 2 μ L を追加し、一晩室温で反応を孵化させなさい。</li>
		<li>2 日目、反応にプロティナーゼ K の 1 μ L を追加し、30 分の 37 ° C で反応をインキュベートします。</li>
		<li>変換を実行します。反応を転送し、有能なエシェリヒア属大腸菌のセルし、30 分間氷の上細胞をインキュベート Top10 の 50 μ L でそれをミックスします。その後、転送 1 分の 42 ° C の水浴に反応管はすぐにチューブを削除し、2 分間氷の上を孵化させなさい。次に、37 ° C のシェーカーにチューブを入れて、1 時間インキュベートします。</li>
		<li>チューブを取り出して、カナマイシン LB プレート上に細胞をプレートします。次に、プレート一晩 (16-18 h) 37 ° c. で孵化させなさい</li>
		<li>シングルと十分に分離コロニーをピックアップし、3 ml の LB 培地の 14 mL 細胞培養管にそれらを接種します。37 ° c 250 rpm (1 分あたり回転) の回転速度とシェーカーで一晩文化それら。</li>
		<li>Miniprep の次の命令マニュアル17商業 miniprep キットを使用してを実行します。</li>
		<li>3-4 プラスミドをシーケンス サンガーと肯定的な pDONR221 ASAP1 を識別するシーケンスは M13F と M13R の配列のプライマーを使用してクローンします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マイクロインジェクションのメダカ Tol2 コンストラクトを作成する: pDestTol2-ubi-ASAP1<ol>
<li>シーケンスを検証 pDONR221 ASAP1 クローンと測定分光光度計の次に空白制御15として水を使用してソフトウェア命令を使用してその DNA 濃度を選択します。</li>
		<li>PDONR221 ASAP1 の 100 μ g を取るし、メダカ Tol2 キット 5 終わりプラスミドの 100 μ g と混ぜる (pENTR5'_ubi、Addgene #27320) 100、p3E polyA (メダカ Tol2 キット #302) の μ g と pDestTol2pA2 の 150 μ g (メダカ Tol2 キット #394)。8 μ L に容量を調整チューブ 1.5 mL 容マイクロで TE バッファー (トリス、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0 10 mM) を使用し、2-5 秒の簡単な渦でよく混ぜます。プラス、LR Clonase II の 2 μ L を追加し、一晩室温で反応を孵化させなさい。</li>
		<li>2 日目、10 μ L ピペットを使用して反応にプロティナーゼ K の 1 μ L を追加し、30 分の 37 ° C で反応をインキュベートします。</li>
		<li>変換を実行して (手順 1.1.7-11) 上記のように肯定的なクローンを識別します。</li>
		<li>測定シーケンスの DNA の集中を確認15分光光度計を用いた pDestTol2 ユービーアイ ASAP1 クローン (図 1 b)。通常、濃度は 200ng/μ L の周りです。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. メダカ Tol2 トランスポザーゼ mRNA と注射溶液を準備します。
<ol><li>連勝大腸菌グリセロール ストック (100 μ g/mL アンピシリン) と LB プレート pCS2FA トランスポザーゼ プラスミド (メダカ Tol2 キット #396) の滅菌接種ループを使用して。インキュベーターの 37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。次の日、単一コロニーを拾うし、lb (100 μ g/mL アンピシリン) 3 mL に滅菌 10 μ L ピペット チップを使用してそれを接種します。一晩 250 rpm の回転速度とシェーカーで 37 ° C で培養します。</li>
	<li>その取扱説明書に続く商業 miniprep キットを使用してE. 大腸菌文化 miniprep を実行します。14,000 rpm で 1 分遠心分離機による TE バッファーの 30-50 μ L にプラスミド DNA を溶出し、その DNA 濃度を分光光度計で測定します。</li>
	<li>私にプラスミッドの 1-2 μ g のエンドヌクレアーゼをリニア化し、浄化のクリーニング キットがなかった後の取扱説明書を次の DNA と DNA 消化。5 μ L の水に 1 分 14,000 rpm で遠心分離で DNA を溶出します。予想される濃度は約 200-300 ng/μ L。</li>
	<li>生体外のトランスクリプションを実行しないと私は商業 SP6 転写キットを使用して DNA のテンプレートとして pCS2FA トランスポザーゼを線形化します。</li>
	<li>反応が完了すると、mRNA 商業 RNA クリーニング キットの製造元の指示に従ってメダカ Tol2 転移を浄化します。最後に、mRNA を 20 μ L RNAase 無料水に溶出し、分光光度計で RNA 濃度を測定します。予想される濃度は 1-3 μ g/μ L のサンプルは、必要な場合-80 ° C のフリーザーで保存できます。</li>
	<li>20 ng/μ L pDestTol2-ユービーアイを混合することによってマイクロインジェクション ソリューションを準備-ASAP1 とメダカ Tol2 トランスポザーゼ mRNA (100 ng/μ L) ピペットで遠心管に。繰り返し融解と凍結、分注 6 μ L チューブ/による核酸の劣化を防止し、将来使用するため-80 ° C のフリーザーで保存します。</li>
</ol>3. マイクロインジェクション
<ol><li>注入前に午後 4-6 繁殖タンク男性少なくとも 2 名と女性 2 名を設定します。これらの魚は、午後に取り込まれないする必要があります。この手順は魚の無駄の量を減らす、繁殖応答を誘導しながらも、次の朝をそれらをきれいにする時間を節約します。</li>
	<li>次の朝、削除準備注射液 (pDestTol2-ubi-ASAP1 構造とメダカ Tol2 mRNA)-80 ° C のフリーザーから氷の場所と。</li>
	<li>魚のタンクを繁殖の仕切りを引き、魚の仲間を許可します。一般的に、魚は分割線から撤退した後 20-30 分以内の卵を産みます。そうでない場合は、1-2 時間以上を待ちます。いくつかの魚は、すべての卵を置くかもしれない。この場合、魚の胚のコレクションのこの実験を繰り返します。</li>
	<li>待っている間、針の先端の鉗子、またはワイパーは繊細なタスクに分割することにより面取りを作成する角度で壊れたで準備があることを確認します。<ol>
<li>次のパラメーターを使用してマイクロ ピペット引き手を引いて、毛細管ガラスから針: 熱 545;プル 60;速度 80;時間 250;圧力 500。(接眼部径推定法の定規) と郭清範囲の下に鉗子で角約 45 ° で鉗子を保持することによって針を破る。マイクロインジェクター設定によって変数をすることができます必要なニードル径が小さい直径、胚の死亡率を減少させるため推奨。</li>
	</ol>
</li>
	<li>魚は、卵を産んでいる、一度 10 cm 径シャーレでそれらを収集し、郭清範囲にそれらをもたらします。すべて異常な胚を削除および魚の無駄。</li>
	<li>ピペットに準備された 3% の agarose 注入受精卵型します。場所に胚を保つために余分な水を削除します。</li>
	<li>すべての行は、実行可能な胚で満ちている、一度単一のすべてのセルが約 45 ° の角度で水平方向にある針に向かって同じ方向を向くように配置します。これする注入が簡単に後で。</li>
	<li>手袋を着用しながら 20 μ L ロード ピペットを使用して、ヒントし、氷のチューブから準備された構成の 5 μ L を削除します。</li>
	<li>慎重に先端近くに試薬を痛まなくて、タッパーを出すまで壊れた毛管チューブのバック エンドに先端を挿入します。空気の泡がある場合、は、先端を壊さないようにして、針を振る。</li>
	<li>マイクロインジェクション針ホルダーにまっすぐ針を挿入し、針の位置に固定されるまで慎重に締め。約 45 ° までの角度を調整します。</li>
	<li>針が準備し、添付、顕微鏡およびガス圧力タンクを入れます。商業 CO2タンクは通常この目的に適しています。保持と射出圧力で噴射量を調整: 0.5 psi の保持のため、放出の 30 の psi を近似します。必ずペダルを押すときに解決策が出てくることを確認してください。</li>
	<li>ボリュームおよび 〜 150 μ m の解決策の流れ調整鉱物油のドロップでステージ マイクロメータを使用する (約 2 nL)。背圧針のうち点滴少量できるようになることを確認します。十分な背圧がない場合、毛細管は針を入力して mRNA を破壊する液体になります。</li>
	<li>針が校正され、受精胚の単一のセルにコンストラクトを注入を開始します。 注: これは大量の練習、忍耐力と繊細さ、細胞膜を貫通しにくいためかかります。セル、卵黄はない、トランスジェニックゼブラフィッシュを生成するために薬液を注入することが重要です。これは morpholino 注入から異なります。どっち針に入る限り構造体は、セル、セルの問題ではないです。セルではなく卵黄に注入される場合、遺伝子は非常に低い成功率を持ちます。単一セル段噴射も重要であるまたは体細胞キメラ魚が作成されます。これは生殖細胞に入る遺伝子の可能性が低くなります。</li>
	<li>胚の場所で保持でき、胚を動かさずに圧力を適用するのに針の支持を提供するためにゲルのノッチのエッジを使用します。針の先端は、単一のセル、ソリューションの適切な量を解放するためにペダルを押します。胚のすべてに対してこのプロセスを繰り返します。</li>
	<li>完了したら、魚システム水と使い捨て 3.4 mL 転送ピペット agarose の切り込みからそれらを洗浄によってラベル付けされた皿に注入された胚を転送します。胚を開発できるようにする 28.5 ° C の定温器に格納します。死んだ魚の胚を取り外し終日戻って確認し、魚の水に 0.1% メチレン ブルーと水を交換します。</li>
	<li>注入後、約 6-8 時間取る 10 個々 の注入は胚を魚し、名手法18を使用してそれらからゲノム DNA を準備します。</li>
	<li>次の朝は、卵黄以外の組織における GFP を示す胚を整理する蛍光光源を解剖顕微鏡を使用します。これらの魚の胚は、注入されたコンス トラクターを含める必要があります。</li>
	<li>19を前述のように、トランスポゾン動作をチェックするメダカ Tol2 消費税分析を実行します。摘出したプラスミドを検出できる場合保持、注入された胚を魚し、それらを上げます。摘出したプラスミドを検出されない場合は、メダカ Tol2 物品税法の肯定的な結果を達成するまでメダカ Tol2 mRNA マイクロインジェクションの合成とプロセスを繰り返します。</li>
</ol>4 遺伝子組換え ASAP1 魚、Tg の確立 (ubi: ASAP1)
<ol><li>ゼブラフィッシュ本20で前述した成人に注入された魚 (F0世代) を上げます。これは通常約 4 ヶ月がかかります。</li>
	<li>シングル大人 F0に魚を取るし、反対の性別の野生型魚シングル クロスします。後の日に繁殖した魚の胚を収集します。0.1% メチレン ブルーと水の魚で 28.5 ° C の定温器で収集した魚の胚を維持。</li>
	<li>3 日目、GFP フィルターと蛍光解剖顕微鏡の下に魚の胚を確認します。存在する場合、緑の魚の胚を整理し、F1世代遺伝子組換え魚、Tg として大人にそれらを上げる (ubi: ASAP1)。 注: 親の F0魚のほとんどは細菌ライン遺伝子キメラ メンデル比は想定されていません。</li>
	<li>野生型の魚の単一の F1成魚をクロスし、魚の胚を収集します。緑の魚の胚を整理し、F2世代魚として大人にそれらを上げます。 注: 緑と非緑の魚の胚に近くなるはず 1:1 単一の遺伝子があるか。</li>
	<li>悪性末梢神経鞘腫瘍 (鞘) のような腫瘍の電気潜在的な変更を表示するクロス F2世代 Tg (ubi: ASAP1) rpl35hi258/重量魚と魚。目に見える腫瘍が 6-8 ヶ月大人21,22を開始することが知られています。</li>
</ol>5. イメージング
<ol><li>ゼブラフィッシュ胚の画像、複数の F2世代創始者に魚を取る個々 のペアで野生型魚とそれらを交差します。ステージング ガイド23ゼブラフィッシュによると異なる必要な発達段階で魚の胚を収集します。</li>
	<li>魚の胚の初期段階で、皮をむくし、慎重に 10 cm 径シャーレ魚システム水で郭清範囲下組の鉗子を用いた胚の絨毛を削除します。</li>
	<li>3.4 mL 使い捨て可能な移動のピペットを使用して 3% セルロースと凹面ガラスのスライドにいくつかの魚の胚を転送します。蛍光郭清範囲の下に針を使用して携帯電話の GFP のアクティビティを表示する目的の位置に胚を調整します。</li>
	<li>魚の胚 (12 体節期以前) の移動の段階では、スライドに転送する前に魚の胚を麻酔するのに 0.05 %tricaine 酸イマチニブを使用します。簡単に言えば、彼らはスイミングとボディ バランスの損失を停止するまで魚の胚が魚水 0.05 %tricaine 酸イマチニブに出現しました。また、スライドに 0.05 %tricaine メシル酸、セルロースとのドロップを追加します。</li>
	<li>未満 12 体節期魚胚、互換性のあるカメラとソフトウェア イメージング用エピ蛍光顕微鏡を使用します。12 体節胚の魚よりも古い、蛍光解剖顕微鏡を使用します。</li>
	<li>腫瘍のセル電圧をイメージ、最初鞘腫魚を識別します。その後、0.05 %tricaine 酸イマチニブで魚を麻酔します。全体のマウント用に、10 cm 径シャーレに魚を置きます。腫瘍細胞の電気的活動を表示するには、魚腫瘍のうち全台紙のイメージング後解剖にしたことがあります。</li>
</ol>

<ol>
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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+Imaging+of+Voltage+and+Calcium+Signals+Reveals+Neural+Processing+In+Vivo.">Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo.</a> Cell. 166 (1), 245-257 (2016).</li><li>Chamberland, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+two-photon+imaging+of+subcellular+voltage+dynamics+in+neuronal+tissue+with+genetically+encoded+indicators.">Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Hochbaum, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins.">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).</li><li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo.">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

萌芽期の開発および人間の病気中の細胞およびティッシュ レベル電気活動が長い時間前に発見されたが生体内での動的電気的変化とその生物学的役割まだ主は不明のまま。電気的変化を定量化を視覚化して主要な課題の 1 つです。パッチ ・ クランプの技術は単一のセルを追跡するため、休憩が、彼らは多くの細胞で構成されているために、脊椎動物の胚への応用は限られました。現?...

生体電気は、イオン チャネルと1の細胞膜にあるポンプを介する内因性電気信号を指します。細胞膜と結合電気潜在的な現在の変化の間でイオン交換が興奮性神経細胞と筋肉細胞のプロセスを通知するに不可欠です。さらに、生体電気とイオン勾配エネルギー貯蔵、生合成および代謝産物の輸送を含む他の重要な生物学的機能のさまざまながあります。生体信号は、体軸、細胞周期、細胞分化1などの胚パターン形成の調節因子としても発見されました。したがって、シグナリングのこのタイプの誤規制から生じる多くの人間の先天性疾患を理解するために重要です。パッチク ランプは、単一のセルを記録するため広く使用されています、萌芽期の開発の生体の中に複数のセルの同時モニタリングのための理想には程遠いです。また、電圧敏感な小さな分子はまた生体内特異性、感度、毒性などのアプリケーションに最適ではありません。
多様性の創出遺伝子蛍光電圧インジケーター (GEVIs) を提供していますこの問題を克服するために新しいメカニズムをエンコードでき、萌芽期の開発の研究を簡単に適用にもかかわらず、本来神経を監視するためだった2,3のセルします。現在利用可能な GEVIs の 1 つは加速センサーの活動電位 1 (ASAP1)4です。それは電圧敏感なホスファターゼと円形に置換された緑色蛍光タンパク質の電位センサー ドメインの細胞外ループで構成されます。したがって、ASAP1 は、細胞電位変化の可視化 (偏波: 明るい緑色; 脱分極: ダーク グリーン)。ASAP1 が 2 ms オンとオフ反応ありサブスレッショルド潜在的な変更4を追跡することができます。したがって、この遺伝子解析ツールは生きているセルのリアルタイム生体監視機能の有効性の新しいレベルのことができます。萌芽期の開発で多くの人間の病気、癌などの生体電気の役割のさらなる理解が新しいに光を当てるメカニズム, 病気の治療と予防のために重大であります。
ゼブラフィッシュは、発生生物学、がん5,6を含む人間の病気の研究に強力な動物モデルを実証されています。彼らは、人間とオーソログ遺伝子の 70% を共有して同様の脊椎動物の生物学7。ゼブラフィッシュは、比較的簡単なケア、ラージ クラッチ サイズ卵、扱いやすい遺伝学、簡単な遺伝子、透明な外部萌芽期の開発、それらの生体内イメージング5,6の優れたシステムを作るを提供します。既に現在の突然変異体の魚行の大規模なソースと完全に配列されたゲノム、ゼブラフィッシュは科学的発見の比較的無制限の範囲を提供します。
生体内でリアルタイム電気細胞の活性を調べるためには、私たちはゼブラフィッシュ モデル システムと ASAP1 の活用します。本稿では、メダカ Tol2 トランスポゾン遺伝子導入を用いたゼブラフィッシュ ゲノムに電圧蛍光バイオ センサー ASAP1 を組み込む方法について説明し、萌芽期の開発、魚幼虫の動きの間にそしてライブ腫瘍細胞の電気活動を可視化します。.

<table><tbody><tr><td>14mL cell culture tubes</td><td>VWR</td><td>60818-725</td><td>E.Coli culture</td></tr><tr><td>Agarose electrophoresis tank</td><td>Thermo Scientific</td><td>Owl B2</td><td>DNA eletrophoresis</td></tr><tr><td>Agarose RA</td><td>Amresco</td><td>N605-500G</td><td>For making the injection gels</td></tr><tr><td>Attb1-ASAP1-F primer</td><td>IDT DNA</td><td>GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA&lt;br /&gt;GCAGGCTTCACCATGGAGACGA&lt;br /&gt;CTGTGAGGTATGAACA</td><td>ASAP1 coding region amplification for subcloning</td></tr><tr><td>Attb2-ASAP1-R primer</td><td>IDT DNA</td><td>GGGGACCACTTTGTACAAGAAA&lt;br /&gt;GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC&lt;br /&gt;AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA</td><td>ASAP1 coding region amplification for subcloning</td></tr><tr><td>Bright field dissection scope</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td>Dechorionation, microinjection, mounting</td></tr><tr><td>Color camera</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRc</td><td>Fish embryo image recording</td></tr><tr><td>Concave slide</td><td>VWR</td><td>48336-001</td><td>For holding fish embryos during imaging process</td></tr><tr><td>Disposable transfer pipette 3.4 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>Fish embryos and water transfer</td></tr><tr><td>Endonuclease enzyme, Not I</td><td>NEB</td><td>R0189L</td><td>For linearizing plasmid DNA</td></tr><tr><td>Epifuorescent compound scope</td><td>Zeiss</td><td>Axio Imager.A2</td><td>Fish embryo imaging</td></tr><tr><td>Epifuorescent stereo dissection scope</td><td>Zeiss</td><td>Stereo Discovery.V12</td><td>Fish embryo imaging</td></tr><tr><td>Fluorescent light source</td><td>Lumen dynamics</td><td>X-cite seris 120</td><td>Light source for fluorescence microscopes</td></tr><tr><td>Forceps #5</td><td>WPI</td><td>500342</td><td>Dechorionation and needle breaking</td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II Enzyme mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>11789020</td><td>Gateway BP recombination cloning</td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Plus enzyme</td><td>Thermo Scientific</td><td>12538120</td><td>Gateway LR recombination cloning</td></tr><tr><td>Gel DNA Recovery Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4002</td><td>DNA gel purification</td></tr><tr><td>Loading tip</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>For loading injection solution into capilary needles</td></tr><tr><td>Methylcellulose (1600cPs)</td><td>Alfa Aesar</td><td>43146</td><td>Fish embryo mounting</td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes</td></tr><tr><td>Microinjection mold</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td>To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection</td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>WPI</td><td>Pneumatic Picopump PV820</td><td>Microinjection injector</td></tr><tr><td>Micro-manipulator</td><td>WPI</td><td>Microinjector MM3301R</td><td>Microinjection operation</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter instrument</td><td>P-1000</td><td>For preparing capillary needle</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Amresco</td><td>J217-500ml</td><td>For calibrating injection volume</td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1340</td><td>mRNA in vitro transcription</td></tr><tr><td>Monocolor camera</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRm</td><td>Fish embryo image recording</td></tr><tr><td>Plasmid Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4020</td><td>Prepare small amount of plasmid DNA</td></tr><tr><td>Plastic Petri dishes</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>For holding fish or fish embryos during imaging process</td></tr><tr><td>RNA Clean &amp;amp; Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td>mRNA cleaning after in vitro transcription</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>For measuring DNA and RNA concentrations</td></tr><tr><td>Stage Micrometer</td><td>Am Scope</td><td>MR100</td><td>Microinjection volume calibration</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td>DNA amplification for gene cloning</td></tr><tr><td>Thin wall glass capillaries</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td>Raw glass for making cappilary needle</td></tr><tr><td>Tol2-exL1 primer</td><td>IDT DNA</td><td>GCACAACACCAGAAATGCCCTC</td><td>Tol2 excise assay</td></tr><tr><td>Tol2-exR primer</td><td>IDT DNA</td><td>ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG</td><td>Tol2 excise assay</td></tr><tr><td>TOP10 Chemically Competent E. coli</td><td>Thermo Scientific</td><td>C404006</td><td>Used for transformation during gene cloning</td></tr><tr><td>Tricaine mesylate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>For anesthetizing fish or fish embryos</td></tr><tr><td>UV trans-illuminator 302nm</td><td>UVP</td><td>M-20V</td><td>DNA visualization</td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Thermo Scientific</td><td>2853</td><td>For transformation process of gene cloning</td></tr></tbody></table>

visualization of cellular electrical activity in zebrafish early embryos and tumors

生体電気、イオン チャネルを介する内因性電気シグナル伝達と細胞膜にあるポンプなど興奮性神経細胞と筋肉細胞のプロセスおよび他の多くの生物学的プロセスのシグナル伝達に重要な役割を果たしている萌芽期発達のパターン。しかし、生体内で電気的活動は、脊椎動物の胚発生の監視の必要性があります。遺伝的コード化蛍光電圧インジケーター (GEVIs) の進歩はこのような課題に対してソリューションを提供する可能にしました。ここでは、確立された電圧インジケーター、ASAP1 を用いたトランスジェニック電圧インジケーター ゼブラフィッシュを作成する方法について説明 (加速センサーの活動電位 1)、例として。メダカ Tol2 キットとユビキタス ゼブラフィッシュ プロモーター、ユービーアイは本研究で選ばれました。我々 はまた、ゲートウェイ サイト固有のクローニング、メダカ Tol2 トランスポゾンを用いたゼブラフィッシュ遺伝子と正規 epifluorescent 顕微鏡を使用して初期段階魚胚および魚腫瘍イメージング プロセスのプロセスを説明します。この魚のラインを使用すると、ゼブラフィッシュ胚発生と魚の幼虫の動きの間に細胞の電気電圧の変化があることがわかった。さらに、いくつかのゼブラフィッシュ悪性末梢神経鞘腫瘍の周囲の正常組織に腫瘍細胞が一般に偏極が比較して観察されました。

成功した射出、以上 50% 注入魚胚体細胞に緑の蛍光性の程度が表示され、それらのほとんどはメダカ Tol2 トランスポゾン消費税法 (図 2) によってプラスになります。2 4 世代のアウトなしの野生型魚 (まで蛍光魚 50%、メンデルの予想比) とクロス後、遺伝子導入魚は、萌芽期の開発の間に細胞の膜電位を追跡するイメージングの実験のために使用?...

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Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化

ここでは、胚の動きを可視化する携帯電話の電気電圧記者ゼブラフィッシュ ラインを作成するプロセスを示す、魚腫瘍細胞の生体内で。

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

visualization-cellular-electrical-activity-zebrafish-early-embryos

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.7K ビュー.  Purdue University. ここでは、胚の動きを可視化する携帯電話の電気電圧記者ゼブラフィッシュ ラインを作成するプロセスを示す、魚腫瘍細胞の生体内で。

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Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

開発ゼブラフィッシュ前脳におけるクローン関連の神経前駆細胞のタイムラプスライブイメージング

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

神経科学

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

生きたゼブラフィッシュ胚における運動ニューロン膜電位のバイオセンシング

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

発生生物学

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

生物学

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

ゼブラフィッシュ幼生における前脳電気生理学的記録

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

細胞運動やゼブラフィッシュ胚における個々の神経細胞と神経堤細胞のアクチン細胞骨格のライブイメージング

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Brainbowとタイムラプス共焦点イメージングを用いた生きているゼブラフィッシュの発達脳の可視化

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

トランスジェニックゼブラフィッシュの多色タイムラプスイメージング：標的神経細胞のアブレーションによって活性化を可視化網膜幹細胞

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

イメージングおよび胚ゼブラフィッシュにおける脳血管構造物の3次元再構成

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

ゼブラフィッシュ胚における組織特異的蛍光の半自動イメージング

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at cellular and subcellular resolution. Advances in molecular and imaging technologies have allowed us to gain numerous detailed insights into cellular and molecular mechanisms of brain development in the transparent zebrafish embryo. Recently, processes of refinement of neuronal connectivity that occur at later larval stages several weeks after fertilization, which are for example control of social behavior, decision making or motivation-driven behavior, have moved into focus of research. At these stages, pigmentation of the zebrafish skin interferes with light penetration into brain tissue, and solutions for embryonic stages, e.g., pharmacological inhibition of pigmentation, are not feasible anymore.
Therefore, a minimally invasive surgical solution for microscopy access to the brain of awake zebrafish is provided that is derived from electrophysiological&#160;approaches. In teleosts, skin and soft skull cartilage can be carefully removed by micro-peeling these layers, exposing underlying neurons and axonal tracts without damage. This allows for recording neuronal morphology, including synaptic structures and their molecular contents, and the observation of physiological changes such as Ca2+ transients or intracellular transport events. In addition, interrogation of these processes by means of pharmacological inhibition or optogenetic manipulation is feasible. This brain exposure approach provides information about structural and physiological changes in neurons as well as the correlation and interdependence of these events in live brain tissue in the range of minutes or hours. The technique is suitable for in vivo brain imaging of zebrafish larvae up to 30 days post fertilization, the latest developmental stage tested so far. It, thus, provides access to such important questions as synaptic refinement and scaling, axonal and dendritic transport, synaptic targeting of cytoskeletal cargo or local activity-dependent expression. Therefore, a broad use for this mounting and imaging approach can be anticipated.

Here we present a method to image the zebrafish embryonic brain in vivo upto larval and juvenile stages. This microinvasive procedure, adapted from electrophysiological approaches, provides access to cellular and subcellular details of mature neuron and can be combined with optogenetics and neuropharmacological studies for characterizing brain function and drug intervention.

目覚めしたゼブラフィッシュ幼虫と頭蓋骨と皮膚除去による若年組織の完全に活性な脳組織のインビボイメージング

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...