Name: visualizing multiciliated cells in the zebrafish through a combined protocol of whole mount fluorescent in situ hybridization and immunofluorescence
Uploaded: 2017-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence at JoVE.c

이 작품은 원시와 국립 과학 재단 대학원 연구 친교 제를 부여 R01DK100237에 의해 부분적으로 지원 A.N.M. DGE-1313583 우리는 또한 대학의 과학 여름 학부 연구 친교 프로그램 M.U. 지원 위한 감사 합니다. 우리는 Zebrafish의 Notre Dame 대학 우리의 zebrafish의 전용된 그들의 관리에 대 한 연구는 센터를 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 생물 학적 과학의 부서 뿐만 아니라 그들의 지원 및 중요 한 통찰력의 모든 연구소의 회원을 감사 하 고 싶습니다.

다음 프로토콜 사용 zebrafish 성인 Zebrafish의 Notre Dame 대학에서 연구를 위한 센터에 의해를 걱정 하 고 유지 합니다. Zebrafish 성인 및 태아에 대 한 모든 방법은 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 배아 고정
<ol><li>Zebrafish 태아 앞에서 설명한 방법39,40을 사용 하 여 수집 합니다. 24 hpf, 배아에 E3에 일반적인 효소 혼합물 해결책 (50 mg/mL)의 500 µ L 상 온 (RT) 품 요리를 추가.</li>
	<li>배아는 chorion의 돌발을 시작, 일단 태아 요리에서 모든 액체를 제거 합니다.</li>
	<li>E 3의 약 20 mL를 추가 하 고, 부드럽게 접시에는 E3 소용돌이 다음 액체 폐기물 용기에 액체를 decanting 여 2-3 회 신선한 E3와 배아를 씻어.</li>
	<li>수정 하기 전에 배아를 안락사는 e 3에 0.2 %tricaine 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>플라스틱 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 5 mL 유리 유리병에 배아를 전송 합니다. 배아는 유리병의 바닥에 정착 후는 피 펫을 사용 하 여 tricaine/E3 솔루션의 대부분을 제거 합니다.</li>
	<li>4 %paraformaldehyde (PFA)의 5 mL와 함께 동요 없이 RT에 2-4 h 24 hpf 배아 수정. 주의: PFA 독성 하 고 연구원 눈 보호, 장갑, 그리고 실험실 외 투를 착용 하는 동안 화학 후드 PFA 솔루션을 처리 해야 합니다. 입자가 굵은 PFA 파우더 PFA 정착 액의 준비 입자가 굵은 PFA 정전기를 통해 분산 경향으로 우수한 치료와 함께 수행 되어야 한다. 참고: 배아 4% PFA 4 ° c.에 하룻밤 사이에서 고칠 수 있다 준비 4 %PFA 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 종 x 1 지속적으로 해결책을 교 반 하면서가 열 하 여 완전히 입자가 굵은 PFA 해산. 일단 솔루션은 실시간, PFA는 0.45 μ m 진공 여과 위한 일회용 시스템을 통해 그것을 전달 하 여 살 균 필터 4% 아래로 다시 냉각 후 및 저장-20 ° c.에 대 한 15 mL 또는 50 mL 부분으로 aliquoted</li>
	<li>4 제거 %PFA 및 1 X 인산 염 버퍼와 두 번 세척 배아 0.1% 식 염 수 트윈-20 (PBST)에서 실시간 실시간 추가 5 mL 신선한 100%에서 100% 메탄올 (MeOH)의 5 mL로 한 번 태아를 씻어 MeOH 배아를 고 적어도 20 분 동안-20 ° C에서 품 어. 참고: 배아는 100%에 저장할 수 있습니다 MeOH 배아 준비를 위한 준비까지-20 ° C에서.</li>
</ol>2. 태아 준비와 교 잡
<ol><li>50%의 5 mL에 한번 세척 하 여 배아를 rehydrate MeOH 1에서 30%의 5 ml에서는 배아를 세척 하 여 실시간 계속 재에서 5 분 동안 x PBST 1에서 MeOH 실시간에 5 분 동안 x PBST 1의 5 mL에 배아를 씻어 5 분 각각에 대해 두 번 x PBST 실시간</li>
	<li>1에서 1:1,000 가수분해 K의 솔루션 (pK) (10mg/mL) 5 mL에 그들을 배양 하 여 배아를 permeabilize 실시간에서 2 분 x PBST 그러나 참고: 이전 배아 수 있습니다 알을 품을 5 mg/mL 및 외피의 농도 시간 2 분 미만, 위에 명시 된 pK 농도에서 2 분 24 미만 태아에 대 한 제안 보다 더 이상 hpf.</li>
	<li>PK 솔루션 및 세척 즉시에 1 x PBST 실시간에 두번 수정 배아 4%의 5 mL의 5 mL을 제거 PFA RT 적어도 20 분 동안에. 참고: 배아 4% PFA 4 ° c.에 하룻밤 사이에서 고칠 수 있다</li>
	<li>PFA 및 세척 두 번에 1의 5 mL을 제거에서 실시간 x PBST</li>
	<li>1의 5 mL에 배아를 전송 평면 바닥 microcentrifuge 튜브 x PBST microcentrifuge 선반에 각 배아와 후속 교 잡 솔루션 간의 상호 작용을 촉진 하는 RT에 똑바로 배치.</li>
	<li>신선한 Hyb + 실시간 추가 1.5 mL에서 교 잡 솔루션 (Hyb +)의 1.5 mL에 두 번 배아를 세척 하 고 4-6 h 동안 교 잡 오븐에서 70 ° C에 태아를 품 어.</li>
	<li>프로브 솔루션의 볼륨의 Hyb + 1.5 mL를 바꿉니다 (10 µ L RNA 프로브/500 µ L Hyb +)는 배아를 완벽 하 게 커버 하기에 충분. 참고: 음성 antisense RNA 프로브를 사용 하 여 이전에 설명한 방법39합성.</li>
	<li>동요 하지 않고 microcentrifuge 랙에 위치 개별 관 직으로 70 ° C에서 교 잡 오븐에서 밤새 조사를 교배.</li>
</ol>3. 뜨거운 세척 및 차단
참고: 뜨거운 세척 배아에 적절 한 솔루션을 추가 하 고 다음 70 ° c.에서 교 잡 오븐에 잠복기에 의해 수행 됩니다. 70 ° C에 세척 솔루션을 지키려고 장소 50 mL 튜브 각 솔루션의 교 잡 오븐 때 프로브 / Hyb + 혼합물 추가 됩니다.
<ol><li>프로브를 제거 합니다. 20-30 분 각 염-나트륨 시트르산 (SSC) 버퍼 x 50 %formamide / 2의 1.5 mL에서 70 ° C에서 두 번 배아를 씻어. 참고: 프로브-20 ° C에서 Hyb +에 저장 되며 나중에 다시 사용 될 수 있습니다.</li>
	<li>2의 1.5 mL에서 70 ° C에서 배아를 한 번 씻어 15 분에 대 한 x SSC 20-30 분 각 0.2 X SSC의 1.5 mL에서 70 ° C에서 두 번 배아를 씻어. 차단 시 약의 1.5 mL와 바꾸기 0.2 x SSC 및 4 ° c.에서 밤새 품 어 참고: 그것은 하룻밤 대신 4 h에 대 한 실시간에 차단 시 품 어 수 있습니다.</li>
</ol>4. 항 체 외피와 Maleic 산 버퍼 세척
참고: 배아 주위 빛 으로부터 보호 유지.
<ol><li>1:1,000의 비율로 차단 시에 반대로 DIG-포드의 0.2 mL 차단 시 약 교체 및 3 h 호 일 또는 실시간에 다른 빛 차단 커버 아래에 품 어 참고: 또는, 항 체 수 품 어 하룻밤에 4 ° c.</li>
	<li>3 h 후 배아를 maleic 산 2-4 회 10-15 분 각 실시간 품 배아 1.5 ml 신선한 maleic 산 버퍼의 4 ° C에서 하룻밤에 대 한 버퍼의 1.5 ml에서 씻으십시오. 참고: 그것은 하룻밤 사이, maleic 산 버퍼에서 품 어 필요가 없습니다 하지만 하 고 이렇게 조사 배경 감소.</li>
</ol>5. 프로브 탐지 및 과산화 효소의 제거
참고: 배아 주위 빛 으로부터 보호 유지.
<ol><li>Maleic 산 버퍼를 제거 하 고 1x PBS의 1.5 mL를 바꿉니다. 실시간에서 60 분에 대 한 솔루션을 얼룩이 지기 형광 5 분 동안 각각 0.2 mL에 실시간 품 배아에서 Cy3의 1 x PBS의 1.5 mL에 두 번 배아를 씻어 참고: 보육 시간 다른 프로브에 대 한 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>RT에서 10 분에 대 한 1 X PBS에 다음 %MeOH 1.5 mL를 한번 배아를 세척: 30 %MeOH, 50% 75 %MeOH 100% MeOH MeOH.</li>
	<li>RT에서 10 분의 1 x PBS에 다음 MeOH 솔루션의 1.5 mL를 한번 배아 실시간 세척에서 30 분 동안 MeOH에 1% H2O2 의 1.5 mL와 함께 태아를 품 어: 75 %MeOH, 50 %MeOH, 및 30 %MeOH. 1 x PBS의 1.5 ml에서 RT에서 5 분 동안 두 번 배아를 씻어. 참고: 배아에에서 저장할 수 있습니다 PBS 하룻밤에 4 ° c.</li>
</ol>6입니다. 면역 형광 검사
참고: 배아 주위 빛 으로부터 보호 유지.
<ol><li>DdH2O 5 분의 1.5 ml 배아 실시간 세척에 미리 냉장된 아세톤 (-20 ° C에서 보관 하는)의 1.5 ml 배아 한 세척 실시간에서 7 분 1.5에 한번 배아 실시간 세척에 배아 ddH2O 5 분의 1.5 mL에 한 번 세척 1 mL 실시간 5 분의 1 %DMSO (PBDT)와 x PBST</li>
	<li>2 시간에 대 한 실시간에 로커에 PBDT + 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 1.5 mL에 태아를 품 어.</li>
	<li>PBDT + FBS를 제거 하 고 기본 항 체, 안티 acetylated tubulin (마우스에서 생산) 및 안티-γ-tubulin (토끼에서 생산), 함께 1:400 PBDT + 1%에 희석의 1.5 mL를 바꿉니다 FBS. 밤새 4 ° c.에 태아를 품 어 참고: 보육 시간 1 차 항 체에 따라 달라질 수 있습니다. 다른 시간 간격의 테스트 라벨 최적화를 해야 수 있습니다.</li>
</ol>7. 이차 항 체
참고: 배아 주위 빛 으로부터 보호 유지.
<ol><li>FBS + 로커에 RT에 1 분 동안 0.1 M NaCl 배아에서 초과 언바운드 항 체를 제거 하려면 PBDT + 1%의 1.5 ml에서 씻으십시오.</li>
	<li>배아를 씻어 PBDT + 1%의 1.5 mL에 5 번 FBS + 실시간에 로커에 각 30 분 0.1 M NaCl 배아에에서 씻어 1.5 mL PBDT + 1 %FBS 로커에 RT에서 30 분.</li>
	<li>이차 항 체의 200 µ L에 4 ° C에서 하룻밤 태아를 품 어 알 렉 사 488 염소 반대로 마우스 IgG와 알 렉 사 647 염소-토끼 IgG, 1: 500에 PBDT에 함께 희석.</li>
</ol>8. DAPI 얼룩
참고: 배아 주위 빛 으로부터 보호 유지.
<ol><li>워시 배아 신속 하 게 RT에서 PBDT의 1.5 mL에 두 번. PBDT DAPI의 1.5 mL, 희석 1:15000 1 X PBST에 고는 로커에 RT에서 15 분을 품 어.</li>
	<li>1.5 ml PDBT + 1%의 배아를 씻어 FBS + 0.1 M NaCl 3 번 15-20 분에 대 한 실시간에. 마운트 및 이미지 준비가 될 때까지 4 ° C에서 PBDT의 1.5 mL에 배아를 저장 합니다.</li>
</ol>9. 장착 및 Zebrafish Pronephros 이미지
<ol><li>작은 볼륨, PBDT의 약 10 µ L에에서 유리 슬라이드에 누워 태아 측면.</li>
	<li>한 켤레 미세 집게는 머리를 제거 하 고 노 른 자 공의 일부와 눈 뒤에 배아를 짠 다.</li>
	<li>미세 집게를 사용 하 여 부드럽게 긁어 떨어진 태아 몸에서 남은 노 른 자 공. 얇은 티슈로 슬라이드에서 천연된 노 른 자 및 여분 액체를 제거 합니다.</li>
	<li>미디어는 태아의 나머지 꼬리를 장착 한 방울을 추가 하 고 위치는 꼬리 옆으로 누워. 샘플, 병합 다음 커버 슬라이드 상자에 꼬리 위에 coverslip을 놓습니다.</li>
	<li>신장 속눈썹에 다음과 같은 채널을 사용 하 여 confocal 현미경 60 배 확대에 이미지: 파란색에서 DAPI (408.0 설정 레이저 nm), 녹색에서 FITC (488.0 설정 레이저 nm), Cy3 염료-표시 된 빨간색에서 (561.0 설정 레이저 nm), 및 흰색에서 알 렉 사 680 (637.0 설정 레이저 nm).</li>
</ol>

<ol>
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N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+Mount+Preparation+for+Observation+and+Analysis+of+Zebrafish+Embryo+Specimens+Stained+by+Whole+Mount+In+situ+Hybridization.">Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization.</a> J Vis Exp. (89), e51604 (2014).</li><li>Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Manual+Small+Molecule+Screen+Approaching+High-throughput+Using+Zebrafish+Embryos.">A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. (93), e52063 (2014).</li></ol>

저자는 공개 없다.

위의 상세한 프로토콜 pronephros odf3b 성적표와 α-tubulin 24 hpf zebrafish 태아에 있는 MCCs를 라벨에 대 한 최적화 됩니다. 최상의 결과 얻으려면 갓 고정 하 고 준비 된 배아를 사용 하는 것이 좋습니다. 고정 되어 MeOH 또는 Hyb + 1 주 이상-20 ° C에서 저장 된 배아 배아 저장소에 유지 됩니다 시간 증가 얼룩 원치 않는 배경의 확률만 사용할 수 있습니다.
수정 및이 기술의 문제 해결 특정 마커, 예를 들어 다른 센스 riboprobes 및 다른 항 체의 다른 제품군에 대 한이 메서드를 조정할 필요가 있습니다. 전체 산 현장에서 교 잡 과정 단계 매개 변수를 조정 하기 위한 많은 방법이 있다 이전 우리의 그룹 및 다른 사람에 의해31,,3436,38, 문서화 39. 마찬가지로, 각 단백질 항 체 얼룩이 번, 측면에서 몇 가지 문제 해결 필요 합니다 하 고 희석 및 보육 시간 각 1 차 항 체에 대 한 대략적인 범위는 최고의 문서화 된 결과28, 의 평가 의해 추정 35. 24 미만 태아에 대 한 hpf, pK 치료 2 분 보다 짧은 있어야 어디 24 보다 오래 된 배아 hpf pK 2 분 이상 대우 되어야 한다. 또한, 24 보다 더 오래 된 배아 hpf pK 치료 하기 전에 안료의 표백 한다.
형광 성 얼룩 솔루션 얼룩 후 메탄올과 과산화 수소 세척의 시리즈를 수행 하 여 모든 나머지 얼룩, 항 체, 및 peroxidases를 제거 하는 중요 한 이다. 바로 다음 PBS 세척은 배아에서 초과 메탄올을 제거 하는 중요 한. 만약 항 체를 계속 하기 전에 중요 한 것은, 우리는 그 아세톤 및 이온된 수 세척 배아 서로 또는 원심 분리기 튜브 준수 하 게 발견 했다. 우리의 경험, 특정 전사 인자와 다른 유전자에 대 한 항 체에 그들은에서 효율적으로 일할 수 있습니다 비록 서양 지우고에서 zebrafish에 경우에 잘 작동 하지 않습니다. 그러나, 매우 보존 하 고 풍부한 단백질, tubulin α 및 β-catenin 같은 경우16,37제 브라에서 잘 작동지 않습니다.
물고기, 그것 되지 않은 아직 특정 항 체는 제 브라에서 유전자의 RNA 사본을 시각화 가능 하다. 경우 물고기를 결합해 서,이 프로토콜에 의해 증명으로 볼 vivo에서 (그림 2) RNA 사본 및 단백질의 공동 지역화 될 수 있습니다. 프로토콜의 유연한 특성 다양 한 RNA 사본 및 수많은 조직 및 시간 포인트에서 단백질의 시각화에 대 한 빠른 문제 해결 수 있습니다. Zebrafish 태아의 이미 존경 받는 특성 결합, 생선 + IF이이 프로토콜 유전자와 단백질 중요 한의 식을 발달 통로 규제를 탐험 다른 도구를 제공 합니다.

지난 몇 년간 제 브라 (Danio rerio) 개발 생물학을 공부 하는 주요 모델 생물으로 떠오르고 있다. 태아는 어머니 이상으로 개발 하 고 광학 투명. 또한, 눈, 신장, 개 등 중요 한 장기의 형성, 그냥 24 시간 게시물 수정 (hpf)에 의해 형성 된 구조와 발생 합니다. 중요 한 것은, zebrafish 게놈이 포유류1,2,3높은 보존 된다. 또한, 제 브라와 포유류 장기 비슷한 해부학과 생리학 있다. 제 브라 미 발달 신장, 또는 pronephros, 초기 nephrogenesis 및 척추 nephron4, 의 보존된 상피 세포 인구의 운명 결정 하는 동안 유전자 기능을 조사 하기 위한 모델 시스템의 값을 보여 줍니다. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. 마찬가지로, zebrafish 태아 MCCs11,12,13,,1415, 의 그렇습니다 검사에 점점 더 중요 해지고 있다 16 , 17.
그들의 이름에서 알 수 있듯이, Mcc는 상피 세포 꼭대기 표면17에 있는 운동 속눈썹의 특징 이다. Zebrafish에서 MCCs 유체 흐름에서 작동 하 고 24 hpf11,12,,1314, "salt-and-pepper"는 pronephros의 각 nephron의 중간에 걸쳐 패션에 분산 되어 있는 15 , 16 , 17. 비록 그들은 단지 한 줌에 지적 되었습니다 인간 신장의 질병 케이스18,,1920,21, MCCs 두뇌 같은 다른 포유류 조직에서 유행 하 고 기관22,23,24, 실험 설계에 대 한 도전의 호스트 포즈는. Zebrafish를 포함 한 다양 한 척추 동물 모델에서 우아한 연구 노치 신호 전달 경로 고객 센터 개발12,,1725 의 억제제로 보존된 통로 MCC 운명의 증명 ,2627. 따라서, zebrafish pronephros MCC 개발 vivo에서11,12,,1314, 의 유전 메커니즘을 연구 하 쉽게 접근할 수 있는 모델 제공 15 , 16 , 17.
투명성과 zebrafish 태아의 쉬운 유전자 조작 입증 귀중 한 특성 세포 운명, 조직 성장, 및 초기 배아1,2 개발 유전과 분자 경로 공부를 할 때 ,3. 현장에서 교 잡 등 전체 마운트 경우 단백질 및 유전자 내용은 시각화에 적용 되었고 zebrafish16,,2829에 대 한 최적화를, 전통적인 기법으로 30,31,32,33,34,35,36,,3738. 물고기와 IF에 대 한 인기 있는 프로토콜을 결합 하 여 레이블 및 Mcc vivo에서16,28,,3738분석 하 가능 하다.

<table><tbody><tr><td>non-specific protease mixture solution</td><td>Roche</td><td>11459643001, pronase from Streptomyces griseus</td><td>Dilute in E3 &lt;strong&gt;without&lt;/strong&gt; methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>E3 solution</td><td></td><td></td><td>Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination</td></tr><tr><td>tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td><td>Fluka</td><td>A5040-250G</td><td>To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL</td></tr><tr><td>embryo dishes</td><td>VWR</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>5 mL glass vials</td><td>Wheaton</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>disposable plastic Pasteur pippettes</td><td>VWR</td><td>414004-004</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde (PFA) solution</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>19210</td><td>Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20&amp;deg;C. Do not refreeze once thawed for use.</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072</td><td>Dilute in distilled water to make a 1X stock</td></tr><tr><td>Tween-20 stock</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td>Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water.</td></tr><tr><td>1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST)</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>0.1% Tween-20 in 1X PBS</td></tr><tr><td>methanol (MeOH)</td><td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr><tr><td>proteinase K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td>Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>flat bottom microcentrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>87003-300; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600</td><td>store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>hybridization solution (HYB+)</td><td></td><td></td><td>50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 &amp;mu;g/&amp;mu;L heparin; store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>hybridization oven</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-10Q</td><td></td></tr><tr><td>20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156</td><td>dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks</td></tr><tr><td>blocking reagent solution</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td>dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>maleic acid buffer solution</td><td>Sigma</td><td>M0375 and S7653</td><td>150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5)</td></tr><tr><td>anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11207739910</td><td>store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Cy3 fluorescent staining solution</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system</td><td>store at 4&amp;deg;C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide (H2O2)</td><td>Sigma</td><td>H1009-500mL</td><td>store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>molecular grade distilled water (ddH2O)</td><td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>acetone</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00636-01000</td><td>store an aliquot at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00435-01000</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10438-034</td><td>aliquot and store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td>aliquot and store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>anti-&amp;gamma;-tubulin anitbody produced in rabbit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5192</td><td>aliquot and store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>odf3b cDNA clone MGC:63985</td><td>OpenBiosystems</td><td>IMAGE:6792478</td><td>store bacterial glycerol stock at -80&amp;deg;C</td></tr><tr><td>NaCL</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915-05000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21245</td><td>store at 4&amp;deg;C; protect from light</td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td>store at 4&amp;deg;C; protect from light</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td>aliquot and store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>glass slide</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td></td></tr><tr><td>glass coverslip</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>fine forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Tweezers Pattern #55</td></tr><tr><td>mounting media</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18606, Aqua-Poly/Mount</td><td>store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>confocal microscope and associated software</td><td></td><td></td><td>We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software</td></tr><tr><td>rocker</td><td>Bio-Rad</td><td>1660710EDU</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing multiciliated cells in the zebrafish through a combined protocol of whole mount fluorescent in situ hybridization and immunofluorescence

최근 몇 년 동안, zebrafish 태아 배아 개발 utero 전 및 광학 투명도 같은 특성으로 인해 개발 생물학 공부를 인기 모델로 떠오르고 있다. 특히, zebrafish 태아 척추 신장 organogenesis multiciliated 셀 (MCC) 개발 공부 하는 중요 한 유기 체 되고있다. 배아 zebrafish 신장에서 MCCs를 시각화, 우리 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)의 결합 된 프로토콜을 개발 했습니다 하 고 전체 고해상도 이미징 수 있도록 면역 형광 (IF)를 탑재. 이 원고 공동 다양 한 혈통 요소의 표현을 통해 발달 프로그램의 규칙을 이해 하는 도구로 서 RNA 사본 및 단백질을 지역화 우리의 기술을 설명 합니다.

야생-타입 zebrafish 태아 24 고정 hpf 바로 위에서 설명한 대로 준비 하 고. 그림 1 선택한 그림된 단계 함께 실험적인 워크플로 보여 줍니다. 1-8 단계에서 설명 하는 워크플로 샘플 조달, 고정, 및 면역 형광 라벨 protein(s) 관심의 뒤 센스 riboprobes와 생 성적표를 고정된 조직의 조작의 과정을 포함 합니다. 워크플로의 단계 9 장착 및 이미징 zebrafish 배아 트렁크의 시각화를 최적화 하도록 특별히 설계 된 기술을 말합니다. 9 단계를 동반 하는 도면에서 우리 유리 슬라이드에 조직의 위치에 대 한 조작 방법을 설명 합니다. 이 단계에서 태아 머리와 노 른 자 볼 꼬리 옆으로 유리 슬라이드와 coverslip 사이 위치를 떠나 제거 됩니다. 노 른 자 공과 헤드의 제거와 노 른 자 공 자동 fluoresces 장착 과정을 방해 pronephros, 거주 고객 센터 인구 최고의 이미징에 대 한 제안입니다.
Confocal 현미경을 사용 하 여 얻은 대표 이미지 그림 2, 60 X 확대 같은 야생-타입 배아와 동일한 배율에서 디지털 줌 표시에 제공 됩니다. 상위 패널 아래쪽 두 패널은 이러한 이미지 데이터의 복합 오버레이 각 개별 채널의 이미지를 제공 합니다. (왼쪽된 열 이미지)에서 백색 상자 영역을 디지털 줌 (오른쪽 이미지)의 초점을 설명 합니다. 디지털 줌의 마지막 패널에 강조 표시, 핵, DAPI에서 표시 했다 그리고 MCCs odf3b, γ-tubulin에 항 체 나타내는 기초 시체와 α-tubulin는 속눈썹을 인식 하도록 하는 센스 riboprobe에 따라 감지 했다. 복합 오버레이의 디지털 줌에서 노란색 점선된 원 odf3b 성적표, 여러 기초, 몸과 속눈썹의 소유로 인해 확인 된 MCC의 경계를 나타냅니다. 노란 점선 동그라미 표시 된 인접 한 모노 ciliated 셀 단일 기초 신체 및 단일 cilium의 표현 형에 따라 확인 되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig1.jpg"> 그림 1: 실험 순서도의 도식. 이 중요 한 단계는 눈송이 차가운 외피를 나타냅니다의 삽화 동반 순서도 실험적인 워크플로 보여줍니다, 3 개의 곡선된 라인 열, 나타내고 시계 긴 부 화 시간을 나타냅니다. 프로토콜에서 설명한 것 처럼 오랜 시간 동안 어떤 단계를 수행할 수 있습니다 있지만 최소 6 일 (과정에서 각 단계의 숫자 오른쪽 상단 모서리에 참조)에 워크플로 수행할 수 있습니다. 설치 과정의 상세한 묘사, 유리 슬라이드와 coverslip 최종 탑재 된 배아 꼬리를 보여주는 그려집니다. 검은 점선된 박스 60 X 배율에서 이미지 영역을 설명 합니다. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56261/56261fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig2.jpg"> 그림 2: 대표 zebrafish pronephros MCCs를 시각화에 대 한 결과. 최대 이미지 확대 뿐만 아니라 같은 태아의 60 배 확대에 confocal에 디지털 줌 X 60 24 hpf 야생-타입 zebrafish 태아의 예측. 흰색 상자 확대/축소에 대 한 초점 영역을 나타냅니다. DAPI (핵), odf3b (MCCs), γ-tubulin (기초 기관), 및 α-tubulin (속눈썹)의 개별 얼룩 표시 되며 하단 2 패널에 함께 병합 다음. 디지털 줌에서 우리 같이 셀 위치의 근사를 제공: MCC 점선 노란색 원으로 개설 하 고 점선된 노란색 원 설명 모노 ciliated 셀. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56261/56261fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

속눈썹 개발 적절 한 organogenesis에 생명 이다입니다. 이 프로토콜 레이블을 하 고는 제 브라의 ciliated 셀을 시각화 하는 최적화 된 방법을 설명 합니다.

Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

visualizing-multiciliated-cells-zebrafish-through-combined-protocol

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

8.1K 조회수.  University of Notre Dame. 속눈썹 개발 적절 한 organogenesis에 생명 이다입니다. 이 프로토콜 레이블을 하 고는 제 브라의 ciliated 셀을 시각화 하는 최적화 된 방법을 설명 합니다.

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Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

Zebrafish의 Hindbrain에 라벨 부착 및 이미징 셀

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

연구

신경과학

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

발생학

Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos

The rapid proliferation of cells, the tissue-specific expression of genes and the emergence of signaling networks characterize early embryonic development of all vertebrates. The kinetics and location of signals - even within single cells - in the developing embryo complements the identification of important developmental genes. Immunostaining techniques are described that have been shown to define the kinetics of intracellular and whole animal signals in structures as small as primary cilia. The techniques for fixing, imaging and processing images using a laser-scanning confocal compound microscope can be completed in as few as 36 hr.
Zebrafish (Danio rerio) is a desirable organism for investigators who seek to conduct studies in a vertebrate species that is affordable and relevant to human disease. Genetic knockouts or knockdowns must be confirmed by the loss of the actual protein product. Such confirmation of protein loss can be achieved using the techniques described here. Clues into signaling pathways can also be deciphered by using antibodies that are reactive with proteins that have been post-translationally modified by phosphorylation. Preserving and optimizing the phosphorylated state of an epitope is therefore critical to this determination and is accomplished by this protocol.
This study describes techniques to fix embryos during the first 72 hr of development and co-localize a variety of relevant epitopes with cilia in the Kupffer&#39;s Vesicle (KV), the kidney and the inner ear. These techniques are straightforward, do not require dissection and can be completed in a relatively short period of time. Projecting confocal image stacks into a single image is a useful means of presenting these data.

Techniques are described to immunostain phospho-epitopes in whole zebrafish embryos and then conduct two-color fluorescent confocal localization in cellular structures as small as primary cilia. The techniques for fixing and imaging can define the location and kinetics of the appearance or activation of specific proteins.

전체 마운트 Zebrafish의 태아의 섬모 기관에서 면역 염색 포스 - 항원 결정기

The rapid proliferation of cells, the tissue-specific expression of genes and the emergence of signaling networks characterize early embryonic development ...

화학

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-&#946;-Hydroxysteroid dehydrogenase /&#916;5-4 isomerase (3&#946;-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3&#946;-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3&#946;-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

The interrenal gland in zebrafish is the teleostean counterpart of the mammalian adrenal gland. This protocol introduces how to perform the 3-&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase (&#916;5-4 isomerase; 3&#946;-Hsd) enzymatic activity assay, which detects differentiated steroidogenic cells in the developing zebrafish.

Interrenal Steroidogenic 조직 및 제브라 피쉬의 혈관 미세 시각화

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

생물학

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

전체 마운트하여 제브라 피쉬 배아 시편 스테인드 관찰 및 분석을위한 평면 마운트 준비<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a model for human diseases. Gene function study is based on the detection of gene expression patterns. Although immunohistochemistry offers a powerful way to assay protein expression, the limited number of commercially available antibodies in zebrafish restricts the application of costaining. In situ hybridization is widely used in zebrafish embryos to detect mRNA expression. This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish embryo sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. Immunohistochemistry and the imaging of a single cryosection were performed after in situ hybridization. The protocol is helpful to unravel the expression pattern of two genes, first by in situ transcript detection and then by immunohistochemistry against a protein in the same section.

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry of zebrafish embryonic sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. It is useful to detect the expression patterns of two genes in zebrafish if there is a paucity of antibodies.

현장 Cryosectioned Zebrafish 배아에서 면역조직화학과 결합된 혼성화

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...