作者は感謝して、米国の科学研究の空軍オフィスから受賞FA9550-13-1-0108からの支援を認めます。著者はさらに、米国の海軍研究局から表彰N00014-15-1-2502からバージニア工科大学での重要な技術と応用科学研究所から、国立科学財団大学院研究からの資金を支援を認めますフェローシッププログラム、受賞番号1607310。

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著者らは、開示することは何もありません。

私たちは、官能材料表面との生活設計された細胞をインタフェースするための新たな戦略を提示しています。これは、IPTGで誘導した場合に、ビオチンの上昇したレベルを合成することができる細胞株を開発することによって達成されました。ビオチンの上昇したレベルは、その後、官能化された表面を修飾するために使用することができます。プロトコルは、 大腸菌細胞株を操作する方法を2つの異なる官能化表面を作成する方法を詳述します。 このプロトコルでの重要なステップは、操作された細胞株の構築を通じて起こります。下流の問題を回避するために、成長曲線（ 図2）と、蛍光応答の両方で操作された細胞株を特徴付ける（ 図3）が推奨されます。手続き上の問題が発生する必要があり、このようなPCRの抽出及びギブソンアセンブリ14のような他の分子クローニング戦略は、ここでの手順のために適切に置換されてもよいです。ビオチンyieを最適化するため操作された細胞株のLDは、DTBの十分な量を細胞に提供されることを確実にするために重要です。我々の研究では、細胞をIPTGで誘導した場合、200 ngの/ mlのDTBは、ビオチン生産の実質的かつ統計学的に有意な増加を誘発したことを見出しました。さらに、BSAビオチン、SA-HRP、およびビオチンHRPのコンジュゲーションの成功は、効果的に実行すると、間接および直接制御スキームを監視するために重要です。光への不要な暴露を避けるとのコンジュゲートは、効果的な複合体が形成されていることを確認するために4℃で一晩インキュベートすることを可能にするように注意してください。 私たちのプロトコルは、そのような4&#39;-ヒドロキシアゾベンゼン-2-カルボン酸をベースとするもののような市販のビオチン検出キットと比較（PG / mLのスケール）生物学的に関連しているビオチンの少量を検出する能力に代替方法15を超える利点を提供しています競合的結合の戦略。ストレプトアビジンバイオを使用しているがスズシステムは、ビオチンの少量に対応するため、当社のシステムの能力は、私たちが直接、官能化表面との遺伝的に操作された細胞株をリンクすることができ、バイオテクノロジー16、17で一般的です。 私たちのプロトコルの一つの潜在的制限は、ビオチン検出の結果のダイナミックレンジです。間接および直接制御方式では、10 2〜10 3をそれぞれ10 4 -10 6 pg / mlで、（ 図4）との間にビオチンを検出することができます。幸いなことに、間接的な制御方式の低域は、私たちは容易に操作された細胞からのビオチンの産生を検出することができます。しかし、間接的な制御のダイナミックレンジの緊密なバンドは、ビオチン濃度の大きな変化（100倍）を感知する能力を制限します。間接および直接制御方式の両方のためのダイナミックレンジを変更すると、追加のエンジニアリングを必要とするであろう。しかし、細胞農産物の検出の場合Dビオチンは、間接的な制御方式（ 図5）のダイナミックレンジをターゲットにする研究者を可能にしなければならないステップ4.6でビオチン上清の希釈液を調製し、問題です。上清の5希釈私たちは効果的に間接的な制御方式のダイナミックレンジをターゲットにすることができ：我々は1がことがわかりました。この希釈戦略は、直接ダイナミックレンジを変更する必要性を軽減する必要があります。 ここに提示二部分、細胞材料系は、官能化された表面の組成を変更するために、細胞を操作することを可能にします。動的な、生きている細胞は、遺伝的応答を生成するためにそれらの化学的環境を解釈することができます。ビオチン生産を増加させるために、この遺伝的応答を操作することによって、我々は、官能化された表面を制御し、操作する能力で操作の生細胞を付与することができます。提示されたプロトコルに従うことにより、操作された細胞は、読み取り、処理することのできるような動的センサーを、行動することができ、かつ目の周り条件を記録します官能化されたインターフェースを介してのem。この技術は、分子医学からの環境改善のための検体検出までのフィールドに影響を与える可能性があります。

ここでは、操作された細胞株からの化学信号に応答することができるプログラム可能な基板を開発するための手順を報告しています。 1我々は、合成的に操作された大腸菌（E. coli）細胞によって産生されるビオチンに応答ビオチン-ストレプトアビジンのインタフェースを作成することによってこれを行います。以前は、プログラム可能な表面は、毒素検出2と防衛・安全保障へのポイントオブケア診断3からのアプリケーションの広い範囲のために設計されています。プログラム可能な表面は、センサやアクチュエータとして有用であり得る4が、それらは異なる環境課題に適応する能力でそれらを持たせることにより、「よりスマート」にすることができます。対照的に、 大腸菌なども簡単な微生物は、固有の適応性を有しており、洗練された、多くの場合、予期しない溶液でのチャレンジに応答することが可能です。この適応性は、Eを有効にしていますその複雑な遺伝子ネットワークによって制御される大腸菌集団は、費用対効果的にするために資源を求め、5は高付加価値製品、6、さらには電力マイクロスケールのロボットを作成します。 7プログラム可能な表面の使用で生細胞の適応の利点を結合することによって、我々は、異なる環境条件に対応できるスマートな基板を作成することができます。 合成生物学は生物の動作をプログラムするために研究者に新しい能力を与えています。新しい遺伝子調節ネットワークを含むように細胞を操作することによって、研究者は、プログラムされた行動の範囲を示す細胞を設計することができます。 図8に示すように 、基礎研究を超えて9、これらの行動は、このような材料のアセンブリを制御し、生物学的に付加価値製品を製造するような用途に使用することができます。我々はアンに合成生物学のツールを使用する方法10ここで、私たちの詳細誘導時にビオチンを合成する大腸菌株をgineer。この株は、プラスミド、pKE1-のlacI-のbioBを組み立てるために、制限酵素クローニング法を使用して開発されました。このプラスミドは、 大腸菌 K-12株MG1655に形質転換されたときに、bioBのレベルの上昇を発現する能力、ビオチン合成に必須の酵素で細胞を付与します。形質転換された細胞は、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）で誘導し、ビオチン前駆体、デスチオビオチン（DTB）で提供された場合には、ビオチンのレベルの上昇を作製しました。 ストレプトアビジンとビオチンの結合相互作用は、自然界に見られる最も強い非共有結合の一つです。このように、ビオチン - ストレプトアビジン相互作用は、両方のよく特徴付けられ、非常にバイオテクノロジーに採用します。 図11は、この原稿の中で、我々は、官能表面と細胞産生ビオチンを感知し、検出するために、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用を利用する2つの戦略を提示します。我々「間接的」と「直接」の制御方式として、これらの対照的な面を参照してください。間接的な制御方式では、セル生産ビオチンコンジュゲートとの結合部位をストレプトアビジンポリスチレン表面上に固定化されたビオチンと競合します。また、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）とコンジュゲートされています。 HRPは3、3 &#39;、5、5&#39;-テトラメチルベンジジン（TMB）は、450nmで（OD 450）での分光吸光度（ すなわち 、光学密度）を定量することによってモニターすることができる光信号12を生成するように修正します。このように、間接的な制御方式は、研究者がOD 450信号のattentuationを監視することにより、細胞産生ビオチンを測定することができます。 直接制御方式は、材料表面に直接ストレプトアビジンを固定化し、結合部位をストレプトアビジンのために競争するために、セル生産ビオチンおよびビオチン化HRPを可能にすることにより、ストレプトアビジン - ビオチンイベントを利用します。ここでも、細胞産生ビオチンの相対レベルは、OD 450の信号を測定することによって監視されています。 まとめると、遺伝子操作された細胞と官能基化表面は、私たちが生きている細胞内でネットワークを誘導することによって、プログラム可能な表面の特性を制御することができます。言い換えれば、私たちは一緒に、これらのシステムを連携することにより操作材料界面の生物の適応性と信頼性と仕様を活用するシステムを作成しました。

<table><tbody><tr><td>LB Broth, Miller&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-795-027</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9744500</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26481</td><td></td></tr><tr><td>M9, Minimimal Salts, 5x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td></td></tr><tr><td>Casamino Acids&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1424-100</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate, Anhydrous</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride, Dihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose (D-Glucose), Anhydrous</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>NEB Turbo Cell Line</td><td>New England Biolabs</td><td>C2984l</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotide Primers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>25N synthesis, DSL purification</td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Reaction Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B9027S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Solution Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioexpress</td><td>E-3120-125</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromide, 1%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1302-10</td><td></td></tr><tr><td>Gel Extraction Kits</td><td>Epoch Biolabs</td><td>2260250</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch Plasmid DNA Miniprep Kit</td><td>Epoch Biolabs</td><td>2160250</td><td></td></tr><tr><td>AatII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0117S</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Cutsmart Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>ColiRolle Glass Plating Beads&amp;nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>7101-3</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Desthiobiotin (DTB)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16129</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidyl Trans-4-(maleimidylmethyl) Cyclohexane-1-Carboxylate (SMCC)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S1534</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) Propionate (SPDP)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S1531</td><td></td></tr><tr><td>NHS-LC-LC-biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21343</td><td></td></tr><tr><td>Horseradish Peroxidase (HRP)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31490</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399500</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin (SA)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21145</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetaacetic acid (EDTA)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164-500</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-4</td><td></td></tr><tr><td>3, 3&#039;, 5, 5&#039;-tetramethylbenzidine (TMB)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC229280050</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 500 Centrifugal Concentrators&amp;nbsp;</td><td>Viva Products</td><td>VS0192</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate, Anhydrous</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>96-Well Polystyrene Plates</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>266120</td><td></td></tr></tbody></table>

using synthetic biology to engineer living cells that interface with programmable materials

私たちは、操作された細胞は、官能面の材料特性を制御することを可能にする非生物的・生物インタフェースを開発しました。 大腸菌細胞の合成的に操作された株と官能物質界面このシステムは、二つのモジュールを作成することによって行われます。この論文の中で、私たちの詳細遺伝的分子クローニング戦略を用いて、 大腸菌株内で選択行動を操作するためのプロトコル。化学誘導物質にさらされたときに一度開発し、この株はビオチンのレベルの上昇を生成します。セル合成ビオチンに応答することができ、それぞれが2つの異なる官能化表面を作成するために加え、我々詳細プロトコル。まとめると、我々が操作された細胞は、非生物の基板上に材料組成およびアセンブリを制御することを可能にリンクされ、非生物的・生物システムを作成するための方法論を提示します。

代表的な結果を伴う5図に示されています。読者が視覚的に合成操作されたE. coli株を作成するための重要なステップに従うことができるように、まず、我々はグラフィカルにクローニングプロセス（ 図1）を提示します。細胞集団動態を特徴付けるために、我々は、集団の600ナノメートル（OD 600）での光学密度を測定することによって生成された成長曲線（ 図2）を提供します 。そして、私たちは私たちは、光学的にIPTGで誘導時に細胞によって産生されることになるのbioBの相対量を測定することを可能にする、bioBのためのプロキシ（ 図3）としてmCherryをを使用することにより、調節遺伝子ネットワークが検証される方法を示しています。次に、我々は間接制御とダイレクト制御官能基化表面のための応答データを提示します。これらのデータプロット（ 図4）は、遊離の測定された溶液を使用して開発しました。官能化された表面の応答プロファイルを特徴付けるためのビオチン。最後に、操作された細胞は、それによって官能化面を修正する、ビオチン（ 図5）を生成するように誘導される方法を示す特性データを提示します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55300/55300fig1.jpg" /> 図1：誘導性の設計と構築、操作された細胞。 （A）プライマーは、ビオチン合成経路において重要な酵素をコードする大腸菌ゲノムからのbioB遺伝子を単離するために設計しました。 （B）P L、のtetO-1 -lacI及びP TRC-2配列は、対応するプライマーを用いて遺伝子トグルスイッチを含むプラスミドから単離することができます。 （C）抽出のbioB遺伝子トグルスイッチからの2つのフラグメントを、次いで、遺伝子回路を作成するために使用することができます。その後、indはできIPTGを添加DTBはbioBのための基質として追加されたときのbioB、それによってビオチン合成の発現をUCE。 （D）組み立てられたプラスミドを、K-12 MG1655 大腸菌に形質転換しました。これは、DTBを基質としたときに操作された細胞株によってのbioB、それによりビオチン合成の発現を誘導するIPTGの存在に起因します。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55300/55300fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55300/55300fig2.jpg" /> 図2：操作細胞の成長曲線。工学的、誘導性MG1655野生型細胞を成長させ、最少培地（ すなわち 、ビオチンを含まないM9培地）、ならびに最小培地DTBを補った（200 ngの/ mL）および/またはIPTG（0.5 mM）の中でモニターしました。プロットは、すべての5マイル測定OD 600読み取りを示し、<html> 24時間のn。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55300/55300fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55300/55300fig3.jpg" /> 図3：エンジニア遺伝子ネットワークをテストします。蛍光タンパク質mCherryをの代わりに使用しました bioBの遺伝子操作された細胞は、IPTGで誘導したときに我々は、光学的に誘導プロファイルを測定することができるように。私たちは、IPTG（ブルーダイヤモンド）で誘導していない細胞でIPTG（赤い菱形）で誘導された細胞を対比します。これらの結果は、誘導性遺伝子ネットワークの有効性を実証します。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55300/55300fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> /55300/55300fig4.jpg &quot;/&gt; 図4：官能素材インタフェースの検証。ビオチンの様々な濃度に私達の官能化された表面を曝露することによって、我々は、OD 450の吸光度を測定することにより、光学応答を測定することができます。これらの結果は、対応の光強度にビオチンの濃度を結ぶ、私たちは、較正曲線を作成することを可能にします。ここでは、間接的な（左）と、直接（右）表面機能化方式の両方の光信号曲線対ビオチンを提示します。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55300/55300fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/55300/55300fig5.jpg" /> 図5：操作された細胞は、素材インタフェースを制御します。プロトコルセクション5または6を利用することによって、我々は、誘導され、操作されたCの製品を使用することができ化学的に機能面を修正するells。私たちは、OD 450を測定することにより、光学的にこれらの応答を監視することができます。また、図4に開発された検量線を用いて、我々は濃度内ビオチンに対する応答の光強度をリンクすることができます。ここでは、野生型細胞（白）、pKE1-のlacI-bioBのプラスミド（オレンジ色）を含む非誘導細胞、およびpKE1-のlacI-のbioBを含む誘導された細胞のための当社の間接的な制御方式官能面で測定された別のビオチン濃度を、提示しますプラスミド（灰色）。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55300/55300fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 化学物質 </td><td> 最終濃度 </td><td> 量 </td></tr><tr><td> 5倍M9塩</td><td> 1倍</td><td> 20 mLの</td></tr><tr><td> 1 MのMgSO 4 </td><td> 2 mMの</td><td> 200μL </td></tr><tr><td> 1 MのCaCl 2 </td><td> 0.1 mMの</td><td> 10μL </td></tr><tr><td> 20％グルコース</td><td> 0.40パーセント</td><td> 2 mLの</td></tr><tr><td> 2％ビオチンフリーカザミノ酸</td><td> 0.02％ </td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td> DI水</td><td> N / A </td><td> 76.8 mLの</td></tr></tbody></table> 表1：M9メディアのレシピ。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 名 </td><td colspan="2"> プライマー配列 </td><td> 使用法 </td></tr><tr><td> 1-F </td><td colspan="2"> CCGCCGGAATTCTCCCTATCAGTGATAGAGATT </td><td> lacIリカセット抽出</td></tr><tr><td> 1-R </td><td colspan="2"> C言語CGACGTCTCACTGCCCGCTTTCCAGTC </td><td> lacIリカセット抽出</td></tr><tr><td> nBioB1-F </td><td colspan="2"> CCCAAGCTTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCAT </td><td> P TRC-2抽出</td></tr><tr><td> nBioB1-R </td><td colspan="2"> GGGGGGTTCTTTTAATAAAGGTACCGTGTGAAATTGTT </td><td> P TRC-2抽出</td></tr><tr><td> nBioB2-F1 </td><td colspan="2"> ACCCCCCTAAGGAGGTCATCATGGCTCACCGCCCACG </td><td> bioBの抽出 </td></tr><tr><td> nBioB2-R </td><td colspan="2"> TCCCCGCGGTCATAATGCTGCCGCGTTGTAATATTC </td><td> bioBの抽出 </td></tr><tr><td> nBioB2-F2 </td><td colspan="2"> ACGGTACCTTTATTAAAAGAACCCCCCTAAGGAGGTCATC </td><td>合成RBSの追加</td></tr></tbody></table> 表2：プライマーのリスト。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td&gt; ステップ1 </td><td> ステップ2 </td><td> ステップ3 </td><td> ステップ4 </td><td> ステップ5 </td><td> ステップ6 </td><td> ステップ7 </td><td> ステップ8 </td><td> ステップ9 </td></tr><tr><td> 98°C </td><td> 98°C </td><td> 70°C </td><td> 72°C </td><td> 98°C </td><td> 60°C </td><td> 72°C </td><td> 72°C </td><td> 4°C </td></tr><tr><td> 0時30分</td><td> 0時10分</td><td> 0時30分</td><td> 01：00 /キロバイト</td><td> 0時10分</td><td> 0時30分</td><td> 01：00 /キロバイト</td><td> 2：00 </td><td> ∞ </td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="3"> 12回繰り返します</td><td colspan="3" rowspan="2"> 25回繰り返します</td><td colspan="2" rowspan="2"></td></tr><tr><td colspan="3"> -1 C /サイクル° </td></tr></tbody></table>表3：PCRプログラム。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 名 </td><td> ボリューム </td></tr><tr><td>細胞溶解物（テンプレート） </td><td> 10μL </td></tr><tr><td>プライマー（それぞれ） </td><td> 0.625μL（各） </td></tr><tr><td> 5×Q5バッファ</td><td> 5μL </td></tr><tr><td> Q5ポリメラーゼ</td><td> 0.25μL </td></tr><tr><td> dNTPミックス</td><td> 0.5μL </td></tr><tr><td> DI水</td><td> 6.75μL </td></tr></tbody></table> 表4：全細胞PCR反応（25μL）。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 名 </td><td> ボリューム </td></tr><tr><td> 10X反応緩衝液</td><td> 5μL </td></tr><tr><td>酵素1 </td><td> 1μL </td></tr><tr><td>酵素2 </td><td> 1μL </td></tr><tr><td>テンプレートDNA </td><td> 1μgの</td></tr><tr><td> DI水</td><td> 43μL - DNAの量</td></tr></tbody></table> 表5：制限酵素消化反応（50μL）。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 名 </td><td> ボリューム </td></tr><tr><td> DNA </td><td> 50μgのベクトル+ Xμgの挿入</td></tr><tr><td> 10×リガーゼバッファー</td><td> 1μL </td></tr><tr><td> T4リガーゼ</td><td> 1μL </td></tr><tr><td> DI水</td><td> 8μL - DNAの量</td></tr></tbody></table>表6：ライゲーション反応（10μL）。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 名 </td><td> 濃度 </td><td> ノート </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 100 mMの</td><td></td></tr><tr><td> Carbeniccilin </td><td> 50 mg / mlで（1000倍） </td><td></td></tr><tr><td> DTB </td><td> 50μg/ mlの</td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> 0.5 M </td><td></td></tr><tr><td> SMCC </td><td> 20 mg / mlで</td><td> 100UL DMSOに2mgの</td></tr><tr><td> SPDP </td><td> 20 mg / mlで</td><td> 100UL DMSOに2mgの</td></tr><tr><td> LC-LC-ビオチン</td><td> 20 mg / mlで</td><td> 100UL DMSOに2mgの</td></tr><tr><td> HRP </td><td> 10 mg / mlで</td><td> PBSで</td></tr><tr><td> SA（間接） </td><td> 10 mg / mlで</td><td> PBSで</td></tr><tr><td> SA（直接） </td><td> 0.17 / mlの</td><td> PBSで</td></tr><tr><td> BSA </td><td> 20 mg / mlで</td><td> PBSで</td></tr><tr><td> DTT </td><td> 100mMの</td><td> DI水の中</td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 5 mMの</td><td> 10 mLのPBSに18.6 mgの</td></tr><tr><td>カゼイン</td><td> 0.50％ </td><td> PBSで</td></tr><tr><td>トゥイーン80 </td><td> 20％ </td><td> DI水の中</td></tr><tr><td> PBS中のトゥイーン80 </td><td> 0.05％ </td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td> 50 mMの</td><td> DI水で、3 M HClを用いて5.1のpHに調整します</td></tr><tr><td> TMB </td><td> 1％ </td><td> DMSO中</td></tr><tr><td> H 2 O 2 </td><td> 3％ </td><td> DI水の中</td></tr><tr><td> H 2 SO 4 </td><td> 2 M </td><td> DI水の中</td></tr></tbody></table>表7：試薬ソリューションの一覧。

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Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

本論文では、遺伝子操作された細胞およびプログラマブル材料表面を制御し、操作するために、合成遺伝子操作大腸菌を有効に官能基化表面を開発するための一連のプロトコルを提示します。

プログラム可能な材料とのインタフェースリビング細胞を操作するために合成生物学を使用して、

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

using-synthetic-biology-to-engineer-living-cells-that-interface-with

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.8K ビュー.  Carnegie Mellon University. 本論文では、遺伝子操作された細胞およびプログラマブル材料表面を制御し、操作するために、合成遺伝子操作大腸菌を有効に官能基化表面を開発するための一連のプロトコルを提示します。 

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Bridging the Bio-Electronic Interface with Biofabrication

Advancements in lab-on-a-chip technology promise to revolutionize both research and medicine through lower costs, better sensitivity, portability, and higher throughput. The incorporation of biological components onto biological microelectromechanical systems (bioMEMS) has shown great potential for achieving these goals. Microfabricated electronic chips allow for micrometer-scale features as well as an electrical connection for sensing and actuation. Functional biological components give the system the capacity for specific detection of analytes, enzymatic functions, and whole-cell capabilities. Standard microfabrication processes and bio-analytical techniques have been successfully utilized for decades in the computer and biological industries, respectively. Their combination and interfacing in a lab-on-a-chip environment, however, brings forth new challenges. There is a call for techniques that can build an interface between the electrode and biological component that is mild and is easy to fabricate and pattern.
Biofabrication, described here, is one such approach that has shown great promise for its easy-to-assemble incorporation of biological components with versatility in the on-chip functions that are enabled. Biofabrication uses biological materials and biological mechanisms (self-assembly, enzymatic assembly) for bottom-up hierarchical assembly. While our labs have demonstrated these concepts in many formats 1,2,3, here we demonstrate the assembly process based on electrodeposition followed by multiple applications of signal-based interactions. The assembly process consists of the electrodeposition of biocompatible stimuli-responsive polymer films on electrodes and their subsequent functionalization with biological components such as DNA, enzymes, or live cells 4,5. Electrodeposition takes advantage of the pH gradient created at the surface of a biased electrode from the electrolysis of water 6,7,. Chitosan and alginate are stimuli-responsive biological polymers that can be triggered to self-assemble into hydrogel films in response to imposed electrical signals 8. The thickness of these hydrogels is determined by the extent to which the pH gradient extends from the electrode. This can be modified using varying current densities and deposition times 6,7. This protocol will describe how chitosan films are deposited and functionalized by covalently attaching biological components to the abundant primary amine groups present on the film through either enzymatic or electrochemical methods 9,10. Alginate films and their entrapment of live cells will also be addressed 11. Finally, the utility of biofabrication is demonstrated through examples of signal-based interaction, including chemical-to-electrical, cell-to-cell, and also enzyme-to-cell signal transmission. 
Both the electrodeposition and functionalization can be performed under near-physiological conditions without the need for reagents and thus spare labile biological components from harsh conditions. Additionally, both chitosan and alginate have long been used for biologically-relevant purposes 12,13. Overall, biofabrication, a rapid technique that can be simply performed on a benchtop, can be used for creating micron scale patterns of functional biological components on electrodes and can be used for a variety of lab-on-a-chip applications.

This article describes a biofabrication approach: deposition of stimuli-responsive polysaccharides in the presence of biased electrodes to create biocompatible films which can be functionalized with cells or proteins. We demonstrate a bench-top strategy for the generation of the films as well as their basic uses for creating interactive biofunctionalized surfaces for lab-on-a-chip applications.

Biofabricationとバイオエレクトロニック·インタフェースをブリッジする

Advancements in lab-on-a-chip technology promise to revolutionize both research and medicine through lower costs, better sensitivity, portability, and ...

生物工学

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the importance of 3-dimensional (3D) cellular assemblies in these fields. Artificial scaffolds have often been used to construct 3D cellular assemblies. However, the scaffolds used to construct cellular assemblies are sometimes toxic and may change the properties of the cells. Thus, it would be beneficial to establish a non-toxic method for facilitating cell-cell contact. In this paper, we introduce a novel method for constructing stable cellular assemblies by using optical tweezers with dextran. One of the advantages of this method is that it establishes stable cell-to-cell contact within a few minutes. This new method allows the construction of 3D cellular assemblies in a natural hydrophilic polymer and is expected to be useful for constructing next-generation 3D single-cell assemblies in the fields of regenerative medicine and tissue engineering.

We demonstrate a novel method for constructing a single-cell-based 3-dimensional (3D) assembly without an artificial scaffold.

人工足場なしの安定した 3 D 携帯電話アセンブリを構築する細胞を操作します。

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

生化学

Engineering Intracellular Protein Sensors in Mammalian Cells

Proteins can function as biomarkers of pathological conditions, such as neurodegenerative diseases, infections or metabolic syndromes. Engineering cells to sense and respond to these biomarkers may help the understanding of molecular mechanisms underlying pathologies, as well as to develop new cell-based therapies. While several systems that detect extracellular proteins have been developed, a modular framework that can be easily re-engineered to sense different intracellular proteins was missing.
Here, we describe a protocol to implement a modular genetic platform that senses intracellular proteins and activates a specific cellular response. The device operates on intracellular antibodies or small peptides to sense with high specificity the protein of interest, triggering the transcriptional activation of output genes, through a TEV protease (TEVp)-based actuation module. TEVp is a viral protease that selectively cleaves short cognate peptides and is widely used in biotechnology and synthetic biology for its high orthogonality to the cleavage site. Specifically, we engineered devices that recognize and respond to protein-biomarkers of viral infections and genetic diseases, including mutated huntingtin, NS3 serine-protease, Tat and Nef proteins to detect Huntington&#8217;s disease, hepatitis C virus (HCV) and human immunodeficiency virus (HIV) infections, respectively. Importantly, the system can be hand tailored for the desired input-output functional outcome, such as fluorescent readouts for biosensors, stimulation of antigen presentation for immune response, or initiation of apoptosis to eliminate unhealthy cells.

Here, we present a protocol for engineering genetically-encoded intracellular protein sensor-actuator(s). The device specifically detects target proteins through intracellular antibodies (intrabodies) and responds by switching on gene transcriptional output. A general framework is built to rapidly replace intrabodies, enabling rapid detection of any desired protein, without altering the general architecture.

Proteins can function as biomarkers of pathological conditions, such as neurodegenerative diseases, infections or metabolic syndromes. Engineering cells ...

遺伝学

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリング アセンブリを自動化

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic bioreactor system. In contrast to other approaches towards artificial cellular systems, such a setup allows for a continuous supply with gene expression reagents and simultaneous draining of waste products. This facilitates the implementation of cell-free gene expression processes over extended periods of time, which is important for the realization of dynamic gene regulatory feedback systems. Here we provide a detailed protocol for the fabrication of genetic biochips using a simple-to-use lithographic technique based on DNA strand displacement reactions, which exclusively uses commercially available components. We also provide a protocol on the integration of compartmentalized genes with a polydimethylsiloxane (PDMS)-based microfluidic system. Furthermore, we show that the system is compatible with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, which can be used for the direct observation of molecular interactions between DNA and molecules contained in the expression mix.

We describe a simple lithographic procedure for the immobilization of gene-length DNA molecules on a surface, which can be used to perform cell-free gene expression experiments on biochips.

多段鎖変位リソグラフィーを用いた遺伝子の機能的な面を固定化

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

長期無細胞遺伝子発現の伝導のための多層マイクロ流体プラットフォーム

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

細胞を含まない細菌抽出物、リポソーム、エマルジョン移動を用いた合成細胞の調製

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

DNAを用いた細胞のシンプル、手頃な価格、モジュール式パターニング

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...

Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems

Characterizing and cataloging genetic parts are critical to the design of useful genetic circuits. Having well-characterized parts allows for the fine-tuning of genetic circuits, such that their function results in predictable outcomes. With the growth of synthetic biology as a field, there has been an explosion of genetic circuits that have been implemented in microbes to execute functions pertaining to sensing, metabolic alteration, and cellular computing. Here, we show a rapid and cost-effective method for characterizing genetic parts. Our method utilizes cell-free lysate, prepared in-house as a medium to evaluate parts via the expression of a reporter protein. Template DNA is prepared by PCR amplification using inexpensive primers to add variant parts to the reporter gene, and the template is added to the reaction as linear DNA without cloning. Parts that can be added in this way include promoters, operators, ribosome binding sites, insulators, and terminators. This approach, combined with the incorporation of an acoustic liquid handler and 384-well plates, allows the user to carry out high-throughput evaluations of genetic parts in a single day. By comparison, cell-based screening approaches require time-consuming cloning and have longer testing times due to overnight culture and culture density normalization steps. Further, working in cell-free lysate allows the user to exact tighter control over the expression conditions through the addition of exogenous components and DNA at precise concentrations. Results obtained from cell-free screening can be used directly in applications of cell-free systems or, in some cases, as a way to predict function in whole cells.

Well-characterized genetic parts are necessary for the design of novel genetic circuits. Here we describe a cost-effective, high-throughput method for rapidly characterizing genetic parts. Our method reduces cost and time by combining cell-free lysates, linear DNA to avoid cloning, and acoustic liquid handling to increase throughput and reduce reaction volumes.

無細胞システムによる遺伝子部分の迅速な特性評価

Characterizing and cataloging genetic parts are critical to the design of useful genetic circuits. Having well-characterized parts allows for the ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

実装するためのプロトコル<em&gt;エシェリヒア·コリ</em合成生物学のための&gt;に基づくTX-TLの無細胞発現系

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

プログラム可能な材料とのインタフェースリビング細胞を操作するために合成生物学を使用して、

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Biofabricationとバイオエレクトロニック·インタフェースをブリッジする

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Engineering Intracellular Protein Sensors in Mammalian Cells

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリングアセンブリを自動化

多段鎖変位リソグラフィーを用いた遺伝子の機能的な面を固定化

長期無細胞遺伝子発現の伝導のための多層マイクロ流体プラットフォーム

細胞を含まない細菌抽出物、リポソーム、エマルジョン移動を用いた合成細胞の調製

DNAを用いた細胞のシンプル、手頃な価格、モジュール式パターニング

無細胞システムによる遺伝子部分の迅速な特性評価

実装するためのプロトコル

プログラム可能な材料とのインタフェースリビング細胞を操作するために合成生物学を使用して、

要約

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Biofabricationとバイオエレクトロニック·インタフェースをブリッジする

人工足場なしの安定した 3 D 携帯電話アセンブリを構築する細胞を操作します。

Engineering Intracellular Protein Sensors in Mammalian Cells

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリング アセンブリを自動化

多段鎖変位リソグラフィーを用いた遺伝子の機能的な面を固定化

長期無細胞遺伝子発現の伝導のための多層マイクロ流体プラットフォーム

細胞を含まない細菌抽出物、リポソーム、エマルジョン移動を用いた合成細胞の調製

DNAを用いた細胞のシンプル、手頃な価格、モジュール式パターニング

無細胞システムによる遺伝子部分の迅速な特性評価

実装するためのプロトコル

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリングアセンブリを自動化