DNAバイオチップは、BASFグループが開発した自己再合成生物学の魅力的な研究プラットフォームであり、長期間にわたってインビトロ遺伝子回路の動作を可能にします。このプロトコルを使用して、この技術をより幅広い研究者が利用できるようにしたいと考えています。我々の方法は、ベフォアリソグラフィーと呼び、DNA鎖変位反応に基づくDNAの固定化のための戦略を表している。
この技術の強みは、そのマルチステップのリソグラフィ機能、そのシンプルな再現性、およびすべてのコンポーネントの商業的な可用性にあります。他のバイオチップソリューションと同様に、ベフォアは異なる技術と組み合わせることができます。例えば、機能性遺伝子ブラシは、タンパク質発現のためにマイクロコンパートメント内に組み立てることができる。
まず、5つの部分の水と30%のアンモニア溶液の一部をガラスビーカーに混合してRCA混合物を調製します。かき混ぜながらホットプレートで70°Cに加熱します。摂氏70度に達したら、1部30%過酸化水素を加えます。
その後、直径100ミリのシリコンウエハを溶液中に入れ、そこから有機材料や粒子を除去する。30分後、基板を取り出し、洗浄ボトルの水で十分に洗い流し、窒素銃で乾燥させます。直ちに基板のPEGylationを進める。
これを達成するために、まず乾燥トルエン中のビオチン-PEG-シランを1ミリリットル当たり5ミリグラムに希釈し、溶液を十分に混合するまでボルテックスする。ガラスペトリ皿に置かれた基板を使用すると、溶液を基板上にゆっくりとピペットし、表面全体を覆いますが、溶液が端を流れないようにしてください。表面が覆われたら、ペトリ皿を閉じてから、カバーを追加します。
30分後、カバーを取り外し、約40ミリリットルのイソプロピルアルコールをペトリ皿に加えます。その後、基板を取り出し、イソプロピルアルコールで再び十分に洗いすり、窒素銃で乾燥させます。乾燥したら、必要になるまで基板を暗闇の中に保管してください。
ガラスカッターまたはメスを使用して1センチメートルで1センチメートルを形成することにより、基板を準備します。次に、基板の端に向かって中心から短いスクラッチを作って簡単なアライメントマークを追加します。窒素銃を使用してチップから小さな粒子を吹き飛ばします。
次に、2成分シリコーン接着剤の2つの液滴を混ぜ、チップの表面に接着剤を塗布し、スクラッチの先端の周りの領域を空白のままにします。そこに接着剤は、チップ上の水溶液を維持し、疎水性バリアを提供します。これにより、後続の洗浄工程が容易になり、インキュベーションに必要なDNAの量が減少します。
後のステップでは、接着剤を簡単に剥がすことができます。以下の手順では、フォトクレアブルDNAは黄色の光環境でのみ処理されます。チップを室温で約10マイクロリットルのベフォア混合物で覆い、蒸発を減らすために部分的に水で満たされた箱にチップを入れます。
1時間後、PBSでチップを数回洗い、バインドされていないベフォアミックスを取り除きます。次に、パッシベーションミックスの10マイクロリットルをチップに加えます。2時間後、PBSでチップを数回洗浄し、非結合のパッシベーション剤を除去します。
適当なマスクホルダーに合わせて、印刷したフォトマスクを適切なサイズに切ります。フィールドストップの位置に挿入し、位置合わせマークを使用して、マスクをホルダーに配置します。顕微鏡の段階に置かれた基板を用いて、照明経路に赤いフィルターを挿入し、基板表面に焦点を合わせます。
次に、露出する基板の領域にナビゲートする。次に、マスクホルダを挿入し、照明をブロックし、UVフィルタに変更します。光強度が低い場合は、シャッターを開き、カメラを使用してマスクを素早く基板にピントを合わせます。
基板を揃え、マスクを焦点にして、カメラへの光路をブロックし、所望の露光時間のために高光強度で基板を照らします。露光後、顕微鏡からサンプルを取り出し、乾燥せずにできるだけ多くの緩衝液を基板から取り出します。次に、表面に付着するための配列を持つDNAを10〜20マイクロリットル加えます。
乾燥しないように、湿った箱に基板を入れ、室温で2時間、基板上のDNAをインキュベートします。逆顕微鏡上で区画化された遺伝子発現を観察するために、まずサンプルホルダの2つの部分を別々に準備する。まず、両面粘着テープを使用して、固定化された遺伝子ブラシでベフォアチップをチップホルダーに接着します。
次に、ホルダーの底部の中央の穴の周りにいくつかの真空グリースを追加し、チップホルダーを挿入します。ホルダーの上部を組み立てます。コンパートメントを持つ薄いPDMSチップを可能な限り小さく切り、チャネルを片側に開いたままにして、後で拡散による廃棄物と前駆体分子の交換を可能にし、酸素プラズマでPDMSチップの裏側にあるガラスカバースリップをプラズマ処理します。
処理の直後に、PDMSチップをガラススライドの中央に置き、コンパートメントを上向きにします。その後、PDMSでガラスを摂氏70度で1時間焼きます。サンプルホルダ全体を組み立てる直前に、ガラススライドをPDMSチップでプラズマ処理します。
次に、上部ホルダーの大きな穴の周りにいくつかの真空グリースを追加し、その上にPDMSとガラススライドを置きます。グラスをグリースにそっと押し付ける。慎重にチップからバッファーを取り出し、自己再発現システムの10マイクロリットルでそれを洗浄します。
次に、60マイクロリットルの自己再発現システムをチップに加え、2成分のシリコーン接着剤を端から取り除きます。次に、20マイクロリットルの発現システムをPDMSに追加します。PDMSに液滴を置いた後、素早くコンパートメントがよく濡れていて、気泡が無い立体顕微鏡を確認してください。
気泡がある場合は、それらを洗い流してみてください。ホルダーの2つの部分を組み立てると、チャンバーとDNAブラシを整列させるために、立体顕微鏡の下で動作します。2本のネジとウイングナットが両手で簡単にアクセスできるように、ボトムホルダーをグリッパーアームで固定します。
トップホルダーをボトムホルダーに挿入し、無細胞発現システムの液滴が融合するまで下げます。次に、区画と位置合わせマークが XY 平面の類似領域に含まれているかどうかを確認します。下から、ホルダーの下側に触れるまでウィングナットをねじ込みます。
XY平面のコンパートメントとチップを揃えながら、ウィングナットを軽く締めます。このステップは、いくつかの経験を必要とし、サンプルホルダーの構築に依存します。PDMSは、穏やかな力だけでチップに押し付ける必要があります。
次に、スポンジを蒸発防止エンクロージャーに水でスプレーし、ホルダーを箱に入れます。その後、5ミリリットルのシリンジに2成分シリコーン接着剤を充填し、それを使用して箱を密封します。最後に、温度制御顕微鏡に箱を移し、蛍光顕微鏡を用いてDNAブラシと反応を画像化する。
ここでは、ベフォアガラススライド上で行われる2段階のリソグラフィプロセスにより、蛍光標識されたDNA鎖の重なり合うパターンが得られます。このオンチップ遺伝子発現の実証では、DNAは左側のチャンバーに固定化されています。発現ミックスに曝露すると、黄色蛍光タンパク質YPetが固定化されたDNAから合成される。
遺伝子発現系の活性を評価するために、漂白工程後に蛍光の回収が観察される。2時間で、蛍光強度は急速に回復した。しかし、4時間及び6時間後には、回復しなかったが、発現ミックスの新たな供給がなければ、反応は4時間前後で終了したことを示す。
遺伝子発現は閉系では限定されるが、マイクロ流体を介して追加の前駆体分子を発現区画に供給することによって、より長い期間にわたって持続することができる。ベフォア法は、オリゴヌクレオチドまたは遺伝子長DNAを固定化するために使用され、自己再遺伝子発現のための相互作用DNAブラシのシステムを構築するために適用することができる。この技術は、単一分子蛍光研究などの生物物理学における他の用途にも使用され得る。
このビデオを見た後、ウエハースやガラススライドからベフォアバイオチップを製造し、研究プロジェクトに統合できるはずです。
