非限定圧縮試験のためのカスタム3Dプリント金型を使用した Sporosarcina pasteurii バイオセメントレンガの製造と分析

Sporosarcina pasteurii は、尿素を炭酸塩とアンモニウムに分解する尿素溶解性細菌です。炭酸塩はカルシウムと結合して炭酸カルシウムを形成し、周囲の粒子を固定してバイオセメントを生成する結晶格子を作成します。これは、3Dプリントされた金型を使用して、圧縮試験に適したバイオセメントレンガを作成するための便利なプロトコルです。

セメントは、住宅の基礎から歴史的建造物や道路まで、世界中の多くの構造物で使用されている主要な建築材料です。それは世界中で重要で豊富な材料です。しかし、従来のセメント生産は、人為的な大気中の_CO2の主な原因であり、温室効果ガスの排出と気候変動につながります。微生物誘発方解石沈殿(MICP)は、 Sporosarcina pasteurii または他の細菌が従来のセメントと同等の強度を持つセメント材料を生成する生物学的プロセスですが、バイオセメントはカーボンニュートラルです。このMICP法によるバイオセメントの製造は有望な技術であり、現在、多くの企業、国、研究グループで積極的に研究が進められています。ここで紹介するプロトコルは、土壌や砂のフロースルーMICP処理にカスタム設計され、再利用可能な3Dプリント金型を採用し、非拘束圧縮試験の標準仕様を満たす円筒形レンガを製造しています。リザーバートップ付きの独立した独立した金型により、複数の変数と反復の便利な並列試験が可能になります。このプロトコルでは、 S. pasteurii MICP 反応と、バイオセメント円筒形レンガを生成するための 3D プリント金型の作成、組み立て、および使用について概説しています。

コンクリート^{は、世界中の}建設プロジェクトの主要な建築材料です^1,2。ある研究によると、セメントは水³に次いで世界で2番目に消費される材料です。毎年約41億トンのセメントが生産されています^4,5。セメントの従来の生産、加工、および適用は、世界の年間_CO2排出量の約8%を占めています⁶。従来のセメント生産には高い需要がありながらも有害な影響があるため、カーボンニュートラルな新しいセメンテーション法は、世界的な持続可能性目標7,8,9,10の最優先事項です。

バイオセメンテーションは、微生物を使用してセメント、接着剤、または固体表面^{または構造1,11}を作成するために使用できる物質を生成するプロセスです。最も明確に定義されたバイオセメンテーションプロセスは、尿素溶解細菌を使用して炭酸カルシウムを沈殿させ、粒子を硬化セメント材料^12,13に結合させることを含む。

従来のセメントに代わる環境に優しい代替品を検討する場合、その代替品はセメントの強度期待も満たす必要があります。非限定圧縮試験は、岩石、建築材料、または土壌サンプル¹⁴のせん断強度を決定するために使用される分析的測定値である。効果的なせん断試験のためには、サンプルは、直径と高さの比率が1:2で、円筒形¹⁵を含む業界標準に従って調製する必要があります。カスタム設計の3Dプリントされた金型は、これらの基準を満たし、MICPプロトコルの実行効率を高めるために作成されました。これらのカスタム設計の金型は、シーケンシャルMICP処理のフロースルー塗布と排水を可能にします。細菌培養液とセメンテーション溶液は、上部リザーバーに容易に塗布でき、リザーバーは金型を通り抜け、金型の基部にあるメッシュで裏打ちされた開口部を通過します。型は、ビーカーやその他の廃棄物収集容器の上に置くように設計されています。金型は垂直に半分に分割されており、セメントレンガの成形を簡単に解除できます。これは、金型のフレームに取り付けられた8つの磁石によって一緒に保持され、エポキシで密封されているため、MICP溶液にさらされることによる磁石の損傷を防ぎます。2つの半分には、ゴム製のガスケットを配置するためのはめ込み溝も含まれており、金型を密閉して漏れを防ぐのに役立ちます。円筒形の型の内側には、高さ3インチのレンガを生成するための砂/土壌の充填レベルを示す溝があります。その溝の上のスペースは、治療液を適用するためのリザーバーとして使用することを目的としています。金型の内側の底部開口部に配置された金網は、構築時に、砂や土が金型の底から落ちるのを防ぎます。さらに、砂または土の上に金網が配置され、塗布された溶液を均等に分配し、形成されたレンガの上部が鋭い隆起のない均一な上部を持つようにします。これは、制限されていない圧縮試験結果に影響を与える可能性があります。

金型はCAD(Computer Aided Design)ソフトウェアを用いて設計し、CADファイル(Supplementary File 3、Supplementary File 4)からSTLファイル(Supplementary File 1、Supplementary File 2)を生成しました。このSTLファイルは3Dプリンタープログラムにアップロードされ、その後印刷されました。金型をプリントした後、ウォータージェットシステムを使用して3Dプリンターから生成された支持材料を取り出し、最終的な3Dプリント構造を残しました。金型内の砂/土を圧縮し、平らな上面を作成するのに役立つタンピングデバイスを印刷するためのファイルも含まれています。

使用した試薬、装置、ソフトウェアの詳細は、 資料表に記載されています。

1. 溶液と培地の調製

1. Brain-Heart Infusion(BHI)-尿素媒体(1 L)
   1. 天びんを使用して37 gのBHI粉末を秤量し、1 Lのフラスコまたはビーカーに加えます。
   2. 天びんを使用して尿素20 gを計量し、BHI粉末を含む同じ1 Lフラスコまたはビーカーに加えます。
      注意: 尿素を含む材料にオートクレーブ処理をしたり、漂白剤を追加したりしないでください。尿素はアンモニアに分解され、揮発ガスとして有害であり、漂白剤と反応して有毒なマスタードガスを形成する可能性があります。すべての廃棄物は、機関の安全プロトコルに従って有害廃棄物として処分してください。
   3. BHI粉末と尿素を含む1Lのフラスコまたはビーカーに1Lの_H2Oを満たします。
   4. 培地を0.45 μMフィルターで混合し、ろ過してオートクレーブ滅菌したフラスコまたはビーカーに入れます。
2. セメンテーション溶液(1L)
   1. 天びんを使用して尿素20 gを計量し、1 Lのフラスコまたはビーカーに加えます。
   2. 天びんを使用して10 gのNH₄Cl(塩化アンモニウム)を秤量し、尿素を含む同じ1 Lフラスコまたはビーカーに加えます。
      注意: 塩化アンモニウムを含む材料にオートクレーブをかけたり、漂白剤を追加したりしないでください。塩化アンモニウムはアンモニアガスと平衡状態を形成しますが、アンモニアガスは揮発ガスとして有害であり、漂白剤と反応して有毒なマスタードガスを形成する可能性があります。すべての廃棄物は、機関の安全プロトコルに従って有害廃棄物として処分してください。
   3. 天びんを使用して49gのCaCl_{4.2H 2}O(塩化カルシウム)を秤量し、尿素と塩化アンモニウムを含む同じ1Lフラスコまたはビーカーに加えます。
   4. 尿素、塩化アンモニウム、塩化カルシウムを含む1Lのフラスコまたはビーカーに1Lの_H2Oを入れます。
      注:この溶液は滅菌されていません。新鮮なものを準備し、48時間以内に使用してください。
3. レンガの印刷と準備(MICP処理の数日前に実施)
   1. レンガ型枠のSTLファイル(補足ファイル1)とタンピング装置(補足ファイル2)を3Dプリンターの適切なプログラムにロードします。
      注意: 使用される特定のプログラムは、異なる3Dプリンターを使用すると異なる場合があります。使用しているプリンターに適したプログラムを使用してください。
   2. 金型とタンピング装置を印刷します(図1)。
   3. プリンターの要件に従って金型を処理します。
   4. 金型内の適切な磁石スロットのそれぞれに1つの磁石を配置し、金型の2つの半分が互いに引き合い、反発しないように電荷が配置されていることを確認します
   5. 磁石が適切に配置されたら、各磁石をエポキシで密封します。
   6. 直径1.5インチの金網の円を2つ選択し、脇に置きます。

2. レンガの準備(0日目)

注:1つのレンガの準備の詳細については、こちらをご覧ください。

1. 150mLのBHI-尿素培地をフィルター滅菌します。250mLフラスコをオートクレーブします。
2. 250mLのセメンテーション溶液を調製します。オートクレーブ処理した250 mLフラスコに入れないでください。
3. S. pasteurii単離ストリーク培養物をBHI尿素寒天を用いたシャーレ上で調製し、30°Cで24〜48時間インキュベートします(凍結グリセロールストックからのS. pasteurii)。
4. S. pasteuriiのスターター培養(1日目)
   1. 1.6 mLのBHI-Urea培地を培養チューブに加えて、1.6 mLのスターター培養を行います。
   2. Day 0ストリークプレートから1コロニーを培養物に接種します。
   3. スターター培養物をシェーカー(150rpm)で30°Cで一晩増殖させます。
5. 文化の成長(2日目)
   1. スターター培養物を検査して、成長を確認します(濁度の増加として明らかです)。
   2. 40 mLのBHI-尿素培地を250 mLのオートクレーブフラスコに加えます。1.6mLのスターター培養物をフラスコに注ぎます。インキュベートし、30°Cで7時間振とうします。
   3. フラスコにさらに40mLのBHI-尿素培地を加えます。フラスコをシェーカーに20°Cで一晩(~16時間)置きます。
6. S. pasteuriiによるレンガ処理(3日目)
   1. さらに40mLのBHI−尿素培地を一晩培養フラスコに加え、 S. pasteurii を20°Cでインキュベートし続ける。
7. レンガ型を準備します(3日目)( 図2を参照)。
   1. ゴム製ガスケットを金型の適切なスペースに配置します。金型の2つの半分を接続し、ガスケットが密閉され、すべての磁石が接続されていることを確認します。
   2. 円筒形のレンガ型の底に細かい金網の円を追加して、型の穴から砂が落ちるのを防ぎます。
   3. 型の内側の線まで型に砂またはその他の材料を入れ、tでしっかりとtます。
   4. 砂の上に金網の別の円を置き、上面全体を覆い、再度タンピングします。
   5. 型を廃棄物容器の上に置いて、流れをキャッチします。
8. 治療手順(3日目)
   1. 砂の上に 40mLのS.pasteurii 培養物を注ぎ、それを浸します。45分待ちます。
   2. 砂の上に80mLのセメンテーション溶液を注ぎます。30分待ちます。
   3. 砂の上に 40mLのS.pasteurii 培養物を注ぎます。30分待ちます。
   4. 砂の上に80mLのセメンテーション溶液を注ぎます。30分待ちます。
   5. 砂の上に 40mLのS.pasteurii 培養物を注ぎます。30分待ちます。
   6. 砂の上に80mLのセメンテーション溶液を注ぎます。レンガを少なくとも48時間、または砂が乾くまで放置します。
9. 最終製品を確認します(5日目)。
   1. 型を半分に分割し、磁石からの圧力を解放して、型を慎重に開きます。レンガを型からそっと取り出します。
      注:砂が濡れているように見える場合は、レンガを型から取り外す前に、型をもう1〜2日乾かす必要があります(レンガが乾燥しているほど、取り外しが簡単になります)。
   2. レンガをペーパータオルの上に置き、圧縮テストを実行する前に3週間乾燥させます。
10. 金型洗浄(5日目)
    1. レンガを型から取り出したら、ガスケットと金網を金型の各半分から分離します。
    2. 水ですすぐ前に、金網を70%エタノールの溶液に24時間浸します。メッシュをクリーニングするには、わずかなスクラブが必要になる場合があります。
    3. 型を70%エタノールですすぎ、柔らかい毛のブラシ、スポンジ、またはその他の洗浄装置で少なくとも3回こすります。その後、石鹸と水で洗浄し、その後風乾します
    4. ガスケットを70%エタノールですすぎ、石鹸と水で洗浄した後、風乾します。

3. 圧縮試験(25日目)

1. 非限定圧縮試験¹⁶を使用して、すべてのレンガの強度を分析します。
   1. レンガの円形の端が平らで均一であることを確認してください。端が均一でない場合は、ファイルまたはその他のデバイスを使用して表面を均一にします。
      注:金網が正しく適用されている場合、レンガの端はほぼ平らである必要があります。強度を正確に測定するためには、レンガの端ができるだけ均一であることが重要です。
2. レンガをジッパー付きまたは密封されたビニール袋に入れ、レンガの平らな面が継ぎ目で覆われないようにレンガをビニール袋に配置して、滑らかで平らなカバレッジを実現します。
3. レンガを下部ローディングプレートに置きます。レンガの上に平らで均等なローディングプレートを置きます。
4. 制限されていない圧縮試験機 を介して レンガに約1ポンドの圧力を加えます。
5. デジタル読み出しを風袋引きします。
6. レンガの完全な構造的故障が達成されるまで、機械の仕様に従って増加する荷重を連続的に加えます。
7. 各レンガの最大耐荷重を記録します。必要な統計分析を実行して結果を評価します。

3Dプリントされた金型の構造は、 図1 と 図2で見ることができます。肯定的な結果は、型から取り出したときにその形状を保持し、3週間の乾燥後、接触による材料の損失を最小限に抑えて簡単に扱うことができる固体構造のように見えるレンガと見なすべきです。レンガが固くなく、触れたり動かしたりすることで崩れたり、材料が大幅に失われたりする場合は、培地または培養準備にエラーがあった可能性があります。ブリックの肯定的な結果と否定的な結果の例を 図 3 に示します。

図4に示すように、金型を使用して、粗い砂と細かい砂の2つの異なる基板を同時にテストしました。粗い砂を使用したレンガの合計4つと細かい砂を使用したレンガ4つを、ここで概説したS.pasteuriiプロトコルを使用して作成し、制限のない圧縮テストを行いました。S. pasteuriiを使用したバイオセメント土壌の非限定圧縮強度の以前に文書化された結果は、土壌または砂の種類とS. pasteurii17のウレアーゼ活性に応じて、48〜12,400 kPaの範囲を示しています。粗砂レンガの平均最大荷重は95.125 PSI(655 kPa)でしたが、細かい砂レンガは平均最大荷重49.625 PSI(321.46 kPa)に耐えました。必要に応じて任意の数の金型を簡単に3Dプリントできるため、すべての変数を同時にテストでき、潜在的なばらつきを最小限に抑えることができました。

図1:レンガの型。 この図は、3Dプリントされた金型の3Dプリントマップを示しています。金型の各半分は別々に印刷されます。金型加工後、指定された8箇所に磁石をセットし、エポキシ樹脂で密封します。金型の内面には、2つの半分が接続する2つのくぼんだ領域が含まれています。ゴム製ガスケット材料は、金型の防水シールを確保するために、これらのくぼんだ領域に一致するようにカットされています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:金型の製作、処理、離型。 この図は、金型を組み立て、レンガサンプルを作成するための段階的なプロセスの概要を示しています:ステップ1:金型は、16個の磁石のそれぞれが指定された穴に挿入され、エポキシで密封された、ファイルの仕様に従ってガスケット材料を切断することによって組み立てられます。ステップ2:ガスケットは、金型の適切なくぼみに配置されます。ステップ3:金型の2つの半分が接続されます。ステップ4:(a)円形の金網が金型の上部に挿入されて下部の穴を覆い、砂が落ちるのを防ぎます。(b)砂または土を、型の内側にマークされた充填線まで型に加えます。(c)砂または土の上に2番目の円形の金網を置きます。(d)タンピング装置を使用して、金網の最上層をしっかりと押し下げ、レンガの最上層を平らで均一にします。ステップ5:砂の入った型をビーカーまたは別の容器の上に置いて、フロースルー溶液を収集します。ステップ6:治療はプロトコルに従って適用されます。ステップ7:乾燥期間の後、型を横向きに置き、型の上半分を下半分から慎重に分離します。必要に応じて、レンガを型の下半分で乾燥させ続け、1つにまとめるのに十分なほど固くなるまで乾燥させます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:ブリックプロトコルに従った期待される結果。 (A)は、明確なエッジと堅固な円筒形構造を特徴とする、期待される肯定的な結果を示しています。(B)は、崩壊と構造安定性の欠如を特徴とする、予想される否定的な結果を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:圧縮試験。 この図は、3Dプリントされた金型を使用して同時に製造された8つのレンガの非限定圧縮試験の結果を示しています。粗い砂の平均強度は95.125 PSIで、細かい砂の平均強度は49.625 PSIでした。エラーバーは標準偏差を示します。スチューデントの t検定 は、統計分析のためのp値を計算するために実行されました。粗い基板で作られたレンガは、細かい粒子サイズの基板で作られたレンガよりも有意に強度が高かった(p値<0.005)。すべてのレンガは、同じバッチの溶液で処理され、実験の不整合を最小限に抑えるために同じ条件下で乾燥されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:金型用STLファイル。 このファイルには、金型設計の3DプリントSTLファイルが含まれています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:タンピング装置用のSTLファイル。 このファイルには、タンピングデバイスの3DプリントSTLファイルが含まれています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル3:金型CADファイル。 このファイルは、金型設計のCADファイルを提供します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル4:タンピング装置CADファイル。 このファイルには、タンピング装置設計のCADファイルが含まれています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

重要なステップ
このバイオセメンテーションプロトコルは、S. pasteurii MICPを使用して、非限定圧縮試験に適したバイオセメント円筒形レンガを製造します。非拘束圧縮試験の最も重要な要素の1つは、サンプルの形状と構造です。シリンダー製品の上部と下部が平らで、レンガの高さができるだけ3インチに近いことを確認してください。3インチの高さマークをわずかに超えることは、下に行くよりも優れています。砂/土壌の沈降により、処理が適用されると、少し高さが失われます。したがって、初期処理の前に金型をわずかに過剰に充填することをお勧めします。処理前に砂/土壌の上部に配置された金網の円は、適用された溶液を分配し、より水平な表面^{を作成するのに役立ちます16}。金型、メッシュ、ガスケットを徹底的に洗浄することは、将来のレンガの相互汚染リスクを最小限に抑えるために重要です。メッシュを清掃するか、新しいメッシュを使用することも重要です。これは、時間の経過とともに生体セメント化/目詰まりし、清掃または交換しないとフロースルー速度が低下する可能性があるためです^13,17。

変更/トラブルシューティング

金型
研究者のニーズを満たすために、他の多くの印刷装置や材料が使用される場合があります。CADファイルは、さまざまなニーズに合わせて変更し、より大きな、より小さな、または代替の金型形状を作成することもできます。さらに、任意のガスケット材料または磁石を使用することができます。CADファイルの寸法を満たしていることを確認するか、さまざまなニーズに合わせてCADファイルを変更するだけです。金網は、別のメッシュまたは場合によっては濾紙と交換することもできます。細孔が十分に小さく、微粒子が通過するのを防ぐことを確認してください。微粒子が底部の開口部から落ちる場合、これは多くの場合、金網の不適切な配置とメッシュと金型の間に隙間が存在することが原因です。メッシュの配置を確認します。金型の側面から塗布された溶液の大幅な漏れがある場合は、ガスケット材料に問題がある可能性があります。切断プロセスに問題があったか、ガスケットが誤って配置された可能性があります。配置を調整しても問題が解決しない場合は、新しいガスケットをカットする必要があります。金型に交差汚染が観察される場合は、金型、メッシュ、またはガスケットを70%エタノール溶液に浸すか、またはそれらを新しい金型、メッシュ、またはガスケット^14,15と交換する必要があるかもしれない。

MICPの
MICPの申請プロセスは、フラスコ/ビーカーなどの交換など、さまざまなニーズに合わせて変更できます。培養プロセスには、記載されているプレート方法は必要ありません。グリセロールストックからの液体培養または任意の他の培養方法が、本明細書¹²に適用され得る。処理は、自動ピペッターを使用して土壌サンプルに適用したり、メスシリンダーから注いだり、体積の制御を可能にするその他の手段で行うことができます。時々、細菌培養物が適切に成長しないことがあります。これは、インキュベーション後の濁りの欠如によって注目できます。これが発生した場合は、新しいコロニーまたはスターター培養で培養プロセスを再開します。OD600またはコロニー数を測定する定量化ステップが推奨され、各レンガ¹⁶に適用される細菌の濃度を制御し、文書化する。

制限
これは数日かかる長いプロセスであり、開始する前に準備が必要です。Day 1 プロトコルが開始されると、実験を一時停止する機会はありません。

意味
このプロトコルは、非限定の圧縮強度試験に適した円筒形バイオセメントレンガを製造する方法を概説し、地盤工学的応用^13,17のためのバイオセメンテーション技術を試験できる手段を提供する。

将来のアプリケーション
このプロトコルの重要性は、バイオセメンテーションプロトコルを最適化しながら、同時にプロセス内の複数の変数をテストする効率にあります。再利用可能な金型は、非拘束圧縮試験に使用される特定の寸法の円筒形レンガの形成を可能にし、金型の上部にあるリザーバーにより、MICP溶液が金型内の材料を通過するのを待ちながら少しずつゆっくりと溶液を塗布する代わりに、MICP溶液を大量に適用することができます。任意の数の個々の型を印刷して並行して使用できるため、セメンテーション溶液の化学組成の変化や異なる微生物の使用など、さまざまな変数を簡単に比較できます。金型は、フロースルー廃棄物を収集するための容器の上に設置するように設計されているため、フロースルーは、細菌数、pH、イオン含有量、またはその他のテスト変数について測定および評価できます。ウレアーゼ酵素を発現するように遺伝子操作された 大腸菌 のMICP能力の評価などの一部の研究では、カルシウム枯渇を測定することにより沈殿速度を測定しており、異なる細菌株または異なるプラスミドコンストラクトの直接比較に重点を置いています。このプロトコルは、このタイプの評価または最適化研究¹⁸に最適です。

著者は、利益相反を宣言しません。この原稿は一般公開が承認されました。PA番号:USAFA-DF-2024-777。本稿で表明された見解は著者のものであり、必ずしも米国政府、国防総省、または空軍省の公式な立場や政策を表すものではありません。

この資料は、米国空軍士官学校と空軍研究所が契約番号FA7000-24-2-0005(MG)で後援した研究に基づいています。米国政府は、著作権表記の有無にかかわらず、政府の目的で転載物を複製および配布する権限を与えられています。