La glomerulonefrite provoca lesioni glomerulari patologiche con una notevole morte cellulare e rilascio di DNA extracellulare. Questo protocollo consente la visualizzazione del DNA extracellulare nel sito di rilascio durante la lesione patologica. Il vantaggio di questa tecnica è che misura il DNA extracellulare dalla morte cellulare nel rene.
Al contrario del siero o dell'urina, la misurazione extracellulare del DNA è un marcatore surrogato per danni patologici. Il significato di questo metodo è che sia la colorazione extracellulare del DNA che l'analisi delle immagini sono facilmente trasferibili ad altre malattie autoimmuni come l'artrite reumatoide e il lupus. Questo metodo richiede una conoscenza di base dell'istologia renale.
Per consentire il rilevamento accurato del DNA extracellulare glomerulare, il ricercatore deve essere in grado di identificare correttamente i glomeruli. Per la colorazione extracellulare del DNA, riscaldare prima i campioni di interesse in una griglia a 60 gradi Celsius per 60 minuti prima di immergere le diapositive in due cambi di solvente di 40 minuti in una cappa aspirante. Dopo la seconda immersione, reidratare i campioni due volte in etanolo al 100% e una volta al 70% di etanolo per cinque minuti per trattamento.
Dopo l'ultimo trattamento, utilizzare le pinng per posizionare le diapositive in una soluzione di recupero dell'antigene bollente in una pentola a pressione alta per 10 minuti. Dopo aver smascherato gli epitopi dell'antigene, trasferire la pentola a pressione dal fuoco in un lavandino e eseguire immediatamente acqua fredda del rubinetto sul coperchio. Lasciare equilibrare le diapositive per 20 minuti nella soluzione di recupero dell'antigene prima di lavare i campioni due volte in PBS molare 0,01 su uno shaker orbitale per cinque minuti per lavaggio.
Dopo il secondo lavaggio, utilizzare una penna idrofobica per disegnare cerchi attorno ai campioni di tessuto renale e bloccare qualsiasi colorazione aspecifica con 60 microlitri di siero di pollo al 10% nell'albumina del siero bovino al 5% per 30 minuti a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, sostituire con cura la soluzione di blocco con 60 microlitri dell'anticorpo primario di interesse in una camera di umidità durante la notte a quattro gradi Celsius. La mattina seguente, lavare le diapositive su uno shaker orbitale in PBS per due minuti per lavaggio prima di aggiungere 60 microlitri di un anticorpo secondario coniugato al fluoroforo appropriato ad ogni diapositiva per un'incubazione di 40 minuti a temperatura ambiente.
Al termine dell'incubazione, lavare le diapositive in PBS come dimostrato, seguito da un trattamento in nero 0,3% Sudan nel 70%etanolo per spegnere qualsiasi potenziale autofluorescenza indotta da formalina. Dopo 30 minuti, lavare gli scivoli in acqua del rubinetto per rimuovere qualsiasi precipitato e immergere gli scivoli in PBS per 10 minuti per evitare ulteriori formazioni di precipitato nero del Sudan. Al termine dell'incubazione, montare i vetrini su coverlips in vetro confocale con tre gocce da 60 microliter di soluzione di montaggio integrate con DAPI e sigillare i copripacchi con smalto per unghie.
Lasciare che le diapositive si curino per 24 ore a temperatura ambiente. Conservarli a quattro gradi Celsius protetti dalla luce fino all'imaging mediante microscopia a scansione laser confocale secondo protocolli standard. Assicurarsi di sigillare i copricapo con smalto per evitare qualsiasi movimento durante l'imaging e di pulire i copricapo di etanolo per migliorare la risoluzione di imaging.
Dopo aver imaging di 20 glomeruli per diapositiva, apri il plug-in Segmentazione Weka addestrabile in ImageJ e rilascia la prima immagine sulla barra degli strumenti ImageJ. Fare clic su immagine, colore e canali divisi. Apparirà un'immagine che mostra la colorazione degli anticorpi primari.
Per creare un file unito delle singole immagini, fare clic su colora e unisci canali. Apparirà una casella popup che richiede l'assegnazione di un colore a ciascun canale. Selezionare le caselle crea composito e mantieni immagini di origine e fare clic su OK. Verrà visualizzata un'immagine composita unita.
Usando la colorazione dell'anticorpo primario come guida, disegna una regione di interesse intorno al ciuffo glomerulare. Per eseguire una sfocatura gaussiana sulla singola immagine DAPI blu, fate clic su processo, filtri e sfocatura gaussiana. Impostare la sfocatura su uno a due.
L'immagine diventerà un po 'sfocata, ma i nuclei appariranno lisci, lo sfondo sarà ammorbidito. Quindi, fai clic su plugin, segmentazione e segmentazione Weka addestrabile e usa lo strumento mano libera per tracciare i nuclei intatti. Una volta aggiunti tutti i nuclei di interesse, la casella aggiungi classe uno, usa lo strumento linea per delineare le aree di sfondo nella casella della classe due.
Fate clic su crea nuova classe (Create New Class) e utilizzate lo strumento linea per delineare il DNA extranucleare macchiato di DAPI. Fare clic su addestra classificatore e ottenere probabilità. Attivare o disattivare il mouse per ottenere un'immagine in bianco e nero di tutti i componenti con l'oggetto di selezione evidenziato in bianco.
Per duplicare l'immagine, fare clic su immagine e duplicare. Sotto l'immagine, regola e soglia. Utilizzare il pulsante del mouse per regolare la soglia fino a quando non viene osservato solo il DNA extracellulare.
Dopo la soglia, fare clic su processo, binario e rendere binario e copiare l'area di interesse glomerulare generata in precedenza. Premere CTRL E per selezionare modifica, selezioni e ripristino per ripristinare la selezione. Per misurare solo le particelle di DNA extracellulari all'interno del glomerulus, fare clic su analizza particelle e OK. Verrà generato un foglio dei risultati che mostra il numero di particelle, l'area, i pixel medi e la percentuale di glomeruli contenenti DNA extracellulare.
Per salvare il classificatore come classificatore di DNA extracellulare, fare clic su salva classificatore e salvare i dati. Per riapplicare il modello alle immagini successive, ripetere l'elaborazione iniziale dell'immagine come illustrato prima di selezionare il classificatore di carico e il file classificatore salvato. Verrà visualizzato il menu di registro che eseguirà il modello.
Una volta eseguito il modello, fare clic su carica dati e selezionare extracellularDNA.arff. Quindi fare clic su Crea risultato. Se l'immagine risultante non è riuscita a raccogliere tutti i nuclei, lo sfondo o il DNA extracellulare, fare clic su Riqualifica classificatore e aggiungere altri classificatori, se necessario.
Qui vengono mostrate immagini a canale singolo che mostrano dna rappresentativo e colorazione beta actin. La fusione delle due immagini consente di disegnare una regione di interesse attorno all'area glomerulare per la misurazione del DNA extracellulare all'interno dei glomeruli renali del topo usando la segmentazione Weka addestrabile come dimostrato. Questo modello può essere adottato per identificare il DNA extracellulare nei campioni di biopsia renale da un paziente di controllo o rispetto a quello di una biopsia renale da un paziente con vasculite associata all'ANCA mieloperossidasi.
Inoltre, questo programma può essere tradotto in altre macchie all'interno di campioni di tessuto renale, ad esempio, per macchiare per trappole extracellulari neutrofile e la deposizione di mieloperossidasi extracellulare nella vasculite associata all'ANCA. È importante sottolineare che non si osservano differenze significative quando gli stessi dati vengono analizzati da più utenti. Il passo più critico dell'analisi è fornire abbastanza esempi di background, nuclei e DNA extracellulare con glomeruli come classificatori da cui il programma di segmentazione Weka può imparare.
Questo metodo è facilmente trasferibile. Ad esempio, un'ulteriore analisi dei diversi tipi di morte cellulare può essere studiata attraverso la colorazione di anticorpi specifici contro marcatori per apoptosi o necrosi. La nostra tecnica può essere utilizzata con altri processi infiammatori come la valutazione dell'espressione della TLR nella malattia renale autoimmune o l'espressione mieloperossidasi extracellulare nelle biopsie renali umane.
