Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle malattie renali. In particolare nella comprensione del glomerulus in stati normali e mammasi. La biologia glomerulare può essere difficile da studiare a causa della varietà di tipi di cellule presenti e della loro struttura unica.
Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di fornire una fonte prontamente disponibile di glomeruli intatti utilizzando metodi e attrezzature semplici. Questa tecnica ha implicazioni per la nostra comprensione della barriera di filtrazione nel rene normale e mato. In particolare, può far luce sulla nostra comprensione della malattia renale cronica proteinurica in cui la lesione glomerulare porta alla secrezione anormalmente elevata di proteine del siero nelle urine.
Generalmente, gli individui nuovi a questa tecnica avranno difficoltà ad ottenere una resa e una purezza adeguate nel campione finale. A dimostrare la procedura sarà Brittney Rush, un tecnico del mio laboratorio. Per iniziare, usa le tosaerba per rimuovere i capelli dall'addome anteriore di un topo eutanasiato.
Utilizzare il 70% di etanolo per pulire la pelle esposta. Quindi, usando forbici chirurgiche, fai un'incisione della linea mediana nella pelle. Per esporre gli organi interni, fare un'incisione della linea mediana attraverso lo strato muscolare.
Individuare e isolare i reni e posizionare in un tubo conico in plastica steril 50 millilitro con 30 millilitri della soluzione di sale tamponato di Hank o HBSS posto sul ghiaccio. Trasferire il tubo sul ghiaccio in una cappa sterile per la coltura cellulare. Trasferire i reni in una piastra di Petri sterile contenente cinque millilitri di HBSS posti sul ghiaccio.
Utilizzare forbici e forceli affilati per rimuovere e scartare il grasso perirenale. Per rimuovere e scartare le capsule che circondano il rene, fare una piccola incisione superficiale e quindi utilizzare forcep affilate per allontanarlo delicatamente dal rene. Mettere i reni su una garza sterile in una seconda piastra di Petri con cinque millilitri di HBSS e dividere ogni rene a metà attraverso una sezione medio-sagittale.
Usa un bisturi per rimuovere e scartare il midollo che può essere identificato dal suo colore più scuro e dalla posizione centrale. Trasferire i restanti pezzi contenenti prevalentemente la corteccia renale, in una terza piastra di Petri con cinque millilitri di HBSS. Utilizzare una lama sterile per tritarli fino a quando i pezzi sono di dimensioni inferiori a un millimetro o fino a formare una pasta.
Utilizzare 1%BSA PBS per bagnare la parte superiore e inferiore di un setaccio di 180 micrometri su un bicchiere di scarto da 500 millilitri. Questo passaggio è fondamentale in quanto ricopri il setaccio con proteine e riduce l'aderenza dei glomeruli che miglioreranno quindi la resa. Posizionare la corteccia mista su un piccolo bordo del setaccio.
Utilizzare la flangia del pistone strutturato di una siringa monouso da 10 millilitri per sgranocchiare il tessuto attraverso il setaccio in una padella inferiore posta sul ghiaccio. Risciacquare periodicamente con HBSS utilizzando il meno possibile per evitare la diluizione del campione e riutilizzare la raccolta del fluido nella padella inferiore per risciacquare il setaccio. Dopo il setaccio completato, lavare con cura il fondo del setaccio con HBSS dal fondo della padella per catturare eventuali glomeruli liberamente aderenti.
Dividere tutto il fluido dalla padella inferiore in siringhe da 10 millilitri dotate di aghi calibro 20. Passare il fluido attraverso l'ago almeno tre volte nella padella inferiore. Per l'ultima raccolta, mantenere i glomeruli contenenti liquido nella siringa fino a quando non sono pronti a passarlo attraverso il setaccio di 90 micrometri.
Nel frattempo, lavare la padella inferiore lavandola con 1%BSA PBS e in un becher di scarto. Utilizzare 1%BSA PBS per bagnare la parte superiore e inferiore di un setaccio di 90 micrometri e quindi posizionarlo nella parte superiore della padella inferiore. Applicare il campione nelle siringhe su un bordo del setaccio.
Utilizzare una flangia stantuffo strutturata per sgranocchiare il tessuto attraverso il setaccio come fatto in precedenza. Utilizzare la soluzione dalla padella inferiore per lavare il tessuto e raccogliere tutto da un bordo del setaccio. Una volta completato il setaccio, lavare con cura il fondo del setaccio con tampone HBSS dal fondo della padella per catturare eventuali glomeruli che possono essere liberamente aderenti.
Raccogliere tutto il fluido dalla padella inferiore in un tubo conico in plastica da 50 millilitri. Utilizzare 1%BSA PBS per lavare la padella inferiore in un becher di scarto. Quindi utilizzare 1%BSA PBS per bagnare la parte superiore e inferiore di un setaccio di 75 micrometri.
Posizionare il setaccio sopra la padella inferiore posta sul ghiaccio. Applicare il campione su un bordo del setaccio con liquido che scorre facilmente. Risciacquare la parte superiore del setaccio con un minimo di 20 millilitri di 1%BSA PBS in un becher di scarto e lavare con cura il fondo del setaccio.
Per raccogliere i glomeruli rimasti sulla parte superiore del setaccio di 75 micrometri, sciacquare attraverso il setaccio capovolto con tutto l'HBSS necessario per raccogliere glomeruli in una piastra di Petri. Raccogliere i glomeruli setacciati in un tubo conico in plastica da 50 millilitri su ghiaccio. Dopo aver centrifugato a 1800 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius, rimuovere attentamente il supernatante usando una pipetta.
Sospendere di nuovo il pellet in 10 millilitri di HBSS freddo. Unire i campioni e ripetere la centrifugazione. Sospendere di nuovo i glomeruli in cinque millilitri di HBSS.
Per contare i glomeruli totali, posizionare una goccia di 10 microliter del campione su uno scivolo di vetro, contare al microscopio e multipli per 500 per ottenere la resa totale. Le strutture isolate dovrebbero essere costituite da quasi tutti i glomeruli senza strutture tubolari. Se i tubuli sono presenti e influiscono sull'applicazione downstream, possono essere rimossi applicando l'intero campione al setaccio di 90 micrometri e ripetendo il protocollo da quel punto in poi.
Il protocollo qui descritto è efficiente nell'isolare i glomeruli e la sospensione finale è densamente imballata con glomeruli con una purezza superiore al 95% e una contaminazione minima da segmenti tubolari o altri tipi di cellule. Questi glomeruli possono essere macchiati di macchie di ematossilina ed eosina per vedere la loro morfologia. Inoltre, mantengono la loro struttura in tutto il protocollo anche dopo l'elaborazione.
Mantengono podociti intatti e vitali, cellule mesangiali e cellule endoteliali. I glomeruli isolati sono stati esposti a lesioni chimiche per simulare la patologia in vivo. Specificamente solfato di protamina che interrompe la carica della barriera di filtrazione glomerulare.
Contrariamente ai glomeruli sani, i glomeruli trattati con solfato di protamina, hanno una riduzione prominente del nefro e un certo numero di nuclei positivi per WT1. Se visti con microscopia elettronica a trasmissione, glomeruli sani mostrano processi tipici del piede. Dopo il trattamento con solfato di protamina, i processi del piede sono allungati o effati indicando lesioni da podocita.
Per determinare la vitalità cellulare nei glomeruli isolati, la caspasi tre sciccata è stata osservata come marcatore di apoptosi. Non c'era nessuna caspasi sciccata tre a zero e un'ora dopo l'isolamento dei glomeruli. Alcune cellule hanno mostrato segni di apoptosi a due e quattro ore con un progressivo aumento nel tempo.
Il maggior numero di cellule apoptotiche è stato notato a 24 e 48 ore. Sulla base di questi risultati, si consiglia di utilizzare glomeruli isolati immediatamente dopo l'isolamento per la maggior parte degli esperimenti. Quando si esegue questa procedura, è importante lavorare in modo rapido ed efficiente.
Dal momento in cui il rene è isolato, i glomeruli iniziano a deteriorarsi. Più velocemente isoli i glomeruli, più tempo dovrai posare, isolamento, manipolazione. Dopo l'isolamento, i glomeruli isolati possono essere esposti ad agenti chimici o biologici per stimolare condizioni fisiologiche o patologiche.
E i campioni possono essere processi per l'isolamento di proteine o RNA, istologia o immunofluorescenza e microscopia elettronica. Dal suo sviluppo negli anni '50, questa tecnica ha aiutato i ricercatori nello studio della biologia glomerulare. Nel complesso, questo protocollo fornisce un metodo per valutare le caratteristiche morfologiche e cellulari dei glomeruli intatti in stati normali e mammasi.
Questo metodo può aiutare la nostra comprensione della malattia renale cronica proteinurica e aiutare nello sviluppo di terapie future.
