Name: assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease
Uploaded: 2018-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
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Questo lavoro è stato supportato dalla British Heart Foundation, Richard Bright VEGF Research Trust e il MRC.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo descrive un work-up completo del rene che deve essere eseguito in modelli murini di malattia glomerulare, consentendo una grande quantità di informazioni per quanto riguarda il rene e la funzione glomerulare devono essere ottenuti da un unico mouse. Consentono i passaggi critici di ogni metodo per dettagliate analisi funzionali, strutturali e meccanicistiche della funzione glomerulare, compresa la valutazione della permeabilità dei reni nel suo complesso (misure della creatinina del plasma e dell'uACR), la permeabilità della singoli dei glomeruli (glomerulare LpA / Vho), esame delle alterazioni strutturali (PAS, Trichrome blu ed EM), la localizzazione della proteina (se) e l'espressione genica glomerulare (RT-PCR e Western blotting). Questi metodi sono fondamentali per la valutazione completa della funzione glomerulare in modelli murini di malattia renale.
Nel valutare la permeabilità della GFB, molti studi hanno optato per utilizzare il tasso di escrezione dell'albumina dell'uACR o 24h convenzionale come una misura efficace17,18. Anche se queste tecniche permettono la valutazione della permeabilità GFB nel suo complesso, non consente per la valutazione individuale permeabilità glomerulare e variazione tra i glomeruli. Gli studi precedenti hanno trovato misura del glomerulare LpA / V,i , per essere una misura più sensibile delle modifiche al GFB permeabilità5,9. Infatti, nei risultati della rappresentativi ha dimostrati in questa carta, a 14 settimane post induzione di VEGF-A KO, VEGF-A KO X Jhonny-VEGF-A165b topi hanno un significativamente più bassa dell'uACR rispetto ai topi KO VEGF-A; Tuttavia, questo risultato non viene riflessa nella glomerulare LpA / Vho misure, dove VEGF-A165b non ha impedito significativamente aumenta in GFB permeabilità (Figura 1 e Figura 2)5. Ciò dimostra l'importanza di utilizzare saggi multipli per valutare sia la permeabilità del rene e la permeabilità dei glomeruli individuali. Inoltre, la glomerulare LpA / Vho oncometric l'analisi suggerisce che la permeabilità dei glomeruli individuali dal rene stesso può variare notevolmente, in particolare malattia modelli5,10, 19. una limitazione alla misura la glomerulare LpA / Vho è che essa può essere eseguita solo nel punto finale sperimentale; Pertanto, misure regolari dell'uACR vengono richiesto di fornire un'indicazione del punto finale sperimentale.
Oltre a valutare il fenotipo funzionale, il presente metodo incoraggia inoltre la valutazione del fenotipo strutturale ed ultrastrutturale. Questo può essere fatto utilizzando una selezione di macchie quali PAS, tricromica e le macchie d'argento; ogni valutare diversi aspetti della morfologia glomerulare. Nei modelli acuti della malattia glomerulare, che è spesso il caso in modelli murini, è può essere difficile da rilevare eventuali anomalie strutturali maggiori utilizzando queste macchie, a meno che non sei un patologo renale addestrato. Di conseguenza, realizzazione di EM è suggerito per valutare l'ultrastruttura di GFB, che permette la misurazione quantitativa di parametri quali il GBM, fenestrae endoteliale e numero le dimensioni caratteristiche del Podocita. Tali misure richiedono una formazione minima eseguire e permette al ricercatore di determinare la cella-tipi e strutture interessate in un modello di malattia. Nell'esempio indicato nei risultati rappresentativi, il mouse VEGF-A KO è stato trovato per essere un modello delicato della malattia glomerulare, così, non presenti anomalie strutturali maggiori erano presenti al momento di colorazione PAS. Tuttavia, specifici del Podocita VEGF-A KO ha indotto i cambiamenti il GBM, podociti e cellule endoteliali durante l'esame l' ultra-struttura glomerulare5. Purtroppo, la preparazione del rene per EM descritte nel presente metodo non attivare il rilevamento del glicocalice endoteliale, che è anche conosciuto per avere effetti significativi sulla permeabilità del GFB19. Al fine di misurare con precisione la profondità di glicocalice, rene dovrebbe essere irrorare-fisso con glutaraldeide 2,5% con 1% Alcian blu per l'etichettatura di glicocalice endoteliale, come descritto in Oltean et al.19.
Una volta che sono stati valutati il fenotipo funzionale e strutturale, il pattern di espressione/attivazione di diversi geni e vie quindi può essere valutato specificamente nei glomeruli. Previa valutazione ultra-strutturale potrebbe dare alcune informazioni per quanto riguarda la cella tipi/glomerulare strutture coinvolte, che indica se Podocita o endoteliali specifici geni/pathways dovrebbe essere esaminato. Ad esempio, nei risultati rappresentativi dai topi KO VEGF-A, è stata osservata una riduzione del numero di fenestrae endoteliale (Figura 3D); Pertanto, l'espressione della proteina glomerulare di un indicatore endothelial noto per essere coinvolti nella via del VEGF-A è stato esaminato; VEGFR-2 (Figura 4B)5. Oltre l'espressione delle proteine nei glomeruli, la loro localizzazione possa anche essere visualizzata con se. In uno studio di Zhang et al.20, specifiche del Podocita sovraespressione di GLUT1 è stata confermata in podociti di se co-localizza il GLUT1 aumentata con podocina.
Rispetto ai metodi alternativi presentati nella letteratura per valutare la funzione glomerulare, l'uso del metodo descritto in questo documento per valutare la funzione del rene in modelli murini di malattia glomerulare permette il fenotipo glomerulare completamente essere valutata da molteplici aspetti. Utilizzando questo metodo, il ricercatore è in grado di determinare il fenotipo renale del modello e valutare il meccanismo quanto a perchè il fenotipo si sviluppa. Queste informazioni vitali sul meccanismo della malattia sono necessarie quando si esaminano le potenziali vie terapeutiche in questi modelli. Questo metodo può essere applicato facilmente per le indagini future in funzione glomerulare nella valutazione di fenotipi di malattia e di terapeutica potenziale.
In conclusione, questo protocollo generico ed adattabile descrive un work-up completo del rene per modelli murini di malattia glomerulare, consentendo una grande quantità di informazioni per quanto riguarda il rene e la funzione glomerulare devono essere ottenuti da un unico mouse. I metodi consentono di dettagliate analisi funzionali, strutturali e meccanicistiche della funzione glomerulare, che può essere applicato a tutti i modelli murini di malattia glomerulare.

L'utilizzo di modelli murini per imitare la malattia di rene umano sta diventando sempre più comune. Tali modelli murini includono spontanea come spontaneamente ipertesi (SHR) ratti1, streptozotocin (STZ)-indotta in ratti diabetici e topi2, e il db/db tipo II topi diabetici3, modelli geneticamente come primaria specifiche del Podocita sclerosi glomerulare segmentale focale (FSGS) modelli4, specifici del Podocita endoteliale fattore di crescita vascolare (VEGF-A) knock-out (KO VEGF-A) modello5, e la sindrome di Alport modelli6e acquisito modelli come la nefrectomia di 5/67 e l'ostruzione ureteral unilaterale (UUO) modello8. Al fine di valutare i diversi aspetti della funzione glomerulare in questi modelli, sono disponibili diverse tecniche. Lo scopo di questa carta di metodo è quello di dimostrare un work-up completo che deve essere eseguito in modelli murini di malattia renale al fine di valutare appieno la funzione glomerulare.
La spiegazione razionale dietro l'uso di questo metodo è che esso consente il fenotipo glomerulare completamente essere valutata da molteplici aspetti. Questo include la valutazione della permeabilità glomerulare, sia di proteine e di acqua, le anomalie strutturali glomerulari e cambiamenti nell'espressione/impionbatura di mRNA e proteine essenziali per la normale funzione glomerulare. Utilizzando questo metodo, il ricercatore è in grado di determinare il fenotipo renale del modello e valutare il meccanismo quanto a perchè il fenotipo si sviluppa. Si tratta di informazioni vitali sul meccanismo della malattia, che è necessaria quando si esaminano le potenziali vie terapeutiche in questi modelli.
Nella letteratura, è un evento comune per essere presentato con un modello murino di malattia glomerulare dove il fenotipo è determinato da un aumento del livello di albumina nelle urine. Tuttavia, ci è prova per suggerire che un unico metodo per determinare la funzione glomerulare non è sempre efficace; misura il tasso di escrezione urinaria dell'albumina o il rapporto di creatinina urinaria dell'albumina (dell'uACR) fornisce solo informazioni sulla funzione renale totale e non dei singoli glomeruli. Precedenti studi hanno dimostrato che la permeabilità può variare in glomeruli differenti dalla stessa rene5,9,10. Inoltre, la valutazione della permeabilità dei glomeruli individuali è un modo più sensibile di valutazione della funzione glomerulare; la tecnica di misurazione della permeabilità glomerulare individuali (LpA / Vio) ha dimostrato di essere più sensibili ai cambiamenti nella funzione glomerulare rispetto alla valutazione dell'uACR9. Questo test è utile in modelli murini che sono resistenti alla proteinuria, come quelle su una priorità bassa c57BL/611. Il vantaggio della carta metodo attuale è che esamina sia la totale permeabilità renale all'albumina, nonché i singole glomerulare permeabilità all'acqua.
Esame delle anomalie strutturali glomerulari è spesso valutata tramite una batteria di macchie quali acido periodico Schiff (PAS), tricromica e le macchie d'argento. Questi strumenti consentono un patologo renale addestrato per valutare il livello di malattia renale tramite un metodo segnante. Anche se tutti i buoni metodi, le modifiche alla macro-struttura glomerulare non sono sempre rispettati nel danno renale acuto modelli12. Questo metodo propone che oltre a svolgere le tecniche di istologia renale sopra descritte, l'ultra-struttura glomerulare dovrebbe essere valutata anche tramite microscopia elettronica (EM). Un glomerulo macchiato può guardare relativamente normale microscopio ottico regolari; Tuttavia, al momento della valutazione con EM, piccoli cambiamenti nella membrana basale glomerulare (GBM) larghezza, Podocita piede processo effacement, fenestrazioni endoteliali e la copertura dello spazio sub-Podocita è analizzato. Pertanto, è essenziale che l'ultra-struttura glomerulare e la microstruttura è valutato per determinare il meccanismo di disfunzione glomerulare.
Oltre a valutare le anomalie strutturali glomerulari, cambiamenti in mRNA e l'espressione della proteina e splicing, come pure l'attivazione della proteina (ad es., fosforilazione), dovrebbero essere esaminati per più ulteriormente per delucidare i meccanismi della malattia glomerulare. Quando guardando la malattia glomerulare, o, per esempio, quando KO/over-expressing un gene specificamente in cellule glomerulari, ad esempio il Podocita specifiche VEGF-A KO del mouse5, è importante che i cambiamenti di mRNA e proteina sono esaminati solo all'interno del cellule glomerulari e non l'intero rene. Questo protocollo descrive un metodo in cui i glomeruli sono isolati dalla corteccia del rene del mouse, e quindi il proteina/RNA sono isolati. Questo permette l'analisi specifica della disregolazione della proteina/mRNA nei glomeruli di modello della malattia.
Questo protocollo descrive un work-up completo del rene che deve essere eseguito in modelli murini di malattia glomerulare, consentendo una grande quantità di informazioni per quanto riguarda il rene e la funzione glomerulare devono essere ottenuti da un unico mouse. I metodi consentono di dettagliate analisi funzionali, strutturali e meccanicistiche della funzione glomerulare, che può essere applicato a tutti i modelli murini di malattia glomerulare.

<table><tbody><tr><td>Metabolic Cages</td><td>Harvard Apparatus</td><td>52-6731</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffered saline (10x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5912-1L</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Albumin ELISA Quantitation Set</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>E90-134</td><td></td></tr><tr><td>TMB ELISA Substrate solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>Sulphuric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>SPECTRstar nano</td><td>BMG Labtech</td><td>SPECTRstar nano or equivalent</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater stabilisation solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>4-15% precast protein gel</td><td>BIORAD</td><td>4568084</td><td></td></tr><tr><td>4x Laaemmli Sample buffer</td><td>BIORAD</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot cell</td><td>BIORAD</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris running buffer</td><td>BIORAD</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Creatinine Companion</td><td>Exocell</td><td>1012 Strip Plate</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Cacodylate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate Buffered Saline</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>D(+)Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Blood Collection tubes</td><td>BD</td><td>367835</td><td></td></tr><tr><td>23-25G Needle</td><td>BD</td><td>PMC0735</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Glass Vial</td><td>Thomas Scientific</td><td>0914X10</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 10 ml Polypropylene Tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10110101</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml Tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10681894</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Tissue Molds</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-363-553</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Surgical Disection Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-005-204</td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillary Tubes</td><td>Harvard Apparatus</td><td>EC1 64-0770</td><td></td></tr><tr><td>Glomerular Permeability Rig</td><td>Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available</td><td>Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Sieves</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-59984</td><td></td></tr><tr><td>Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>395B-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3136</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>MerckMillipore</td><td>108298</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep Slides</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0425-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8030</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetroxide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Aradite Resin</td><td>Agar Scientific</td><td>CY212</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1260A</td><td></td></tr><tr><td>Lead Citrate</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1210</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>e.g. 957000H</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic Pen</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Nephrin (1243-1256) Antibody</td><td>Acris</td><td>BP5030</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Podocin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0372-200UL</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Secondary Antibody</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32732</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>NP40 Cell Lysis Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FNN0021</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78437X4</td><td></td></tr><tr><td>10x Transfer Buffer</td><td>BIORAD</td><td>1610734</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Membrane</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC2002</td><td></td></tr><tr><td>HRP-Conjugated Secondary Antibodies</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td></td></tr><tr><td>ECF Substrate for Western Blotting</td><td>Fisher</td><td>10713387</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Reverse Transcriptase</td><td>New England Biolabs</td><td>M053S</td><td></td></tr><tr><td>Oligo dT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18418012</td><td></td></tr><tr><td>Random Primers</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>48190011</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18427088</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease Inhibitor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>DEPC Water</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Light Miscroscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J Analysis Software</td><td>Image J</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Thermocycler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM Microscope</td><td>Britannica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease

L'utilizzo di modelli murini per imitare la malattia di rene umano sta diventando sempre più comune. La nostra ricerca è concentrata sulla valutazione della funzione glomerulare in nefropatia diabetica e specifiche del Podocita VEGF-A topi knock-out; di conseguenza, questo protocollo descrive il rene completo work-up utilizzato nel nostro laboratorio per valutare questi modelli murini di malattia glomerulare, consentendo una grande quantità di informazioni per quanto riguarda il rene e la funzione glomerulare devono essere ottenuti da un unico mouse. Rispetto ai metodi alternativi presentati nella letteratura per valutare la funzione glomerulare, l'utilizzo del metodo descritto in questo documento consente il fenotipo glomerulare completamente essere valutata da molteplici aspetti. Utilizzando questo metodo, il ricercatore può determinare il fenotipo renale del modello e valutare il meccanismo quanto a perchè il fenotipo si sviluppa. Queste informazioni vitali sul meccanismo della malattia sono necessarie quando si esaminano le potenziali vie terapeutiche in questi modelli. I metodi consentono dettagliata valutazione funzionale della barriera di filtrazione glomerulare attraverso misurazioni del rapporto creatinina urinaria dell'albumina e permeabilità glomerulare individuali, così come esame sia strutturale che ultra-strutturale usando la macchia dello Schiff dell'acido periodico e la microscopia. Inoltre, analisi della dysregulated geni a livello di mRNA e proteina consente analisi meccanicistica della funzione glomerulare. Questo protocollo descrive i metodi generici ma adattabili che possono essere applicati a tutti i modelli murini di malattia glomerulare.

Urina è stata raccolta utilizzando gabbie metaboliche da wild type (WT), inducibile Podocita specifiche VEGF-A knock out (VEGF-A KO) e VEGF-A KO X Jhonny-VEGF165b topi (VEGF-A KO topi che over-esprimono l'isoforma b umano VEGF-A165in podociti in un maniera costitutiva). Su misura del rapporto albumina urinaria della creatinina alle settimane 0, 4, 10 e 14 dopo induzione di doxiciclina di VEGF-A KO, VEGF-A KO topi sviluppato progressivo albuminuria da 10 settimane rispetto al WT littermate controlli. I valori assoluti può essere visto in Figura 2Ae la normalizzazione alla linea di base di ogni valori del mouse nella Figura 2B. Tuttavia, albuminuria in non osservato nei topi di b165VEGF-A X Jhonny-VEGF-A (Figura 2), che indica che il VEGF-A165b è protettiva nel modello dell'albuminuria5.
La glomerulare LpAVmi è stata misurata in singoli glomeruli setacciati da WT, VEGF-A KO e VEGF-A X Jhonny-VEGF-A165b reni. Un esempio di come un glomerulo viene catturato e la contrazione osservata quando perifused con 8% BSA è mostrato in Figura 3A. Questo restringimento viene quindi utilizzato per determinare la glomerulare LpA / Vho per ogni glomerulo (Figura 3B). Topi KO per il VEGF-A ha avuto un significativo aumento glomerulare LpA / Vho a 14 settimane post induzione di VEGF-KO rispetto ai glomeruli controllo WT. Anche se più bassi in VEGF-A X Jhonny-VEGF-A165b topi, l'aumentata glomerulare LpA / V non è stato impedito di sovra-espressione di VEGF-A165b a 14 settimane5.
PAS di colorazione di sezioni di corteccia del rene 14 settimane dopo induzione di VEGF-A KO non ha rivelato alcune anomalie strutturali glomerulari nei VEGF-A KO o VEGF-A X Jhonny-VEGF-A165b topi (Figura 4A). Tuttavia, sull'analisi della ultra-struttura glomerulare tramite EM, VEGF-A KO topi avevano sviluppato una maggiore larghezza GBM, riduzione del numero di fenestrae endoteliale, è diminuito di copertura SPS e maggiore Podocita medio taglio (Figura 4-4F ). Il piede Podocita medio processo di larghezza e il numero di strisce è rimasto invariato (Figura 3B e 3G). Sovra-espressione di VEGF-A165b nei topi KO VEGF-A ha impedito i cambiamenti per il GBM e taglio (Figura 4 e 4F). Tuttavia, il VEGF-A165b ha avuto alcun effetto sul numero di fenestrae alterata e SPS copertura (Figura 4 e 4E)5.
RT-PCR effettuata su RNA Estratto da glomeruli setacciati ha rivelato che l'umano VEGF-A165b mRNA è presente solo nei topi di b165VEGF-A KO X Jhonny-VEGF-A (Figura 5A). Durante l'estrazione della proteina da glomeruli setacciati e valutazione dei livelli di proteine tramite Western blotting, l'espressione della proteina glomerulare di VEGFR-2 è stata trovata per essere diminuita in topi KO VEGF-A, che è stata impedita da sovra-espressione di VEGF-A165b ( Figura 5B e 5 C)5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig1.jpg"> Figura 1. Impostare schematica dell'impianto di perforazione permeabilità glomerulare (LpA). (A) il glomerulo è catturato su (B) la micropipetta all'interno di un supporto mediante aspirazione, che è fissato su un supporto per la stabilità. (C) rettangolare 2mpx. Obiettivo 4x (D) di un microscopio con una videocamera. (E) soluzione di BSA 1% riscaldato a 37 ° C. (F) soluzione all'8% BSA riscaldato a 37 ° C. (G) remoto toccare cuscinetto perifusate-contenente due linee, che consente lo scambio rapido perifusate. (H) itinerario di perifusate verso la 2mpx, che poi si bagna il glomerulo. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57764/57764fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig2.jpg"> Figura 2. Rapporto della creatinina urinaria dell'albumina. (A) i valori dell'uACR alle settimane 0, 4, 10 e 14 dopo induzione di VEGF-A KO in topi165b WT, VEGF-A KO e VEGF-A X Jhonny-VEGF-A. (B) gli stessi valori dell'uACR normalizzato al valore basale (settimana 0) di ogni singoli mouse. Dell'uACR aumentato significativamente in topi KO per VEGF-A alle settimane 10 e 14 confrontati ai comandi di littermate WT, che è stata impedita nei topi di b165VEGF-A X Jhonny-VEGF-A (* p < 0,05; ANOVA a due vie, correzione per il confronto tra le coppie; n = 4-12 topi al punto di tempo; barre di errore: errore standard della media [SEM]). Questa figura è stata modificata da Stevens et al.5. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57764/57764fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig3.jpg"> Figura 3. Misura della permeabilità glomerulare. (A) il glomerulo è catturato la micropipetta tramite aspirazione; il perifusate è passato da BSA 1% (Ai) a 8% BSA (Aii), e restringimento glomerulare è osservato. (B) le misurazioni effettuate prima e dopo il passaggio di BSA 8% vengono utilizzate per determinare la glomerulare LpA / Vho. (C) VEGF-A KO topi sviluppano un aumento glomerulare LpA / Vho a 14 settimane post induzione di VEGF-A KO confrontati ai comandi WT. Questo non è stato impedito significativamente nei topi di b165VEGF-A X Jhonny-VEGF-A (* p < 0,05; One-way ANOVA, correzione di Bonferroni per il confronto tra le coppie; n = 4-9 topi, 15-30 glomeruli; barre di errore: SEM). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57764/57764fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig4.jpg"> Figura 4. Analisi strutturale glomerulare. (A) PAS macchiatura della corteccia del rene non ha indicato tutte le anomalie strutturali nei glomeruli da topi WT, VEGF-A KO e VEGF-A X Jhonny-VEGF-A165b (Ai - iii). EM ha rivelato le anomalie ultrastrutturali nei glomeruli VEGF-A KO (Aiv - vi). (B) la media FPW non è cambiato tra gruppi. (C) The GBM aumentato nei glomeruli VEGF-A KO, che è stato impedito di VEGF-A165b. (D) il numero di fenestrae è stato diminuito in glomeruli VEGF-A KO, che è rimasto inalterati dalla copertura di VEGF-A165b. (E) la SPS è stato diminuito in glomeruli VEGF-A KO, che inoltre è rimasto invariati da VEGF-A165b. (F) la media a taglio larghezza è stata aumentata in glomeruli VEGF-A KO, che è stato impedito di VEGF-A165b. (G) il numero di fessura è rimasto invariato fra i tre gruppi (* p < 0,05; One-way ANOVA, correzione di Bonferroni per il confronto tra le coppie; n = 3 topi, 9 glomeruli; barre di errore: SEM). Questa figura è stata modificata da Stevens et al.5. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57764/57764fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig5.jpg"> Figura 5. espressione di mRNA e proteina di marcatori. (A) RT-PCR ha mostrato che umana espressione di mRNA di VEGF-A165b solo era evidente nei glomeruli setacciati dai topi di VEGF-A KO X Jhonny-VEGF-A165b. (B) Western blotting hanno indicato che l'espressione della proteina VEGFR-2 era down-regolata in glomeruli VEGF-A KO, che è stata impedita in glomeruli di b165VEGF-A KO X Jhonny-VEGF-A (* p < 0,05; One-way ANOVA, correzione di Bonferroni per il confronto tra le coppie; n = 3 - 6 topi; barre di errore: SEM). Questa figura è stata modificata da Stevens et al.5. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57764/57764fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Questo protocollo descrive un work-up completo del rene che deve essere eseguito in modelli murini di malattia glomerulare. I metodi consentono di dettagliate analisi funzionali, strutturali e meccanicistiche della funzione glomerulare, che può essere applicato a tutti i modelli murini di malattia glomerulare.

Valutazione della funzione del rene in modelli murini di malattia glomerulare

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

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17.4K Views.  University of Exeter. Questo protocollo descrive un work-up completo del rene che deve essere eseguito in modelli murini di malattia glomerulare. I metodi consentono di dettagliate analisi funzionali, strutturali e meccanicistiche della funzione glomerulare, che può essere applicato a tutti i modelli murini di malattia glomerulare.

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Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often unreported mortality rates that may confound analyses. Bilateral renal pedicle clamping is commonly used to induce IR-AKI, but differences between effective clamp pressures and/or renal responses to ischemia between kidneys often lead to more variable results. In addition, shorter clamp times are known to induce more variable tubular injury, and while mice undergoing bilateral injury with longer clamp times develop more consistent tubular injury, they often die within the first 3 days after injury due to severe renal insufficiency. To improve post-injury survival and obtain more consistent and predictable results, we have developed two models of unilateral ischemia-reperfusion injury followed by contralateral nephrectomy. Both surgeries are performed using a dorsal approach, reducing surgical stress resulting from ventral laparotomy, commonly used for mouse IR-AKI surgeries. For induction of moderate injury BALB/c mice undergo unilateral clamping of the renal pedicle for 26 min and also undergo simultaneous contralateral nephrectomy. Using this approach, 50-60% of mice develop moderate AKI 24 hr after injury but 90-100% of mice survive. To induce more severe AKI, BALB/c mice undergo renal pedicle clamping for 30 min followed by contralateral nephrectomy 8 days after injury. This allows functional assessment of renal recovery after injury with 90-100% survival. Early post-injury tubular damage as well as post injury fibrosis are highly consistent using this model.

We describe models of moderate and severe ischemia-reperfusion-induced kidney injury in which the mice undergo unilateral renal pedicle clamping followed by simultaneous or delayed contralateral nephrectomy, respectively. These models consistently give rise to renal dysfunction and post-injury fibrosis, but injury severity and survival are dependent on mouse background, age and surgical equipment.

Ischemia-riperfusione Modello di danno renale acuta e post Infortunio fibrosi nei topi

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

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Renal Ischaemia Reperfusion Injury: A Mouse Model of Injury and Regeneration

Renal ischaemia reperfusion injury (IRI) is a common cause of acute kidney injury (AKI) in patients and occlusion of renal blood flow is unavoidable during renal transplantation. Experimental models that accurately and reproducibly recapitulate renal IRI are crucial in dissecting the pathophysiology of AKI and the development of novel therapeutic agents. Presented here is a mouse model of renal IRI that results in reproducible AKI. This is achieved by a midline laparotomy approach for the surgery with one incision allowing both a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia of the left kidney. By careful monitoring of the clamp position and body temperature during the period of ischaemia this model achieves reproducible functional and structural injury. Mice sacrificed 24 hr&#160;following surgery demonstrate loss of renal function with elevation of the serum or plasma creatinine level as well as structural kidney damage with acute tubular necrosis evident. Renal function improves and the acute tissue injury resolves during the course of 7 days following renal IRI such that this model may be used to study renal regeneration. This model of renal IRI has been utilized to study the molecular and cellular pathophysiology of AKI as well as analysis of the subsequent renal regeneration.

The mouse model of renal ischaemia reperfusion injury described here comprises of a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia that results in acute kidney injury. This model uses a midline laparotomy approach with all steps performed via one incision.

Renale ischemia riperfusione: un modello murino di infortuni e rigenerazione

Renal ischaemia reperfusion injury (IRI) is a common cause of acute kidney injury (AKI) in patients and occlusion of renal blood flow is unavoidable ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

Mouse trapianto renale: Modelli di Allograft Rifiuto

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and time-consuming. In addition, serial blood or urine samples are required, with the associated stress for the experimental animals. A recent technique significantly reduces the investment in time and resources, minimizing the invasiveness and the animal stress, but being equally valid as the traditional approaches. The method measures transcutaneously renal function. Using an optical device and the exogenous renal marker fluorescein isothiocyanate (FITC)-sinistrin, this technique is capable of measuring the elimination kinetics of the marker through the skin. With neither blood nor urine samples nor the associated laboratory assays needed, the results of the transcutaneous measurement are almost instantaneously available. The method has been already validated in different species and successfully applied in several models of renal pathology. Moreover, due to its minimally invasive characteristics, it is suitable for sequential measurements within the same animal. Here is provided a detailed protocol to carry out the transcutaneous assessment of renal function in rodents.

Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

La valutazione transcutanea della funzione renale nei roditori Conscious

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Un metodo ad alta velocità per la misura della velocità di filtrazione glomerulare in topi coscienti

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Biologia

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of acute kidney injury and chronic kidney disease. The measurement system consists of a miniaturized fluorescence detector that is directly attached to the skin on the back of conscious, freely moving animals, and measures the excretion kinetics of the exogenous GFR tracer, fluorescein-isothiocyanate (FITC) conjugated sinistrin (an inulin analog). This system has been described in detail in rats. However, because of their smaller size, measurement of transcutaneous GFR in mice presents additional technical challenges. In this paper we therefore provide the first detailed practical guide to the use of transdermal GFR monitors in mice based on the combined experience of three different investigators who have been performing this assay in mice over a number of years.

Here we describe a protocol to measure glomerular filtration rate (GFR) in conscious, freely moving mice using a transdermal GFR monitor.

Transdermico misurazione del tasso di filtrazione glomerulare in topi

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes

Applying novel microscopy methods to suitable animal disease models to explore the dynamic physiology of the kidney remains a challenge. Rats with surface glomeruli provide a unique opportunity to investigate physiological and pathophysiological processes using intravital 2-photon microscopy. Quantification of glomerular capillary blood flow and vasoconstriction and dilatation in response to drugs, permeability, and inflammation are just some of the processes that can be studied. In addition, transgenic rats, i.e., podocytes labeled with fluorescent dyes and other molecular biomarker approaches, provide increased resolution to directly monitor and quantify protein-protein interactions and the effects of specific molecular alterations.
In mice, which lack surface glomeruli after four weeks of age, unilateral ureteral obstruction (UUO) for several weeks has been used to induce surface glomeruli. As this induction model does not allow for baseline studies, we quantified the effects of UUO on glomerular processes in the UUO model in Munich Wistar Fr&#246;mter (MWF) rats, which have surface glomeruli under physiologic conditions. The UUO model for five weeks or more induced significant alterations to gross renal morphology, the peritubular and glomerular microvasculature, as well as the structure and function of tubular epithelia. Glomerular and peritubular red blood cell (RBC) flow decreased significantly (p &#60; 0.01), probably due to the significant increase in the adherence of white blood cells (WBCs) within glomerular and peritubular capillaries. The glomerular sieving coefficient of albumin increased from 0.015 &#177; 0.002 in untreated MWFs to 0.045 &#177; 0.05 in 5-week-old UUO MWF rats. Twelve weeks of UUO resulted in further increases in surface glomerular density and glomerular sieving coefficient (GSC) for albumin. Fluorescent albumin filtered across the glomeruli was not reabsorbed by the proximal tubules. These data suggest that using UUO to induce surface glomeruli limits the ability to study and interpret normal glomerular processes and disease alterations.

Here, we present a protocol using 2-photon microscopy in Munich Wistar Fromter rats with surface glomeruli to quantifythe effects of prolonged ureteral obstruction on glomerular dynamics and function.

Utilizzo della microscopia a 2 fotoni per quantificare gli effetti dell'ostruzione ureterale unilaterale cronica sui processi glomerulari

Applying novel microscopy methods to suitable animal disease models to explore the dynamic physiology of the kidney remains a challenge. Rats with surface ...

A Murine Model of Hemodialysis Access-Related Hand Dysfunction

Chronic kidney disease is a major public health problem, and the prevalence of end-stage renal disease (ESRD) requiring chronic renal replacement therapies such as hemodialysis continues to increase. Autogenous arteriovenous fistula (AVF) placement remains a primary vascular access option for ESRD patients. Unfortunately, approximately half of the hemodialysis patients experience dialysis access-related hand dysfunction (ARHD), ranging from subtle paresthesia to digital gangrene. Notably, the underlying biologic drivers responsible for ARHD are poorly understood, and no adequate animal model exists to elucidate the mechanisms and/or develop novel therapeutics for the prevention/treatment of ARHD. Herein, we describe a new mouse model in which an AVF is created between the left common iliac artery and vein, thereby facilitating the assessment of limb pathophysiology. The microsurgery includes vessel isolation, longitudinal venotomy, creation of arteriovenous anastomosis, and venous reconstruction. Sham surgeries include all the critical steps except for AVF creation. Iliac AVF placement results in clinically relevant alterations in central hemodynamics, peripheral ischemia, and impairments in hindlimb neuromotor performance. This novel preclinical AVF model provides a useful platform that recapitulates common neuromotor perturbations reported by hemodialysis patients, allowing researchers to investigate the mechanisms of ARHD pathophysiology and test potential therapeutics.

This protocol details the surgical steps of murine common iliac arteriovenous fistula creation. We developed this model to study hemodialysis access-related limb pathophysiology.

Un modello murino di disfunzione della mano correlata all'accesso all'emodialisi

Chronic kidney disease is a major public health problem, and the prevalence of end-stage renal disease (ESRD) requiring chronic renal replacement ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of pathways involved in parietal epithelial cell activation could therefore be a tool to attenuate the progression of glomerular diseases. This article describes a method to culture and analyze parietal epithelial cell outgrowth of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. After dissecting isolated mouse kidneys, the tissue is minced, and glomeruli are isolated by sieving. Encapsulated glomeruli are collected, and single glomeruli are cultured for 6 days to obtain glomerular outgrowth of parietal epithelial cells. During this period, parietal epithelial cell proliferation and migration can be analyzed by determining the cell number or the surface area of outgrowing cells. This assay can therefore be used as a tool to study the effects of an altered gene expression in transgenic- or knockout-mice or the effects of culture conditions on parietal epithelial cell growth characteristics and signaling. Using this method, important pathways involved in the process of parietal epithelial cell activation and consequently in glomerulosclerosis can be studied.

This article describes a method for culturing and analyzing glomerular parietal epithelial cell outgrowths of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. This method can be used to study pathways involved in parietal epithelial cell proliferation and migration.

Escrescenza glomerare come un'analisi di Ex Vivo per analizzare i percorsi coinvolti nell'attivazione delle cellule epiteliali Parietali

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...

Marcatura fluorescente di glomeruli in reni di topo chiariti per microscopia

An Efficient and Fast Method for Labeling and Analyzing Mouse Glomeruli

The glomeruli are fundamental units in the kidney; hence, studying the glomeruli is pivotal for understanding renal function and pathology. Biological imaging provides intuitive information; thus, it is of great significance to label and observe the glomeruli. However, the glomeruli observation methods currently in use require complicated operations, and the results may lose label details or three-dimensional (3D) information. The clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis (CUBIC) tissue clearing technology has been widely used in renal research, allowing for more accurate detection and deeper detection depth. We found that mouse glomeruli can be rapidly and effectively labeled by tail vein injection of medium molecular weight FITC-Dextran followed by the CUBIC clearing method. The cleared mouse kidney could be scanned by a light-sheet microscope (or a confocal microscope when sliced) to obtain three-dimensional image stacks of all the glomeruli in the entire kidney. Processed with appropriate software, the glomeruli signals could be easily digitized and further analyzed to measure the number, volume, and frequency of the glomeruli.

Autore in primo piano: Aiutare la ricerca in biologia renale marcando i glomeruli nei tessuti chiariti 

This study presents an easy-to-use, complete, and simple set of methods to label and analyze glomeruli from CUBIC-cleared mouse kidneys. Data such as glomerulus number and volume can be obtained easily and reliably using fluorescein isothiocyanate (FITC)-Dextran, light sheet fluorescence microscopy (LSFM), or common confocal microscopy and software such as Imaris.

Un metodo efficiente e veloce per l'etichettatura e l'analisi dei glomeruli di topo

The glomeruli are fundamental units in the kidney; hence, studying the glomeruli is pivotal for understanding renal function and pathology. Biological ...